CN108060110B - 一种节杆菌菌株及其应用 - Google Patents

一种节杆菌菌株及其应用 Download PDF

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    • A01N63/10—Animals; Substances produced thereby or obtained therefrom

Abstract

本发明公开了一种节杆菌菌株及其应用。该菌株是从华南农业大学昆虫生态实验室饲养的橘小实蝇蛹中分离得到，该菌株保藏编号为GDMCC No.60314。该菌株的发酵液具有较好的抑制稻瘟病菌、香蕉枯萎病菌和荔枝霜疫霉病菌菌丝生长的能力，在黄豆粉培养基培养7天后，所得发酵液滤液对三种病原菌的抑制率分别达到94.3％、85.25％和61.27％。抑菌作用还表现有剂量效应，即随着节杆菌发酵液滤液剂量的升高，抑菌效果也随之增强。因此该节杆菌发酵液滤液可作为抗植物病原真菌类药物进一步开发利用，有很大的应用前景。

Description

一种节杆菌菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种可用于抗植物病原菌的节杆菌菌株及其应用。
背景技术
昆虫作为已知种类最为丰富的一类动物，其分布极为广泛，足迹几乎遍布地球上的各个角落。在漫长的过程中，昆虫自身含有许多独特的共生微生物，并且在昆虫生命周期中扮演着重要角色。随着对昆虫共生放线菌的研究，人们发现许多放线菌产生的具有良好活性的抗菌化合物被昆虫宿主用于抵抗病原菌的侵害。因此，通过研究昆虫及其共生放线菌，可能对新的抗生素研究及解决抗药性病原菌的问题起到巨大的推动作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的具有抗菌活性、特别是对植物致病菌具有极强抑制活性的节杆菌菌株及其应用。
本发明的第一目的是提供一种新的节杆菌即节杆菌(Arthrobacter sp.)DF1，该菌是从华南农业大学昆虫生态实验室饲养的桔小实蝇蛹中分离到了一种新菌株，该菌株属于放线菌株，该菌株已保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No：60314。
本发明的节杆菌(Arthrobacter sp.)DF1的菌学特性如下：
形态特征：该菌在营养琼脂培养基上培养24h后，菌落直径为0.6～1.2mm，菌落圆形，不透明，边缘较为整齐，表面湿润，有光泽，中间隆起，易挑起。菌落呈黄色，幼龄菌落淡黄色，随着菌龄增长，菌落逐渐变为蛋黄色。镜检该菌株有明显的杆菌—球菌生长循环。
分子生物学特性：
16S rDNA序列分析：提取菌DF-1基因组DNA作为模板，以细菌16S rDNA通用引物27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和1492R：TACGGYTACCTTGTTACGACTT对DNA模板进行PCR扩增，PCR产物切胶回收后，用Sanger测序法进行序列测定。测序得到16S rDNA序列如SEQ IDNO.1所示，长度为1398bp。
将所得序列在采用NCBI数据库中比对并下载同源序列，然后使用BLAST、MEGA等软件建立系统发育树(图1)。将该序列进行Blast比较，表明其与节杆菌属(Arthrobactersp.)菌株的同源性最高，相似性大于99％，系统进化树分析表明菌DF1与Arthrobacternicotianae Dc-06最近，如图1所示。结合菌落形态学特征和系统发育树分析，明确菌株DF1为节杆菌(Arthrobacter sp.)，将其命名为节杆菌(Arthrobacter sp.)DF1。
节杆菌(Arthrobacter sp.)DF1菌体及其胞外代谢产物均属于本发明的保护范围。
所述的节杆菌(Arthrobacter sp.)DF1的发酵制品也属于本发明的保护范围。所述发酵制品可为发酵产品本身、经稀释过的发酵产品或经纯化的发酵产品，如实施例中的发酵液或发酵液的过滤液等；所述发酵制品可采用颗粒、粉末、片剂等固体外形或是液体、糊状、胶状等流体形式。
所述的节杆菌(Arthrobacter sp.)DF1的发酵制品为节杆菌(Arthrobacter sp.)DF1的发酵液或发酵液的过滤液。
所述的发酵液的制备方法为：
将节杆菌(Arthrobacter sp.)DF1接种到黄豆粉液体培养基或营养肉汤液体培养基中培养，得到发酵液。
优选，所述培养温度是25-29℃，更优选的为28℃。
所述的发酵液的过滤液的制备方法为：
将节杆菌(Arthrobacter sp.)DF1接种到黄豆粉液体培养基或营养肉汤液体培养基中培养，得到发酵液；然后将其离心，取上清液在无菌条件下经0.22μm滤膜过滤，得到发酵液的过滤液。
本发明还提供一种菌剂，该菌剂以节杆菌(Arthrobacter sp.)DF1和/或节杆菌(Arthrobacter sp.)DF1的发酵制品作为活性成分；还可以包括菌剂可接受的辅料。
所述的菌剂的制备方法，具体包括如下步骤：
将所述的节杆菌(Arthrobacter sp.)DF1和/或节杆菌(Arthrobacter sp.)DF1的发酵制品作为活性成分，加入菌剂可接受的辅料，得到所述的菌剂。
所述的节杆菌(Arthrobacter sp.)DF1、所述的节杆菌(Arthrobacter sp.)DF1的发酵制品在抑制植物病原菌中的应用也属于本发明的保护范围。
所述的应用是制备用于防治植物病原菌病害的药物，如生物农药。
所述的植物病原菌为稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)、香蕉枯萎病菌(Fusariumoxysporum)和/或荔枝霜疫霉菌(Peronophthora litchii)。
保藏说明：
本发明的节杆菌(Arthrobacter sp.DF1)于2018年1月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，保藏编号：GDMCC No.60314。
本实验室从橘小实蝇蛹中分离筛选获得一株隶属于放线菌门的节杆菌(Arthrobacter sp.)DF1，试验表明其发酵液滤液对植物病原真菌稻瘟菌、香蕉枯萎菌和荔枝霜疫霉菌的菌丝生长具有较好的抑制活性，因此，研究该节杆菌发酵产物成分对新时期真菌杀菌剂的研发和使用具有理论和实际价值。
附图说明
图1是节杆菌DF1的系统发育树。
图2是节杆菌DF1发酵液对稻瘟病菌的抑制作用，左上：对照；左下：3：7；右上：1：9；右下：2：8。
图3是节杆菌DF1发酵液对香蕉枯萎病菌的抑制作用，左上：2：8；左下：1：9；右上：3：7；右下：对照。
图4是节杆菌DF1发酵液对荔枝霜疫霉菌的抑制作用，左上：2：8；左下：1：9；右上：3：7；右下：对照。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂。
实施例1：菌DF1的分离和鉴定
1.菌DF1的分离
取华南农业大学昆虫生态实验室人工饲养的橘小实蝇种群刚化2d的蛹，充分研磨后，涂在4％NaCl的胰蛋白胨-黄豆胨琼脂培养基上培养，分离得到一株黄色菌株(后发现其在营养琼脂培养基(NA)上也能生长良好)。将得到的菌株在黄豆粉液体培养基中进行液体发酵。利用发酵滤液做抑菌试验，发现该菌株对多种植物病原真菌具有较强的菌丝生长抑制活性。将该菌编号为菌DF1。
所述的4％NaCl的胰蛋白胨-黄豆胨琼脂培养基：每升含胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，氯化钠40g，琼脂15g，蒸馏水补足至1L，PH7.0。培养基在温度121℃，压力0.1MPa下灭菌20min。
所述营养琼脂培养基(NA)：每升含蛋白胨10.0g，牛肉膏粉3.0g，氯化钠5.0g，琼脂15g，PH值7.4±0.2，蒸馏水补足至1L。培养基在温度121℃，压力0.1MPa下灭菌20min。
所述的黄豆粉液体培养基：每升含可溶性淀粉15g，黄豆粉10g，硫酸铵2.0g，氯化钠4.0g，酵母浸出粉2.0g，蒸馏水补足至1L，PH 7.0。培养基在温度121℃，压力0.1MPa下灭菌20min。
2.菌DF1的鉴定
形态特征：菌DF-1在营养琼脂培养基上培养24h后，菌落直径为0.6～1.2mm，菌落圆形，不透明，边缘较为整齐，表面湿润，有光泽，中间隆起，易挑起。菌落呈黄色，幼龄菌落淡黄色，随着菌龄增长，菌落逐渐变为蛋黄色。镜检DF-1菌株有明显的杆菌—球菌生长循环。
16S rDNA序列分析：提取菌DF-1基因组DNA作为模板，以细菌16S rDNA通用引物27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和1492R：TACGGYTACCTTGTTACGACTT对DNA模板进行PCR扩增，PCR产物切胶回收后，用Sanger测序法进行序列测定。测序得到16S rDNA序列如SEQ IDNO.1所示，长度为1398bp。
将所得序列在采用NCBI数据库中比对并下载同源序列，然后使用BLAST、MEGA等软件建立系统发育树(图1)。将该序列进行Blast比较，表明其与节杆菌属(Arthrobactersp.)菌株的同源性最高，相似性大于99％，系统进化树分析表明菌DF1与Arthrobacternicotianae Dc-06最近，如图1所示。结合菌落形态学特征和系统发育树分析，明确菌株DF1为节杆菌(Arthrobacter sp.)，将其命名为节杆菌(Arthrobacter sp.)DF1。
实施例2：制备节杆菌DF1抗植物病原真菌的发酵液
(1)菌种活化
在无菌条件下，将保存在甘油中的节杆菌DF1融化后吸取100μL转接于已灭菌的营养肉汤液体培养基(LN)中，置恒温摇床28±1℃，160r/min，培养20h，得到活化菌液。
所述的营养肉汤液体培养基(LN)：每升含蛋白胨10.0g，牛肉膏粉3.0g，氯化钠5.0g，最终PH 7.4±0.2，蒸馏水补足至1L。在温度121℃，压力0.1MPa下灭菌20min。培养基在温度121℃，压力0.1MPa下灭菌20min。(2)发酵培养
在无菌条件下，用灭菌的枪头吸取1000μL节杆菌DF1活化菌液，转接到含有100ml黄豆粉液体培养基的250ml锥形瓶内，恒温摇床培养，摇床转速160r/min，温度28±1℃，培养7d，得到节杆菌DF1的发酵液，所得发酵液经冷冻离心机8000r/min 4℃离心20min，去除菌体，所得上清液在无菌条件下，经0.22μm滤膜过滤，即得节杆菌DF1的发酵液。
所述的黄豆粉液体培养基：每升含可溶性淀粉15g，黄豆粉10g，硫酸铵2.0g，氯化钠4.0g，酵母浸出粉2.0g，蒸馏水补足至1L，PH 7.0。培养基在温度121℃，压力0.1MPa下灭菌20min。
实施例3：节杆菌DF1发酵液对植物病原真菌的抑制作用
本发明节杆菌DF1的抗植物病原真菌发酵液的抗菌试验如下：
1.植物病原真菌：
稻瘟病菌：稻梨孢菌Pyricularia oryzae，香蕉枯萎病菌：尖孢镰刀菌Fusariumoxysporum，荔枝霜疫霉菌Peronophthora litchii；
植物病原真菌的培养：
用接种环挑取少量植物病原真菌斜面培养物分别接入马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)平板活化，在28±1℃恒温培养箱培养，其中，香蕉枯萎病菌培养3d，稻瘟病菌培养5d，荔枝霜疫霉菌培养9天。
所述的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：每升含马铃薯浸出粉12.0g，葡萄糖20.0g，琼脂14.0g，蒸馏水补足至1L，PH 5.6±0.2。培养基在温度121℃，压力0.1MPa下灭菌20min。
2.节杆菌DF1发酵液对植物病原真菌菌丝生长抑制测定
在无菌条件下，分别取节杆菌DF1的发酵液1ml、2ml、3ml，加入灭过菌的处于熔化状态(60℃左右)的9ml、8ml、7ml的PDA培养基中，构成总体积10ml混合液，混合均匀后倒在直径9厘米的无菌培养皿内制成平板，每个比例3个重复；另取10ml PDA平板3个作为对照。冷却后在每个培养基平板平面中央放入一个待测植物病原真菌菌饼(直径为0.6厘米)，菌饼的菌丝面贴在培养基表面，将平板置于28±1℃培养5d。抑制实验结果分别如图2-4所示。采用十字交叉法测定菌落生长直径，用下述公式计算菌丝生长抑制率：
菌丝生长抑制率＝(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/对照组菌落直径×100％
结果：
如表1所示：节杆菌DF1发酵液滤液对稻瘟病菌、香蕉枯萎病菌、荔枝霜疫霉菌菌丝生长均具有较好的抑制作用，其中对稻瘟病菌和香蕉枯萎病菌的抑制率均在70％以上。其中对稻瘟病菌的抑制效果最优，抑制率达94.30％，且节杆菌DF1对稻瘟病菌的抑菌作用还表现有剂量效应，即随着节杆菌发酵液剂量的升高，抑菌效果也随之增强。因此节杆菌DF1发酵液滤液可作为微生物农药——抗植物病原真菌类药物进一步开发利用，有很大的应用前景。
表1节杆菌DF1发酵液对三种植物病原真菌菌丝生长的抑制效果
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种节杆菌菌株及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1398
<212> DNA
<213> 节杆菌(Arthrobacter sp.DF1)
<400> 1
cttcgacgac tccccccaca caaggtggtt aggccatcgg cttcgggtgt taccaacttt 60
cgtgacttga cgggcggtgt gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccgcag cgttgctgat 120
ctgcgattac tagcgactcc gacttcatgg ggtcgagttg cagaccccaa tccgaactga 180
gaccggcttt tagggattag ctccacctca cagtatcgca acccattgta ccggccattg 240
tagcatgcgt gaagcccaag acataagggg catgatgatt tgacgtcatc cccaccttcc 300
tccgagttga ccccggcagt ctcccatgag tccccaccac tacgtgctgg caacatggaa 360
cgagggttgc gctcgttgcg ggacttaacc caacatctca cgacacgagc tgacgacaac 420
catgcaccac ctgtgaacca gccccgaagg gaaagaccat ctctgatccg gtctggcaca 480
tgtcaagcct tggtaaggtt cttcgcgttg catcgaatta atccgcatgc tccgccgctt 540
gtgcgggccc ccgtcaattc ctttgagttt tagccttgcg gccgtactcc ccaggcgggg 600
cacttaatgc gttagctacg gcgcggaaaa cgtggaatgt cccccacacc tagtgcccaa 660
cgtttacggc atggactacc agggtatcta atcctgttcg ctccccatgc tttcgctcct 720
cagcgtcagt aaatgcccag agacctgcct tcgccatcgg tgttcctcct gatatctgcg 780
catttcaccg ctacaccagg aattccagtc tcccctacat cactctagtc tgcccgtacc 840
caccgcagat ccgaggttga gcctcggact ttcacggcag acgcgacaaa ccgcctacga 900
gctctttacg cccaataaat ccggataacg cttgcgccct acgtattacc gcggctgctg 960
gcacgtagtt agccggcgct tcttctgcag gtaccgtcac tctcgcttct tccctactga 1020
aagaggttta caacccgaag gccgtcatcc ctcacgcggc gtcgctgcat caggcttgcg 1080
cccattgtgc aatattcccc actgctgcct cccgtaggag tctgggccgt gtctcagtcc 1140
cagtgtggcc ggtcaccctc tcaggccggc tacccgtcgt cgccttggtg agccattacc 1200
tcaccaacaa gctgataggc cgcgagtcca tcccccaccg ataaatcttt caacaacaaa 1260
acatgcgttc cgcagtcata tccggtatta gacccagttt cccgggctta tcccaaagtc 1320
gggggcaggt tactcacgtg ttactcaccc gttcgccact aatccaccct gcaagcaggg 1380
cttcatcgtt cgactgca 1398

Claims (9)

1.一种节杆菌Arthrobactersp. DF1，其保藏编号为：GDMCC No：60314。
2.一种发酵制品，其特征在于，为权利要求1所述的节杆菌Arthrobactersp. DF1的发酵液或发酵液的过滤液。
3.根据权利要求2所述的发酵制品，其特征在于，所述的发酵液的制备方法为：将节杆菌Arthrobactersp. DF1接种到黄豆粉液体培养基或营养肉汤液体培养基中培养，得到发酵液。
4.根据权利要求3所述的发酵制品，其特征在于，所述的培养温度是25-29℃。
5.一种菌剂，其特征在于，该菌剂以权利要求2所述的发酵制品作为活性成分。
6.权利要求5所述的菌剂的制备方法，具体包括如下步骤：
将权利要求2所述的发酵制品作为活性成分，加入菌剂可接受的辅料，得到菌剂。
7.权利要求1所述的节杆菌Arthrobactersp. DF1或权利要求2所述的的发酵制品在抑制植物病原菌中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的应用是制备用于防治植物病原菌病害的药物。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的植物病原菌为稻瘟病菌、香蕉枯萎病菌和/或荔枝霜疫霉菌。
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