CN108715817B - 一种微白黄链霉菌菌株及其应用 - Google Patents

一种微白黄链霉菌菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种微白黄链霉菌菌株及其应用。该菌株是从华南农业大学昆虫生态实验室饲养的红火蚁蛹体中分离得到，该菌株保藏编号为GDMCC：60354。该菌株的发酵液具有较好的抑制稻瘟病菌、香蕉枯萎病菌和荔枝霜疫霉病菌菌丝生长的能力，在黄豆粉培养基培养7天后，所得发酵液滤液对三种病原菌的抑制率分别达到73.94％、73.91％和94.53％。抑菌作用还表现有剂量效应，即随着微白黄链霉菌DF‑5发酵液滤液剂量的升高，抑菌效果也随之增强。因此该微白黄链霉菌DF‑5及其发酵液滤液可作为抗植物病原真菌类药物进一步开发利用，有很大的应用前景。

Description

一种微白黄链霉菌菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种微白黄链霉菌菌株及其应用。
背景技术
化学农药大量使用的今天，给生态环境造成了巨大威胁，开发高效安全绿色环保新型农药迫在眉睫。微生物农药由于发酵工艺简单、成本相对低廉、不易使病虫害产生抗性、对人畜和环境温和而成为开发新型农药的热点。在生物长期进化过程中，昆虫个体和一些微生物形成了共生关系。其中，昆虫共生菌为寄主提供防御保护是目前研究最成熟最多的作用之一。在防御共生关系中，大量研究表明共生菌可以保护其寄主不受病原菌的侵害，比如白蚁的共生细菌具有氧化还原的能力，能抑制外来病原微生物的入侵。研究表明昆虫中存在着一些共生菌，尤其是放线菌，对植物病原真菌具有较强的抗菌活性。链霉菌是常见的放线菌，其产生的抗生素胞外酶等抗真菌活性物质比益生细菌和真菌产生的活性物质种类更多，活性更强。用其孢子或菌丝制成的活细胞制剂无毒、无害、无残留，且不伤害非靶标微生物，与环境兼容性好，防病持效期长。易于制成活细胞制剂如孢子粉剂、种衣剂、菌丝体培养物等，便于生产运输和保存，被广泛应用于农业病虫害的生物防治。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的具有抗菌活性、特别是对植物致病菌具有极强抑制活性的微白黄链霉菌菌株及其应用。
本发明的第一目的是提供一种新的链霉菌即微白黄链霉菌(Streptomycesalbidoflavus)DF-5，该菌是从华南农业大学昆虫生态实验室饲养的红火蚁(Solenopsisinvicta Buren)蛹活体中分离到了一个新菌株，该菌株属于放线菌。
本发明的微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)DF-5的菌学特性如下：
形态特征：微白黄链霉菌DF-5在高氏1号培养基上培养10d后，菌落表面呈蚌肉白色，有脊状褶皱，有同心圆环，直径约为0.5cm-1cm，无可溶性色素产生或能产生黄白可溶性色素；基内菌丝发育良好，无横隔，不断裂；气生菌丝生长良好，多分支，孢子丝直或螺旋状弯曲；孢子成链呈松散螺旋状，分生孢子大小1.5μm×0.45μm，表面光滑。
分子生物学特性：
16S rDNA序列分析：提取菌DF-5基因组DNA作为模板，以细菌16S rDNA通用引物27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和1492R：TACGGYTACCTTGTTACGACTT对DNA模板进行PCR扩增，PCR产物切胶回收后，用Sanger测序法进行序列测定。测序得到16S rDNA序列如SEQ IDNO.1所示，长度为1490bp。
将所得序列在采用NCBI数据库中比对并下载同源序列，然后使用BLAST、MEGA等软件建立系统发育树(图1)。将该序列进行Blast比较，表明其与链霉菌属(Streptomycessp.)菌株的同源性最高，相似性大于99％，系统进化树分析表明菌DF-5与Streptomycesalbidoflavus strain更接近，如图1所示。结合菌落形态学特征和系统发育树分析，明确菌株DF5为微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)，将其命名为微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)DF-5。
本发明的微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)DF-5菌体及其胞外代谢产物均属于本发明的保护范围。
因此，本发明的第二个目的是提供一种利用所述的微白黄链霉菌(Streptomycesalbidoflavus)DF-5制备得到的发酵制品。所述发酵制品可为发酵产品本身、经稀释过的发酵产品或经纯化的发酵产品，如实施例中的发酵液或发酵液滤液等；所述发酵制品可采用颗粒、粉末、片剂等固体外形或是液体、糊状、胶状等流体形式。
所述的微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)DF-5的发酵制品为微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)DF-5的发酵液或发酵液滤液。
所述的发酵液的制备方法为：
将微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)DF-5接种到黄豆粉液体培养基培养，得到发酵液。
优选，所述培养温度是25-29℃，更优选的为28℃。
所述的发酵液滤液的制备方法为：
将微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)DF-5接种到黄豆粉液体培养基中培养，得到发酵液；然后将其离心，取上清液在无菌条件下经0.22μm滤膜过滤，得到发酵液滤液。
本发明还提供一种菌剂，该菌剂以微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)DF-5和/或微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)DF-5的发酵制品作为活性成分；还可以包括菌剂可接受的辅料。
所述的菌剂的制备方法，具体包括如下步骤：
将所述的微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)DF-5和/或微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)DF-5的发酵制品作为活性成分，加入菌剂可接受的辅料，得到菌剂。
所述的微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)DF-5、所述的微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)DF-5的发酵制品在抑制植物病原菌中的应用也属于本发明的保护范围。
所述的应用是制备用于防治植物病原菌病害的药物，如生物农药。
所述的植物病原菌为稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)、香蕉枯萎病菌(Fusariumoxysporum)和/或荔枝霜疫霉菌(Peronophthora litchii)。
本实验室从红火蚁蛹中分离筛选获得一株隶属于放线菌门的微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)DF-5，试验表明其发酵液滤液对植物病原真菌稻瘟菌、香蕉枯萎菌和荔枝霜疫霉菌的菌丝生长具有较好的抑制活性，因此，该微白黄链霉菌及其发酵产物中的杀菌活性成分对新时期真菌杀菌剂的研发和使用具有理论和实际价值。
保藏说明：
本发明的微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)DF-5于2018年4月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，保藏编号：GDMCC：60354。
附图说明
图1是微白黄链霉菌DF-5的系统发育树。
图2是微白黄链霉菌DF-5发酵液滤液对稻瘟病菌的抑制作用，第一排左一：对照；第一排左二：1：9；第一排左三：2：8；第二排左一：3：7；第二排左二：4：6。
图3是微白黄链霉菌DF-5发酵液滤液对香蕉枯萎病菌的抑制作用，第一排左一：对照；第一排左二：1：9；第一排左三：2：8；第二排左一：3：7；第二排左二：4：6。
图4是微白黄链霉菌DF-5发酵液滤液对荔枝霜疫霉菌的抑制作用，第一排左一：对照；第一排左二：1：9；第一排左三：2：8；第二排左一：3：7；第二排左二：4：6。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
下列实例中未具体注明的实验方法，均可按照常规方法进行，或按照所用产品生产厂商的使用说明。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径得到。
实施例中所用的培养基具体组分如下：
所述的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：每升含马铃薯浸出粉12.0g，葡萄糖20.0g，琼脂14.0g，蒸馏水补足至1L，pH 5.6±0.2。培养基在温度121℃，压力0.1MPa下灭菌20min。
所述的黄豆粉液体培养基：每升含可溶性淀粉15g，黄豆粉10g，硫酸铵2.0g，氯化钠4.0g，酵母浸出粉2.0g，蒸馏水补足至1L，pH 7.0。培养基在温度121℃，压力0.1MPa下灭菌20min。
所述的脑心浸液肉汤(BHI)：每升含蛋白胨10.0g，脱水小牛脑浸粉12.5g，脱水牛心浸粉5.0g，氯化钠5.0g，葡萄糖2.0g，磷酸氢二钠2.5g，最终pH 7.4±0.2，蒸馏水补足至1L。在温度121℃，压力0.1MPa下灭菌20min。培养基在温度121℃，压力0.1MPa下灭菌20min。
实施例1：菌DF-5的分离和鉴定
1.菌DF-5的分离
取华南农业大学昆虫生态实验室人工饲养的红火蚁种群刚化2d的蛹，充分研磨后，涂在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上培养，分离得到一株白色微黄菌株。将得到的菌株在黄豆粉液体培养基中进行液体发酵。利用发酵液滤液做抑菌试验，发现该滤液对多种植物病原真菌具有较强的菌丝生长抑制活性。将该菌编号为菌DF-5。
2.菌DF-5的鉴定
形态特征：菌DF-5在高氏1号培养基上培养10d后，菌落表面呈蚌肉白色，有脊状褶皱，有同心圆环，直径约为0.5cm-1cm，无可溶性色素产生或能产生黄白可溶性色素；基内菌丝发育良好，无横隔，不断裂；气生菌丝生长良好，多分支，孢子丝直或螺旋状弯曲；孢子成链呈松散螺旋状，分生孢子大小1.5μm×0.45μm，表面光滑。
16S rDNA序列分析：提取菌DF-5基因组DNA作为模板，以细菌16S rDNA通用引物27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和1492R：TACGGYTACCTTGTTACGACTT对DNA模板进行PCR扩增，PCR产物切胶回收后，用Sanger测序法进行序列测定。测序得到16S rDNA序列如SEQ IDNO.1所示，长度为1490bp。
将所得序列在NCBI数据库中比对并下载相似度最高的同源序列，然后使用BLAST、MEGA等软件建立系统发育树(图1)。将该序列进行Blast比较，表明其与链霉菌属(Streptomyces sp.)菌株的同源性最高，相似性大于99％，系统进化树分析表明菌DF-5与Streptomyces albidoflavus strain更接近，如图1所示。结合菌落形态学特征和系统发育树分析，明确菌株DF-5为微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)，将其命名为微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)DF-5。
实施例2：制备微白黄链霉菌DF-5抗植物病原真菌的发酵液
(1)菌种活化
在无菌条件下，将保存在甘油中的微白黄链霉菌DF-5融化后吸取100μL转接于已灭菌的脑心浸液肉汤(BHI)中，置恒温摇床28±1℃，160r/min，培养20h，得到活化菌液。
(2)发酵培养
在无菌条件下，用灭菌的枪头吸取1000μL微白黄链霉菌DF-5活化菌液，转接到含有100ml黄豆粉液体培养基的250ml锥形瓶内，恒温摇床培养，摇床转速160r/min，温度28±1℃，培养7d，得到微白黄链霉菌DF-5的发酵液，所得发酵液经冷冻离心机8000r/min 4℃离心20min，去除菌体，所得上清液在无菌条件下，经0.22μm滤膜过滤，即得微白黄链霉菌DF-5发酵液滤液。
实施例3：微白黄链霉菌DF-5发酵液滤液对植物病原真菌的抑制作用
本发明微白黄链霉菌DF-5的抗植物病原真菌发酵液滤液的抗菌试验如下：
1.植物病原真菌：
稻瘟病菌：稻梨孢菌Pyricularia oryzae，香蕉枯萎病菌：尖孢镰刀菌Fusariumoxysporum，荔枝霜疫霉菌Peronophthora litchii。
植物病原真菌的培养：
用接种环挑取少量植物病原真菌斜面培养物分别接入马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)平板活化，在28±1℃恒温培养箱培养，其中，香蕉枯萎病菌培养3d，稻瘟病菌培养5d，荔枝霜疫霉菌培养9d。
2.微白黄链霉菌DF-5发酵液滤液对植物病原真菌菌丝生长抑制测定
在无菌条件下，分别取微白黄链霉菌DF-5的发酵液滤液1ml、2ml、3ml、4ml，依次分别加入灭过菌的处于熔化状态(60℃左右)的9ml、8ml、7ml、6ml的PDA培养基中，构成总体积10ml混合液，混合均匀后倒在直径9厘米的无菌培养皿内制成平板，每个比例3个重复；另取10ml PDA平板3个作为对照。冷却后在每个培养基平板平面中央放入一个待测植物病原真菌菌饼(直径为0.6厘米)，菌饼的菌丝面贴在培养基表面，将平板置于28±1℃培养5d。抑制实验结果分别如图2-4所示。采用十字交叉法测定菌落生长直径，用下述公式计算菌丝生长抑制率：
菌丝生长抑制率＝(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/对照组菌落直径×100％
结果：如表1所示：微白黄链霉菌DF-5发酵液滤液对稻瘟病菌、香蕉枯萎病菌、荔枝霜疫霉菌菌丝生长均具有较好的抑制作用，抑制率均在70％以上，其中对荔枝霜疫霉病菌的抑制效果最优，抑制率最高达94.53％，且微白黄链霉菌DF-5对香蕉枯萎病菌、荔枝霜疫霉菌的抑菌作用还表现有剂量效应，即随着微白黄链霉菌DF-5发酵液滤液剂量的升高，抑菌效果也随之增强。因此微白黄链霉菌DF-5发酵液滤液可作为微生物农药——抗植物病原真菌类药物进一步开发利用，有很大的应用前景。
表1微白黄链霉菌DF5发酵液滤液对三种植物病原真菌菌丝生长的抑制效果
Figure BDA0001640581990000081
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种微白黄链霉菌菌株及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1490
<212> DNA
<213> 微白黄链霉菌DF-5(Streptomyces albidoflavus DF-5)
<400> 1
gagtttgatc ctggctcagg acgaacgctg gcggcgtgct taacacatgc aagtcgaacg 60
atgaaccgct ttcgggcggg gattagtggc gaacgggtga gtaacacgtg ggcaatctgc 120
cctgcactct gggacaagcc ctggaaacgg ggtctaatac cggatatgac cgtctgccgc 180
atggtggatg gtgtaaagct ccggcggtgc aggatgagcc cgcggcctat cagcttgttg 240
gtgaggtagt ggctcaccaa ggcgacgacg ggtagccggc ctgagagggc gaccggccac 300
actgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag cagtggggaa tattgcacaa 360
tgggcgaaag cctgatgcag cgacgccgcg tgagggatga cggccttcgg gttgtaaacc 420
tctttcagca gggaagaagc gaaagtgacg gtacctgcag aagaagcgcc ggctaactac 480
gtgccagcag ccgcggtaat acgtagggcg caagcgttgt ccggaattat tgggcgtaaa 540
gagctcgtag gcggcttgtc acgtcggttg tgaaagcccg gggcttaacc ccgggtctgc 600
agtcgatacg ggcaggctag agttcggtag gggagatcgg aattcctggt gtagcggtga 660
aatgcgcaga tatcaggagg aacaccggtg gcgaaggcgg atctctgggc cgatactgac 720
gctgaggagc gaaagcgtgg ggagcgaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta 780
aacggtgggc actaggtgtg ggcaacattc cacgttgtcc gtgccgcagc taacgcatta 840
agtgccccgc ctggggagta cggccgcaag gctaaaactc aaaggaattg acgggggccc 900
gcacaagcgg cggaacatgt ggcttaattc gacgcaacgc gaagaacctt accaaggctt 960
gacatacacc ggaaacgtct ggagacaggc gcccccttgt ggtcggtgta caggtggtgc 1020
atggctgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc 1080
ttgtcccgtg ttgccagcag gcccttgtgg tgctggggac tcacgggaga ccgccggggt 1140
caactcggag gaaggtgggg acgacgtcaa gtcatcatgc cccttatgtc ttgggctgca 1200
cacgtgctac aatggccggt acaatgagct gcgataccgt gaggtggagc gaatctcaaa 1260
aagccggtct cagttcggat tggggtctgc aactcgaccc catgaagtcg gagtcgctag 1320
taatcgcaga tcagcattgc tgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt 1380
cacgtcacga aagtcggtaa cacccgaagc cggtggccca accccttgtg ggagggagct 1440
gtcgaaggtg ggactggcga ttgggacgaa gtcgtaacaa ggtagccgta 1490

Claims (9)

1.一种微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)DF-5，其保藏编号为：GDMCC：60354。
2.一种发酵制品，其特征在于，为权利要求1所述的微白黄链霉菌(Streptomycesalbidoflavus)DF-5的发酵液或发酵液滤液。
3.根据权利要求2所述的发酵制品，其特征在于，所述的发酵液的制备方法为：将微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)DF-5接种到黄豆粉液体培养基培养，得到发酵液。
4.根据权利要求3所述的发酵制品，其特征在于，所述培养温度是25-29℃。
5.一种菌剂，其特征在于，该菌剂以权利要求1所述的微白黄链霉菌(Streptomycesalbidoflavus)DF-5和/或权利要求2所述的微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)DF-5的发酵制品作为活性成分。
6.一种权利要求5所述的菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将权利要求1所述的微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)DF-5和/或权利要求2所述的微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)DF-5的发酵制品作为活性成分，加入菌剂可接受的辅料，得到菌剂。
7.权利要求1所述的微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)DF-5、权利要求2所述的微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)的发酵制品在抑制植物病原菌中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的应用是制备用于防治植物病原菌病害的药物。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的植物病原菌为稻瘟病菌、香蕉枯萎病菌和/或荔枝霜疫霉菌。
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