CN102424802B - 一种短小芽孢杆菌和菌株培养方法及应用 - Google Patents

一种短小芽孢杆菌和菌株培养方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种短小芽孢杆菌和菌株培养方法及应用，该菌株命名为一种短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)QHS-X8，于2010年8月12日保藏在中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，简称CCTCC)，保藏号：CCTCC M2010202。可通过液体培养和固体培养两种方式进行培养，得到的菌株能够产生青蒿素并分泌到胞外，可用于生产青蒿素，对疟原虫等原虫有杀灭作用及抗癌功能，可用于医药行业等。

Description

一种短小芽孢杆菌和菌株培养方法及应用
技术领域
本发明属微生物技术领域，主要是一种是可产生青蒿素，且能杀死疟原虫等原虫及抗癌的一种植物内生细菌短小芽孢杆菌；本发明还涉及该菌株的培养方法以及该短小芽孢杆菌在工业上的应用。 
背景技术
疟疾仍然是目前世界危害最严重的寄生虫病之一，在热带、亚热带地区广泛流行，每年有3～5亿人发病，150～270万人死亡，而在热带非洲90％是病情更重、死亡率更高的恶性疟疾，给当地人民的健康带来严重的威胁。目前，利用青蒿素治疗的每个疗程(3天)的费用是8美元到10美元，对那些地区的贫困患者来说过于昂贵，主要瓶颈在于青蒿的收获量不足。当前，世界上的青蒿素来源主要从菊科蒿属植物中提取。在非洲和亚洲许多地区，疟原虫已经对其他多数抗疟药物具有抗药性，这些地区对青蒿素类药物的需求格外迫切。但植株中青蒿素的含量一般较低(约占干重的0.1％～1.0％)，且提取环节多、费时费力，使青蒿素的生产成本高、产量低，难以满足市场需求。由于微生物生长周期短，生长快，因此，筛选能产生青蒿素菌株可以解决该问题。目前，尚未见到有用于产生青蒿素的菌株报导。 
发明内容
本发明的目的正是为了克服上述青蒿素生产中存在的不足而提供一种可用于生产青蒿素的短小芽孢杆菌。 
本发明的另一个目的是提供该短小芽孢杆菌的培养方法。 
本发明的再一个目的是通过对该短小芽孢杆菌的理化性质研究，提供该短小芽孢杆菌在工业生产中的多种用途。 
本发明还包括该短小芽孢杆菌的分离和筛选方法。 
一种内生芽孢杆菌，命名为一种短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)QHS-X8，其于2010年8月12日保藏在中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，简称CCTCC)，保藏号：CCTCC M2010202。 
本发明的菌株QHS-X8的菌落奶酪色、表面干燥不透明、扁平、边缘整齐；菌体革兰氏染色反应为阳性，短杆状，菌体单个或成对排列，芽孢椭圆形，中生或近端生，菌体两端有丛生鞭毛。 
本发明的菌株QHS-X8的培养方式为： 
(1)、固体培养：把菌株接种于把菌株接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，于25～37℃培养箱中培养1～4天，耐盐；所述的牛肉膏蛋白胨培养基配制方法为：原料牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g、琼脂20g、蒸馏水1000ml、pH7.0～7.2，121℃灭菌20min。 
(2)、液体培养：把菌株接种于发酵培养基中，在25～37℃温度下，140～220rpm的摇床上培养32～96小时；所述的发酵培养基配制方法为：原料牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g、蒸馏水1000ml、pH7.0～7.2，121℃灭菌20min。 
本发明的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)QHS-X8，委托上海英骏生物技术有限公司测定，进行基因测序，其核苷酸序列如表2所示。 
本发明的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)QHS-X8可以在抗疟原虫药物青蒿素生产上应用。 
本发明的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)QHS-X8可以在抗癌药物青蒿素生产上应用。 
本发明的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)QHS-X8，从黄花蒿植株中分离筛选得到，其分离与筛选过程为： 
①采集黄花蒿植株样品； 
②牛肉膏蛋白胨固体平板进行粗筛； 
③三角瓶液体发酵进行复筛； 
④获得产青蒿素的内生细菌菌株QHS-X8。 
本发明的菌株QHS-X8是从黄花蒿植株中分离筛选得到的内生菌，其能够产生青蒿素并分泌到胞外，其作用机理是为青蒿素中含有过氧基团的倍半萜内酯，其作用方式主要是干扰表膜-线粒体的功能。由于青篙素作用于食物泡膜，从而阻断了营养摄取的最早阶段，使疟原虫较快出现氨基酸饥饿，迅速形成自噬泡，并不断排出虫体外，使疟原虫损失大量胞浆而死亡。尤其对引起脑型及抗氯喹恶性疟疾的疟原虫有杀抑作用，是一种高效、速效、低毒的具有特殊疗效的抗疟药。 
附图说明
图1是短小芽孢杆菌菌株QHS-X8在牛肉膏蛋白胨固体平板上菌落形态图。 
图2是短小芽孢杆菌菌株QHS-X8在光学显微镜形态图。 
图3是短小芽孢杆菌菌株QHS-X8电子显微镜下的形态图。 
图4是青蒿素标准品及菌株QHS-X8发酵液粗提物样品的HPLC色谱图。 
图5是内生菌菌株QHS-8发酵液粗提样品HPLC图。 
图6是菌株QHS-X8及其从GeneBank数据库中调集的相关属种构建及以16S rDNA序列为基础的系统发育树状关系图。 
具体实施方式
实施例1：短小芽孢杆菌菌株QHS-X8的获取和相关理化性质的实验。 
1、短小芽孢杆菌菌株QHS-X8是从湖南省怀化市的怀化学院校园内及郊区的黄花蒿植株中分离筛选得到，其分离与筛选过程为： 
①采集黄花蒿植株样品：采集青蒿植株，分别取根、茎和叶的小块，约0.15cm×0.15cm大小，75％酒精漂洗(20～30s)→无菌水冲洗→0.2％升汞漂洗(10～20s)→无菌水冲洗数次或直接取内层无污样。 
②牛肉膏蛋白胨固体平板进行粗筛：分置于PDA、牛肉膏蛋白胨和高氏一号脂培养基平板，25～30℃下避光培养。培养5～20d，分别待平板上长出菌落，用划线、稀释以及直接用无菌小剪刀取尖端菌丝等分离方法。并根据青蒿素的显色反应，采用薄层色谱法检测青蒿素的存在与否进行筛选。 
③三角瓶液体发酵进行复筛：分别对初筛所得菌株进行摇瓶培养，利用75％的乙醇浸提离心取上清液进行低温真空旋转蒸发，并用无菌水洗脱下来，用碱(2％的NaOH溶液)处理后，50℃反应30min，生成在292nm波长处有明显吸收的化合物，称为Q292，α，β-不饱和酮 酸盐，再进行紫外扫描进行比色测定，挑选并保留产量较高的菌种。 
④获得产青蒿素的内生细菌菌株QHS-X8，对菌株QHS-X8的形态特征、生理生化及分子水平进行鉴定(见生理生化特征实验及分子生物学实验)。 
⑤确定获得菌株QHS-X8：短小芽孢杆菌(根据菌株的形态特征、生理生化及分子学参考《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》进行鉴定)。 
2、其菌株的培养采用： 
①、固体培养：接种于牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏3g、蛋白胨10g、琼脂20g、蒸馏水1000ml、pH7.0～7.2，121℃灭菌20min)，于30℃培养箱中培养2～4天。 
经固体培养得到菌株QHS-X8，菌落奶酪色、表面干燥不透明、扁平、边缘整齐(见图1)；菌体革兰氏染色反应为阳性，短杆状，运动，菌体单个或成对排列，芽孢椭圆形，中生或近端生，菌体两端有丛生鞭毛(见图1、图2、图3)，pH5.0～9.0，生长温度为25～40℃，耐盐。 
培养得到菌株QHS-X8经广东省微生物分析检测中心检测，检测结果详见附件(广东省微生物分析检测中心分析检测报告)。 
表1QHS-X8菌株的生理生化特性 
Figure BSA00000329216900061
注：“+”为阳性反应，“-”为阴性反应 
根据《伯杰氏细菌鉴定手册》及《常见细菌系统鉴定手册》的要求对菌株QHS-X8进行生理生化实验，结果见表1，由上表可知QHS-X8的接触酶实验、V-P测定呈阳性，氧化酶实验和硝酸盐还原试验为阴性的一种好氧细菌，淀粉水解实验、明胶液化试验、苯丙氨酸脱氨酶试验、柠檬酸盐利用、卵磷脂酶试验、酪素水解试验、酪氨酸水解及丙酸盐利用实验结果均为阴性反应，而糖醇实验中只有葡萄糖产气实验结果为阴性，其余为阳性反应。 
根据上述形态特征观察及生理生化实验结果，查《伯杰氏细菌鉴定手册》及《常见细菌系统鉴定手册》可知，该菌种属于芽孢杆菌属(Bacillus)，且与短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)的形态特征和生理生化特征极为相似。 
16S rDNA的序列分析及其系统进化树的建立：16S rDNA的序列由上海英骏生物技术有限公司测定，QHS-X8的16SrDNA序列全长1381bp(见附录表2)。将得到的碱基序列通过因特网在GenBank等国际核酸序列数据库内进行同源序列搜索，并将搜索的结果进行比对和系统进化树的构建。该进化系统是通过邻接法推断出来的(见图6)。这个系统以总分支长度为0.041的树作为最佳选择的结果。而这个树以等级系统的形式画出来，在这个等级系统中，分支长度在同一个单元中作为它们的进化距离，从而构建出系统进化树。在推测进化距离时使用最大似然法(MLM)计算出来，并且应符合在碱基数在每个地方都有置换的单元中。包括的密码子位置是1+2+3+Noncoding，含间隙和缺少数据的所有位置都被都从数据集中淘汰(完 全删除选项)。该系统总共有1044个位置在最后的数据集中。最后在软件MEGA4.0中进行系统进化树分析。测序结果分析显示，QHS-X8的16S rDNA与短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)的同源性达100％，在系统进化树上处于同一分支。 
②、液体发酵培养：接种于发酵培养基(改良牛肉膏蛋白胨基：牛肉膏3g、蛋白胨10g、蒸馏水1000ml、pH7.0～7.2，121℃灭菌20min)中，在30℃温度下，转速100r的摇床上培养32～36小时；取1ml样品液至10ml的试管中，加入4ml0.2％氢氧化钠，摇匀，置45℃±1℃恒温水浴中保持30min，取出，冷水冷却至室温后加入0.08mol/L醋酸至刻度，0.22μm微孔器过滤后，采用高效液相色谱法，以0.01mol/LNa2HPO4-NaH2PO4缓冲液∶甲醇(55∶45)作为流动相，设置柱温30℃，流速为0.8ml/min，在260nm的检测波长下测定其样品中青蒿素的含量，结果为青蒿素的含量为0.5～20μg/ml(见图4及图5)。 
实验证明，该菌株QHS-X8为短小芽孢杆菌，该菌株能产生青蒿素(为国内外首次发现)。该菌株青蒿素的生产能力为0.5～20μg/ml。该菌株产青蒿素的能力较强，生产周期较短，对前述在工业生产中有广泛的应用前景。 
实施例2：短小芽孢杆菌菌株QHS-X8在抗疟原虫药物青蒿素生产上应用。 
恶性疟原虫的抗疟药敏感性体外实验：以QHS-X8的发酵浓缩液及青蒿素标准品，参照Rieckmann体外微量测定法原理，制作了青蒿素测定板，并测定了恶性疟原虫对该发酵液及青蒿素标准品的敏感 性。取青蒿素4.8mg，溶于1ml氯仿中，用无水乙醇稀释至所需浓度(最高浓度为160pmol/井，其氯仿与乙醇比例为1∶4000。载药板采用上海第三塑料厂生产的细胞毒反应板，每板4行，每行10井。1及10井为无药对照井，仅加20μl 1∶4000氯仿乙醇溶液。2～9井依次加入20μl分别含有1.25、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0及160.0pmol青蒿素溶液。38℃恒温干燥2h，透明胶带密封井口，紫外线(照距50cm)照射消毒1h。4℃冰箱保存备用，部分测定板室温保存，以比较室温条件下存放的有效期。培养基按刘德全等介绍方法制备，每支2ml无菌安瓿中含RPMI 1640完全培养基1.8ml，4℃冰箱保存备用。在每支培养基中加入0.2ml含虫血，混匀后用定量吸管每井依次加入50μl含虫血培养基。在37℃±1℃恒温箱中孵育24～36h。对照井裂殖体率在20％以上为测定成功，反之为测定失败。测定成功病例计数200个无性体中的裂殖体数，以对照井裂殖体为基数计算出各井裂殖体抑制率，在半对数表格中查算出半数抑制量(ID50)及完全抑制量(ID95)。用几何均数计算平均完全抑制裂殖体形成的平均浓度(CIMC)。 
在青蒿素和该菌株的发酵液测定板中共测定成功32例，成功率分别为76.19％(32/42)和73.81％(31/42)。完全抑制裂殖体形成的最低浓度，青蒿素为2.5pmol/井，发酵液为5pmol井，分别有1及3例疟原虫在最高浓度的青蒿素和发酵液板中发育至裂殖体。在各药浓度井中发育至裂殖体的例数见表3。在各药井中的平均抑制率见表4，在最低浓度井的平均抑制率青蒿素及发酵液为10.24％和8.34％，最高浓度井抑制率分别为98.53％及91.66％。ID50及ID95见表4。除1例疟原虫能在 160pmol的青蒿素药中发育至裂殖体外，其他各例均受到抑制，CIMI为599.8nmol/L。疟原虫在青蒿素和发酵液测定板对照井中发育至裂殖体的平均数分别为116和102个。 
表3恶性疟原虫在各药井中发育到裂殖体的例数 
Figure BSA00000329216900101
注：1号为对照井，2号井中青蒿素及发酵液含量为1.25pmol，3～9号井依次倍增。 
表4恶性疟原虫对青蒿素和菌株QHS-X8的发酵液体外测定结果 
Figure BSA00000329216900102
实施例3短小芽孢杆菌菌株QHS-X8在抗肿瘤药物青蒿素生产上应用。在路景涛，魏伟，陈敏珠的论文《青蒿素抗肿瘤作用的初步研究》(安徽医药.2007，11(7)：14-15.)中记载了青蒿素的抗癌作用。 
对实体瘤S180小鼠瘤重的抑制作用：昆明种小鼠50只，♂，无菌取接种S180小鼠d8腹水，用无菌生理盐水稀释为1×1010·L-1浓度的细胞悬液，每鼠0.2ml(2×106)皮下接种于小鼠右腋窝。第2天随机分为5组：模型组、ART三个剂量组(25，50，100mg·kg-1) 及环磷酰胺(20mg·kg-1)，每组10只。每日灌胃给药一次，0.2ml/10g，连续10d。末次给药后次日称体重，处死小鼠剥离瘤块并称重，模型组瘤重1g以上进行结果分析。按下式计算抑瘤率：抑瘤率＝(模型瘤重-实验组瘤重)/模型瘤重×100％，抑瘤率≥30％以上判定为有一定的抗肿瘤作用。 
如表5所示，ART以25，50，100mg·kg-1三个剂量灌胃给药，对实体瘤S180小鼠的抑瘤率在30.81％～37.88％，其中ART中剂量对实体瘤S180小鼠的抑瘤率最大为37.88％，提示ART对小鼠S180有明显的抑制作用。ART各剂量间也没有明显的剂量效应关系。 
表5  ART对实体瘤S180的影响(x±s) 
Figure DEST_PATH_GSB00000598415300011
 *P＜0.05，**P＜0.01与模型组比较 
表2  QHS-X8菌株的16S rDNA序列
Figure DEST_PATH_GSB00000598415300012
Figure DEST_PATH_GSB00000598415300021

Claims (5)

1.一种短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)QHS-X8，其于2010年8月12日保藏在中国典型培养物保藏中心(China Center for TypeCulture Collection，简称CCTCC)，保藏号：CCTCC M2010202。
2.根据权利要求1所述的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)QHS-X8，其特征在于：所述菌株QHS-X8的菌落奶酪色、表面干燥不透明、扁平、边缘整齐；菌体革兰氏染色反应为阳性，短杆状，菌体单个或成对排列，芽孢椭圆形，中生或近端生，菌体两端有丛生鞭毛；QHS-X8菌株的16S rDNA序列如表2所示。
3.一种权利要求1所述的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)QHS-X8的菌株培养方式，其一为固体培养：把菌株接种于牛肉膏蛋白胨培养基，于30℃培养箱中培养2～4天，耐盐；
所述的牛肉膏蛋白胨培养基配制方法为：牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g、琼脂20g、蒸馏水1000ml、pH 7.0～7.2，121℃灭菌20min；
菌株培养方式其二为液体培养：把菌株接种于发酵培养基中，在30℃温度下，100rpm的摇床上培养32～36小时；
所述的发酵培养基配制方法为：牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g、蒸馏水1000ml、pH 7.0～7.2，121℃灭菌20min。
4.权利要求1所述的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)QHS-X8在生产抗疟原虫药物青蒿素中的应用。
5.权利要求1所述的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)QHS-X8在生产抗癌药物青蒿素中的应用。
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