CN108285878A - 高产甘露醇的柠檬明串株菌hm1菌株及发酵制备甘露醇的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种高产甘露醇的柠檬明串株菌HM1菌株及发酵制备甘露醇的方法，更详细地涉及可高产甘露醇的柠檬明串珠菌及利用柠檬明串珠菌HM1发酵制备甘露醇的方法以及柠檬明串珠菌HM1菌株及其发酵生产的甘露醇在食品医药化工上的应用。本发明利用响应面设计对柠檬明串珠菌HM1产甘露醇的发酵条件进行优化，建立了因素与响应值之间的二次回归模型，可快速有效的研究多个因素之间的交互作用对响应值的影响。相比于以往的优化试验，具有试验次数少、周期短、综合性好等优点，在生物学领域具有广泛的应用前景。

Description

高产甘露醇的柠檬明串株菌HM1菌株及发酵制备甘露醇的 方法

技术领域

本发明涉及高产甘露醇的柠檬明串株菌HM1菌株及发酵制备甘 露醇的方法，更详细地涉及可高产甘露醇的柠檬明串珠菌及利用柠檬 明串珠菌HM1发酵制备甘露醇的方法、以及柠檬明串珠菌HM1菌株 及其发酵生产的甘露醇在食品医药化工上的应用。

背景技术

甘露醇(Mannitol)又名D-甘露糖醇(D-Mannitol)，具有清凉的甜味， 不易吸潮，热量低、无毒、无副作用等特点。在人体生理代谢中，甘 露醇被人体吸收后的代谢不依靠胰岛素，不提高血糖值。甘露醇不会 作为口腔微生物的营养源，可抑制突变链球菌的生长繁殖。

由于甘露醇具有特殊的物理和化学性质，因此在食品、医药和化 工等行业有着广泛应用。在医药上，甘露醇作为高渗降压药，能快速 降低颅内压，还可用作输液和针剂配料、各种片剂的赋型剂和矫味剂、 干冻针剂的载体；在化学工业上，甘露醇可以作为合成树脂和涂料的 原料、聚氯乙烯的增塑剂、合成洗涤剂的助洗剂及织物柔软剂等；在 食品工业上，甘露醇可作食品的防粘剂，也可作糖尿病、肥胖病人的 低热值食品和低糖食品的甜味剂和功能性食品添加剂。

甘露醇作为一种应用广泛的功能性糖醇，其生产方法有自然提取 法、化学合成法和生物转化法。其中，利用生物转化法中的微生物发 酵法进行甘露醇的生产，安全无毒，绿色环保，是目前最具有潜力的 生产方法。能够发酵生产甘露醇的微生物有酵母菌、丝状真菌和乳酸 菌，其中以异型发酵乳酸菌居多。异型发酵乳酸菌为食品级微生物， 利用该微生物进行甘露醇的生产，安全无毒，绿色环保。

甘露醇作为一种功能性糖醇，在医药、食品和化工领域已得到了 广泛了应用。近些年，随着甘露醇使用量的增多及应用领域的扩大， 甘露醇的市场需求量不断增加，市场前景广阔。

发明内容

本发明对柠檬明串珠菌进行化学诱变，筛选具有高产甘露醇能力 的诱变菌株，对其进行发酵特性的研究，提升诱变菌株的甘露醇生产 量。为甘露醇的生物制造提供优良菌株，同时，促进饲料行业的发展， 对绿色饲料添加剂的开发与应用起到推动和创新的作用。

本发明涉及生物材料样品保藏“CGMCC No.14234”，于2017年6 月12日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京 市朝阳区北辰西路1号院3号)，并命名为柠檬明串珠菌Leuconostoc citreum。

本发明的目的在于，提供一种高产甘露醇的柠檬明串株菌HM1，其 特征在于，以甲基磺酸乙酯(EMS)作为化学诱变剂，诱变柠檬明串珠菌。

本发明所述的高产甘露醇的柠檬明串株菌HM1，其特征在于，通过 磷酸转酮酶途径代谢生成甘露醇。

本发明所述的高产甘露醇的柠檬明串株菌HM1，其特征在于，所述 EMS的浓度为0.5～1％的范围，处理时间为15-60分钟。

本发明所述的高产甘露醇的柠檬明串株菌HM1，其特征在于，所述 EMS处理条件为0.5％EMS，处理45min。

本发明所述的高产甘露醇的柠檬明串株菌HM1，其特征在于，所述 诱变柠檬明串珠菌经果糖的改良MRS-果糖培养基中发酵培养得到。

本发明所述的高产甘露醇的柠檬明串株菌HM1，其特征在于，所述 果糖质量浓度设置成50g/L～200g/L的范围。

本发明所述的高产甘露醇的柠檬明串株菌HM1，其特征在于，所述 发酵温度选自20℃～40℃的范围。

本发明所述的高产甘露醇的柠檬明串株菌HM1，其特征在于，所述 发酵的初始pH设置成5.0～7.5的范围。

本发明还提供一种柠檬明串珠菌HM1菌株在食品医药化工中的应 用。

本发明进一步提供一种制备甘露醇的方法，其特征在于，包括 利用权利要求1至9中所述柠檬明串珠菌HM1的发酵步骤。

本发明所述的方法制备的甘露醇在食品医药化工中的应用。

甘露醇作为柠檬明串珠菌发酵过程中的代谢产物，在食品、医药 和化工领域有着广泛的应用。在医药行业，甘露醇具有利尿、降压等 功效，可作为片剂的赋形剂和口中清凉剂等；在食品行业，甘露醇可 作为功能性糖醇供减肥和糖尿病患者食用，食品中加入甘露醇可改善 口感、延长食品的货架期；在化工领域，可作为乳化剂、分散剂和保 湿剂等。

附图说明

图1为示出根据本发明的EMS不同处理条件对柠檬明串珠菌95 细胞存活率的影响结果的图表。

图2为示出根据本发明的柠檬明串珠菌95EMS诱变处理筛选结 果的图片。

图3为示出根据本发明的柠檬明串珠菌KM20EMS诱变处理筛选 结果的图片。

图4为示出根据本发明的柠檬明串珠菌E28EMS诱变处理筛选结 果的图片。

图5为图示根据本发明的甘露醇标准曲线。

图6为图示根据本发明的果糖标准曲线。

图7为图示根据本发明的柠檬酸串珠菌95-9生长曲线。

图8的a部分为示出根据本发明的不同碳源质量浓度下甘露醇含 量的变化的图表，图8的b部分为示出根据本发明的不同碳源质量浓 度下果糖含量的变化的图表。

图9的a部分为示出根据本发明的不同氮源种类下甘露醇含量的 变化的图表，图9的b部分为示出根据本发明的不同氮源种类下果糖 含量的变化的图表。

图10的a部分为示出根据本发明的不同氮源质量浓度下甘露醇含 量的变化的图表，图10的b部分为示出根据本发明的不同氮源质量浓 度下果糖含量的变化的图表。

图11的a部分为示出根据本发明的不同温度条件下甘露糖含量的 变化的图表，图11的b部分为示出根据本发明的不同温度条件下果糖 含量的变化的图表。

图12的a部分为示出根据本发明的不同发酵初始pH条件下甘露 醇含量的变化的图表，图12的b部分为示出根据本发明的不同发酵初 始pH条件下果糖含量的变化的图表。

图13为示出根据本发明的碳源质量浓度与温度对甘露醇产量影 响的响应面和等高线图。

图14为示出根据本发明的碳源质量浓度与发酵初始pH对甘露醇 产量影响的响应面和等高线图。

图15为示出根据本发明的温度与发酵初始pH对甘露醇产量影响 的响应面和等高线图。

具体实施方式

实施例1：高产甘露醇柠檬明串珠菌的筛选

本发明采用甲基磺酸乙酯(ethylmethyl sulfonate，EMS)作为化学诱 变剂，分别对三株产甘露醇的柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum 95， Leuconostoc citreum E28，Leuconostoc citreum KM 20)进行化学诱变， 确定EMS诱变处理柠檬明串珠菌的最佳条件，筛选能够高产甘露醇的 诱变菌株。

本发明采用柠檬明串珠菌95、E28、KM20，均为延边大学农学院 食品科学系食品科学实验室保存菌种，其中柠檬明串珠菌E28由自制 辣白菜分离得到。

在本发明中，蛋白胨、MRS琼脂、MRS肉汤(青岛高科园海博生 物技术有限公司，生化试剂)；酵母膏、甘露醇(北京奥博星生物技术有 限责任公司，生化试剂)；磷酸氢二钾、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、 氯化钙、柠檬酸、柠檬酸钠、果糖(天津市科密欧化学试剂有限公司， 分析纯)；硫酸镁(沈阳市试剂五厂，分析纯)；葡萄糖(天津市北辰方正 试剂厂，分析纯)；甲基磺酸乙酯(西格玛化学公司)。

在本发明中，培养基与溶液的配制按照以下方法进行：

1.菌种活化与初培养

MRS培养基(/L)：蛋白胨10g，牛肉浸粉5g，酵母浸粉4g，葡 萄糖20g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸三铵2g，醋酸钠5g，硫酸镁0.2g， 硫酸锰0.05g，琼脂15g，吐温80 1mL，pH 6.2±0.2，121℃高压灭菌15～20min。

MRS肉汤(/L)：蛋白胨10g，牛肉粉8g，酵母粉4g，葡萄糖20g， 磷酸氢二钾2g，柠檬酸氢二铵2g，乙酸钠5g，硫酸镁0.2g，硫酸锰 0.04g，吐温80 1mL，pH 5.7±0.2，118℃高压灭菌15min。

2.筛选培养基

MRS－果糖固体培养基(/L)：酵母膏5g，蛋白胨5g，K₂HPO₄ 20g， 果糖10g，盐混合溶液10mL，琼脂20g，自然pH，121℃高压灭菌15 min(果糖单独灭菌)。

MRS-葡萄糖固体培养基(/L)：酵母膏5g，蛋白胨5g，K₂HPO₄ 20g，葡萄糖10g，盐混合溶液10mL，琼脂20g，自然pH，121℃高 压灭菌15min(葡萄糖单独灭菌)。

3.种子与发酵培养基

种子培养基(/L)：同MRS肉汤

发酵培养基(/L)：酵母膏5g，蛋白胨5g，K₂HPO₄ 20g，果糖30g， 盐混合溶液10mL，自然pH，121℃高压灭菌15min(果糖单独灭菌)。

4.溶液

盐混合溶液(g/L)：MgSO₄·H₂O 20，NaCl 1，FeSO₄ 2，MnSO₄ 14， CaCl₂·H₂O 13。紫外杀菌30min，0.22μm水系滤膜过滤。

柠檬酸－柠檬酸钠缓冲溶液(pH 5.5)：配制0.1M的柠檬酸和柠檬 酸钠溶液各100mL，按不同比例将两种溶液混合至pH 5.5。

0.85％氯化钠溶液：称取0.85g氯化钠溶解于蒸馏水中，定容至 100mL。

5.菌种活化

将保藏于－80℃冰箱中的3株柠檬明串珠菌在室温下解冻，挑取 一菌环的细胞在MRS培养基中划线活化，30℃倒置培养24h，4℃保藏 用于后期实验。

6.EMS诱变柠檬明串珠菌

以柠檬明串珠菌95为实验菌株，挑取活化后的单一菌落，接种于 1.5mL的MRS肉汤中，30℃静置培养24h，以1％的接种量接种到25mL MRS肉汤中，确定菌株生长进入对数期的培养时间。将培养到达对数 期的菌悬液离心(6000r/min，10min)后倒弃上清液，加入10mLpH为 5.5的柠檬酸缓冲溶液清洗2次，倒弃缓冲液，将菌体溶解于同体积的 缓冲溶液中，取1.5mL溶液用EMS进行诱变处理，将处理后的菌体清 洗，经梯度稀释(0.85％的NaCl)后涂布平板。30℃倒置培养24h，通过 菌落计数的方法计算菌株的细胞存活率。以不加EMS的菌悬液为对照 组，每组三个平行。

7.EMS最佳诱变条件的确定

分别考察EMS的不同浓度(0.5、1％)和不同处理时间(15、30、45、 60min)对柠檬明串珠菌95诱变优劣的影响，通过计算菌株的细胞存活 率来确定EMS诱变处理的最佳条件，最佳条件下菌株的细胞存活率为 30％～50％。

8.诱变菌株的筛选

确定最佳诱变条件后，将3株柠檬明串珠菌经EMS处理，用缓冲 溶液清洗三次，然后用0.85％的氯化钠溶液进行梯度稀释，将稀释后的 菌悬液涂布于MRS-果糖固体培养基中30℃培养24h，观察菌落的大小， 第一轮挑选出形态较小的菌落，然后将小菌落分别点样于MRS-果糖和 MRS-葡萄糖固体培养基中。30℃培养24h，筛选在MRS-果糖固体培养 基中生长受到抑制，而在MRS-葡萄糖固体培养基中长势良好的菌株。

9.发酵试验

为评估诱变菌株的甘露醇生产能力，将保藏的诱变菌株在MRS培 养基中活化，挑取单一菌落接种于1mL MRS肉汤中，30℃静置培养 24h作为种子培养液，将种子液以1％的接种量接种到含有3％果糖的改 良MRS-果糖培养基中，30℃发酵培养24h，通过测定菌株的甘露醇产 量筛选出能够高产甘露醇的诱变菌株。

在本发明中，采用高效液相色谱测定甘露醇产量，首先，

标准溶液的配制：精密称取甘露醇标准品5g，用去离子水定容至 50mL，配制成质量浓度为0.1g/mL的标准溶液。

标准曲线的绘制：将标准溶液逐级稀释成五种不同质量浓度(10、 5、2.5、1.25、0.625mg/mL)的标准工作液，分别定容于10mL容量瓶中， 上样前用0.22μm的水系滤膜过滤。进样量20μL，以甘露醇的质量浓 度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

样品前处理：将发酵过程中定期取出的发酵液离心(13000r/min， 5min)，取上清液适量用去离子水稀释后经0.22μm的水系滤膜过滤， 上机检测。

分析条件：色谱柱为Shodex SC1011配位体交换色谱柱 (8.0mm×300mm，6μm)；柱温为80℃；流动相为去离子水，用0.22μm 水系滤膜过滤、脱气后上机；流速0.6mL/min；进样体积20μL；检测 器为示差折光检测器，检测池温度40℃。

计算公式：X＝C×V

式中：X－发酵液中的甘露醇产量(g/L)

C－样品稀释液中的甘露醇浓度(g/L)

V－稀释倍数

其次，菌株细胞存活率的计算，

细胞存活率％＝X/Y×100％

式中：Y－对照组菌落总数

X－诱变处理组菌落总数

如上所述，在不同浓度EMS和不同处理时间对柠檬明串珠菌95 细胞存活率的影响结果如图1所示。用1％的EMS处理菌株，处理15min 和30min时细胞存活率在20％左右，处理45min时菌株的细胞存活率 显著增高达到50％以上，超出了最佳存活率的范围。用0.5％的EMS 处理菌株，随着时间的延长，菌株的细胞存活率整体呈下降趋势，处 理30min和45min时，存活率在最佳存活率范围之内，为保证诱变效 果良好，确定EMS处理条件为0.5％EMS，处理45min。

对于产甘露醇诱变菌株的筛选中，本发明将经EMS处理后的诱变 菌株涂抹于含有1％果糖的MRS-果糖固体培养基中，进行初筛。假设 柠檬明串珠菌的果糖激酶基因发生了突变，则以果糖作为唯一碳源的 磷酸转酮酶代谢途径受到影响，细胞生长就会受到抑制。通过观察培 养基中诱变菌株的生长状态，菌落小的菌株即为果糖激酶基因发生诱 变的菌株。将目标菌株分别接种于MRS-果糖固体培养基和MRS-葡萄 糖固体培养基中，筛选果糖培养基中生长受到抑制，葡萄糖培养基中 长势良好的菌株为目标菌株。在进行复筛的同时排除两种情况，一种 是经EMS诱变后在果糖培养基和葡萄糖培养基中生长都受到抑制的菌株，另一种是菌株在诱变后重新利用果糖激酶在果糖培养基中长势良 好的菌株。

图2为柠檬明串珠菌95的筛选结果。经初筛，共有13株诱变菌 株满足在MRS-果糖固体培养基中的生长要求，将这些菌株进行复筛， 通过比较可以看出，95-8、95-9、95-12这3株诱变菌株符合在两种培 养基中的生长要求，为目标菌株。

图3为柠檬明串珠菌KM20的筛选结果。经初筛，共有11株诱变 菌株满足在MRS-果糖固体培养基中的生长要求，将这些菌株进行复 筛，通过比较可以看出，KM20-1、KM20-10这2株诱变菌株符合在两 种培养基中的生长要求，为目标菌株。

图4为柠檬明串珠菌E28的筛选结果。经初筛，共有19株诱变菌 株满足在MRS-果糖固体培养基中的生长要求，将这些菌株进行复筛， 通过比较可以看出，E28-14、E28-17、E28-19这3株诱变菌株符合在 两种培养基中的生长要求，为目标菌株。

以下，为比较诱变菌株与原菌株的甘露醇生产能力，将原菌株与 筛选出来的诱变菌株接种到MRS-果糖发酵培养基中，发酵培养24小 时后取样、离心，利用高效液相色谱法测定发酵液中的甘露醇产量， 甘露醇标准曲线如图5所示。如图5所示，以甘露醇的质量浓度(g/L) 为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，在0.625～10g/L范围内，甘 露醇的质量浓度与峰面积的线性关系良好，拟合度高。线性回归方程 为y＝264977.829387x-2619.569875相关系数R²＝0.999995。

诱变菌株与原菌株的甘露醇产量如表1、表2和表3所示。

表1柠檬明串珠菌95与诱变菌株的甘露醇产量

表2柠檬明串珠菌E28与诱变菌株的甘露醇产量

表3柠檬明串珠菌KM20与诱变菌株的甘露醇产量

由表可知，柠檬明串珠菌E28和KM20经诱变后，诱变菌株的甘 露醇产量均没有原菌株高，柠檬明串珠菌95经诱变后，三株诱变菌株 的甘露醇产量均高于原菌株，其中95-9菌株的甘露醇产量最高为 10.29g/L。

将诱变后得到的95-9菌株命名为柠檬明串珠菌HM1，在中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏(CGMCC No：14234)

实施例2：高产甘露醇诱变菌株的发酵条件

通过单因素和响应面试验对诱变菌株进行发酵条件优化，获得诱 变菌株产甘露醇的最佳发酵条件。

本实施方式中，柠檬明串珠菌HM1，由实施例1诱变筛选得到。

本实施方式中，作为基础发酵培养基(g/L)采用以下组合：蛋白胨 10，酵母膏5，柠檬酸铵2，磷酸氢二钠2，硫酸镁0.1，硫酸锰0.05， 果糖作为底物，pH6.5，121℃高压灭菌15min(果糖单独灭菌)

将经诱变后筛选得到的诱变菌株加入15％的甘油保藏于-80℃冰 箱中。待实验前将菌株在室温下解冻，接种一菌环的细胞在固体培养 基中划线活化，30℃倒置培养24h，4℃保藏用于后期实验。

取4℃保藏的平板，挑取单一菌落接种于20mL的MRS肉汤中， 30℃，120r/min条件下震荡培养12h，作为种子培养液。

将种子培养液以1％的接种量接种到装有100mL发酵培养基的 250mL锥形瓶中，30℃、120r/min震荡培养72h，发酵过程定期(0、4、 8、12、16、20、24、36、48、60、72h)取样测定甘露醇和果糖含量。

挑取活化好的单一菌落于20mLMRS肉汤中30℃培养12h，以1％ 的接种量接种到100mL液体培养基中，30℃静置培养，每隔4h测定菌 液的吸光度值(OD₆₀₀)和pH值，以时间为横坐标，吸光度值为纵坐标绘 制生长曲线。

本发明的实施方式中，对果糖质量浓度、氮源种类、氮源质量浓 度、发酵温度和发酵初始pH这五个因素做了单因素条件的优化，确定 诱变菌株发酵产甘露醇的较优条件。

保证基础发酵培养基中其余成分不变，将果糖质量浓度设置成 50g/L、100g/L、150g/L和200g/L。在初始pH6.5，30℃条件下发酵72h。 研究不同碳源质量浓度对菌株发酵产甘露醇的影响，确定较优的果糖 质量浓度，后续因素实验在前一个因素的较优条件下进行。

氮源种类对菌株发酵产甘露醇的影响

确定较优果糖质量浓度后，将基础发酵培养基中的有机氮源分别 替换为蛋白胨、酵母膏、牛肉膏和酪蛋白四种单一氮源，在不改变有 机氮源的添加量(15g/L)的前提下，以基础发酵培养基中的氮源为对照， 研究不同种类的单一氮源对菌株发酵产甘露醇的影响，确定较优的单 一氮源种类。

氮源质量浓度对菌株发酵产甘露醇的影响

确定较优氮源种类后，将氮源的质量浓度设置成7.5g/L、15g/L、 22.5g/L、30g/L、37.5g/L、45g/L，研究不同氮源质量浓度对菌株发酵 产甘露醇的影响，确定较优氮源质量浓度。

发酵温度对诱变菌株发酵产甘露醇的影响

确定较优的培养基成分后，对发酵条件进行优化。将发酵温度设 置成20℃、25℃、30℃、35℃、40℃，其余发酵条件不变，研究不同 发酵温度对菌株发酵产甘露醇的影响，确定较优的发酵温度。

发酵初始pH对诱变菌株发酵产甘露醇的影响

确定较优发酵温度后，将发酵的初始pH设置成5.0、5.5、6.0、 6.5、7.0、7.5，其余发酵条件不变，研究不同发酵初始pH对菌株发酵 产甘露醇的影响，确定较优的发酵初始pH。

综合单因素的试验结果，选取影响较大的三个因素，以60h发酵 液中的甘露醇产量为响应值，根据Box-Benhnken设计原理对诱变菌株 产甘露醇的发酵条件进行优化，试验结果利用Design-Expert 8.0进行分 析。

在本发明中，上述菌体生物量采用紫外分光光度计在600nm下测 定发酵液的吸光度值。

在本发明中，甘露醇、果糖含量测定中，测定方法与前述的甘露 醇产量的测定：高效液相色谱相同，因此不再详述。

在本发明中，甘露醇转化率的计算如下：

甘露醇转化率％＝X/Y×100％

式中：Y-果糖消耗量(g/L)

X-甘露醇含量(g/L)

在本发明中，甘露醇生产容量的计算如下：

生产容量g/L·h＝X/Y

式中：Y-发酵时间(h)

X-甘露醇含量(g/L)

如图6所示，以果糖的质量浓度(g/L)为横坐标，峰面积为纵坐标 绘制标准曲线，在0.625～10g/L范围内，果糖的质量浓度与峰面积的线 性关系良好，拟合度高。线性回归方程为y＝268711.4708817x– 1531.6026667相关系数R²＝0.9999996。

从图7中可以看出，95-9在0～4h处于迟缓期，4～16h处于对数期， 16h后进入稳定期，pH值起初时随着时间的延长不断下降，进入稳定 期后，保持平稳不变。适宜的接种龄有利于菌株的后期发酵和目标产 物的合成，一般来讲，接种龄以菌株生长对数期的后期为宜。从生长 曲线可以看出，95-9的对数期的后期在12～16h，故确定柠檬明串珠菌 95-9的接种龄为12h。

在本发明中，不同碳源质量浓度下，菌株发酵过程中的甘露醇和 果糖含量变化如图8的a部分和b部分所示。随着发酵时间的延长， 甘露醇的含量整体呈上升趋势，果糖的含量整体呈下降趋势，48h后趋 于平稳，说明菌株在早期生长阶段将果糖转化为甘露醇，在发酵后期 不消耗生成的甘露醇。发酵60h时，不同碳源质量浓度对甘露醇产量 的影响如表4所示。

表4碳源质量浓度对甘露醇产量的影响

注：同行肩标字母相同表示差异不显著(P＞0.05)，大写字母不同 表示差异极显著(P<0.01)，小写字母不同表示差异显著(P<0.05)，下表 同。

从表中可以看出，随着碳源质量浓度的升高，甘露醇的产量、果 糖转化率和生产容量呈先上升后下降的趋势，当浓度为150g/L时，三 项指标达到最大值，均显著高于其它浓度(P<0.01)。随着浓度继续升高， 甘露醇的产量下降，这可能是由于过高的果糖浓度抑制了菌株的生长， 从而导致果糖向甘露醇的转化降低。故确定较优的碳源质量浓度为150g/L。

在本发明中，不同氮源种类下，菌株发酵过程中的甘露醇和果糖 含量变化如图9的a部分和9的b部分所示。其变化趋势同碳源质量 浓度。发酵48h时，不同氮源种类对甘露醇产量的影响如表5所示。

表5氮源种类对甘露醇产量的影响

比较四种单一氮源对诱变菌株的甘露醇产量、果糖转化率和生产 容量的影响，蛋白胨组的甘露醇产量和生产容量显著高于其它组 (P<0.01)，虽然酪蛋白组的果糖转化率显著高于其他组(P<0.01)，但该 组的甘露醇产量和生产容量显著低于其它组(P<0.01)。综上所述，选择 蛋白胨为培养基中的有机氮源成分，并对蛋白胨的质量浓度做进一步 的优化。

在本发明中，不同氮源质量浓度下，菌株发酵过程中的甘露醇和 果糖含量变化如图10的a部分和b部分所示。其变化趋势同碳源质量 浓度。发酵60h时，不同氮源质量浓度对甘露醇产量的影响如表6所 示。

表6氮源质量浓度对甘露醇产量的影响

由表可知，菌株的甘露产量与生产容量随着氮源质量浓度的升高 而升高，当浓度高于30g/L时，各组间差异不显著；菌株的果糖转化率 整体呈下降趋势，浓度高于22.5g/L时，各组间差异不显著。当浓度为 30g/L时，虽然甘露醇的产量和生产容量未达到最大值，但甘露醇的产 量较最大值仅低了7.24％，影响不大，且此浓度下菌株的果糖转化率较 其后两组略有升高，因此考虑到成本问题，确定较优的氮源质量浓度 为30g/L。

在本发明中，不同温度条件下，菌株发酵过程中的甘露醇和果糖 含量变化如图11的a部分和b部分所示。其变化趋势同碳源质量浓度。 发酵60h时，不同温度对甘露醇产量的影响如表7所示。

表7发酵温度对甘露醇产量的影响

由表可知，菌株的甘露醇产量与生产容量随着温度的升高呈先上 升后下降的趋势，35℃与30℃两组间差异不显著，显著高于其它三组(P <0.01)。菌株的果糖转化率呈上升趋势，但相邻两种间差异不显著。当 温度为35℃时，菌株的甘露醇产量和生产容量最高，虽然果糖转化率 没有40℃组高，但两组间差异不显著，故确定较优的发酵温度为35℃。

在本发明中，不同发酵初始pH条件下，菌株发酵过程中的甘露醇 和果糖含量变化如图12的a部分和b部分所示。其变化趋势同碳源质 量浓度。发酵60h时，不同温度对甘露醇产量的影响如表3-5所示。

表8发酵初始pH对甘露醇产量的影响

由表可知，菌株的甘露醇产量与生产容量随着发酵初始pH的升高 呈上升趋势，pH为7.0和7.5两组间差异不显著，显著高于其它四组(P <0.01)。菌株的果糖转化率整体呈下降趋势，除pH为5.0组显著高于 其它组外，剩余五组间差异不显著。当pH为7.5时，虽然菌株的果糖 转化率不高，但甘露醇产量和生产容量显著高于5.0组，且为最高值， 故确定较优的发酵初始pH为7.5。

在本发明中，通过单因素试验对诱变菌株产甘露醇的发酵条件进 行初步优化，综合单因素试验结果，利用响应面试验，选取碳源质量 浓度(A)、温度(B)和发酵初始pH(C)这三个影响较大的因素做进一步的 优化，根据Box-Behnken优化原理进行方案设计与试验，试验因素与 水平如表9，方案组合与试验结果如表10。

表9响应面试验因素水平表

表10Box-Behnken试验设计与结果

本发明利用Design-Expert 8.0软件对表5中的数据进行二次回归 分析，得到回归模型方程为：

Y＝85.72+1.46A-19.59B-1.31C-6.16AB-3.16AC-2.41BC-15.27A²-20. 59B²-10.16C²

方差分析结果如表11。

表11二次回归方程方差分析

注：**，影响极显著(P<0.01)；*，影响显著(P<0.05)。

由表6可知，二次回归模型极显著(P<0.0001)，矢拟项不显著，说 明该模型能有效的反应甘露醇的产量变化。模型的决定系数R²＝0.998 2，说明响应值与因素之间的线性关系显著；校正决定系数R² _Adj＝0.995 9，表明该模型能够反映99.59％的响应值的变化。变异系数(2.08)较低， 信噪比高(58.829>4)，说明模型的可信度高。综合以上试验结果，利用该模型可以较好的对甘露醇的产量变化进行分析和预测。

从表6中可以看出，一次项B影响极显著(P<0.01)，A、C影响显 著(P<0.05)，其影响程度大小为：B(温度)>A(碳源质量浓度)>C(发酵初 始pH)。二次项A²、B²、C²影响极显著。交互项AB、AC和BC影响 均极显著(P<0.01)，说明碳源质量浓度、温度和发酵初始pH之间的两两交互作用对菌株的甘露醇产量的影响很大。

在本发明中，碳源质量浓度、温度和发酵初始pH之间的交互作用 对甘露醇产量的影响如图13、14、15所示。观察各因素的交互作用与 响应值构成的三维空间曲面图，曲面越陡峭，则代表该因素对响应值 的影响越大。等高线的形状反应了两因素之间的交互作用的显著程度， 两因素交互作用显著，则图形为椭圆形，两因素交互作用不显著，则 图形为圆形。从响应面图中可以看出，温度和碳源质量浓度对响应值 的影响较大，发酵初始pH的影响较小，从等高线图可以看出，碳源质 量浓度与温度之间的交互作用最为显著，其次是碳源质量浓度和发酵 初始pH。

通过二次回归模型求得甘露醇产量的最大值，其发酵条件为：碳 源质量浓度157.51g/L、温度32.52℃、发酵初始pH7.49，该条件下， 甘露醇产量的预测值为90.71g/L。为验证模型的可靠性，在最佳发酵条 件下进行发酵试验，考虑到实际操作问题，将发酵条件修正为：碳源 质量浓度158g/L、温度33℃，发酵初始pH7.50，在该条件下进行5次 平行试验，最终甘露醇的产量为88.03g/L，接近预测值，说明该模型可 有效的反映各因素对响应值的变化。较优化前(83.51g/L)，甘露醇的产 量提高了5.41％。

Claims (12)

1.一种高产甘露醇的柠檬明串株菌HM1，其特征在于，以甲基磺酸乙酯(EMS)作为化学诱变剂，诱变柠檬明串珠菌。

2.根据权利要求1所述的高产甘露醇的柠檬明串株菌HM1，其特征在于，通过磷酸转酮酶途径代谢生成甘露醇。

3.根据权利要求1所述的高产甘露醇的柠檬明串株菌HM1，其特征在于，所述EMS的浓度为0.5～1％的范围，处理时间为15-60分钟。

4.根据权利要求3所述的高产甘露醇的柠檬明串株菌HM1，其特征在于，所述EMS处理条件为0.5％EMS，处理45min。

5.根据权利要求1所述的高产甘露醇的柠檬明串株菌HM1，其特征在于，所述诱变柠檬明串珠菌经果糖的改良MRS-果糖培养基中发酵培养得到。

6.根据权利要求5所述的高产甘露醇的柠檬明串株菌HM1，其特征在于，所述果糖质量浓度设置成50g/L～200g/L的范围。

7.根据权利要求5所述的高产甘露醇的柠檬明串株菌HM1，其特征在于，所述发酵温度选自20℃～40℃的范围。

8.根据权利要求5所述的高产甘露醇的柠檬明串株菌HM1，其特征在于，所述发酵的初始pH设置成5.0～7.5的范围。

9.根据权利要求5所述的高产甘露醇的柠檬明串株菌HM1，发酵条件为：所述果糖质量浓度157.51g/L、温度32.52℃、发酵初始pH7.49。

10.一种权利要求1至9中任一项所述的柠檬明串珠菌HM1菌株在食品医药化工中的应用。

11.一种制备甘露醇的方法，其特征在于，包括利用权利要求1至9中所述柠檬明串珠菌HM1的发酵步骤。

12.一种根据权利要求10所述的方法制备的甘露醇在食品医药化工中的应用。