CN103992978A - 一株假肠膜明串珠菌及其联产右旋糖酐和甘露醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株假肠膜明串珠菌（Leuconostocpseudomesenteroides）菌株和该菌株联产右旋糖酐和甘露醇的方法，该菌株具有同时高效生产右旋糖酐和甘露醇的性能。本发明的假肠膜明串珠菌分类命名为LeuconostocpseudomesenteroidesG123，其保藏登记号为CCTCCNO：M2014115。本发明通过进化代谢进一步的筛选得到一株同时具有高效制备右旋糖苷和甘露醇的菌株G123，其单批发酵得右旋糖苷粗品含量34.0g/l，生产强度达3.778g/l/h。其单批发酵得甘露醇浓度39.70g/l，甘露醇生产强度达到了4.411g/l/h，比出发菌株的甘露醇生产强度（2.533g/l/h）提高了1.7倍。本发明所述的该菌株具有同时高效生产右旋糖酐和甘露醇的性能，应用前景十分广阔。
Description
技术领域
本发明涉及生物发酵技术领域，具体涉及一株假肠膜明串珠菌及其联产右旋糖酐和甘露醇的方法。
背景技术
微生物多糖可以分成三种不同类型：胞内储存多糖；胞壁多糖，也叫结构多糖；胞外多糖，以包裹着微生物细胞的荚膜形式或以无定型物质形式分泌到周围培养液中。胞内和胞壁多糖由于提取困难而成本高，开发的品种比较少，大规模工业化生产的微生物多糖大多是胞外多糖。近年来人们大量研究并投入商业化的胞外多糖有很多，如黄原胶、结冷胶、热凝胶、威兰胶、右旋糖酐等。
右旋糖酐（dextran）又名葡聚糖，是一种高聚葡萄糖，其主链主要是由α-1,6-键连接组成（占总化学键的50%以上）。在α-D-葡聚糖糖苷键中，也有α-1,2、α-1,3、α-1,4连接的支链。右旋糖酐的结构是由微生物生产菌株所决定的。某些乳酸菌可以发酵产生右旋糖酐，特别是链球菌和肠膜明串珠菌。肠膜明串珠菌产生的右旋糖酐可以作为临床、制药、研究和商业用途的化学制品，因而具有很大的商业价值。
甘露醇是六碳糖醇化合物，甜度只有蔗糖的一半。相比其他糖类，如蔗糖、乳糖、葡萄糖和果糖，甘露醇具有低热量的优点，同时甘露醇在代谢过程中不需要胰岛素的参与，是糖尿病人食品甜味剂的最佳替代品。肠膜明串珠菌在发酵蔗糖生产右旋糖酐的过程中，葡聚糖蔗糖酶首先将蔗糖分子水解成葡萄糖和果糖，并聚合葡萄糖糖形成右旋糖酐，果糖进入细胞代谢生成甘露醇。
发明内容
本发明的第一目的是提供一株新的高效制备右旋糖酐和甘露醇的假肠膜明串珠菌。
本发明的第二目的是提供一种利用上述菌株产右旋糖酐和甘露醇的方法。
为实现本发明的第一目的，本发明采用的技术方案如下：
一、一株联产右旋糖苷和甘露醇的菌株，其特征在于，其分类命名为假肠膜明串珠菌G123（Leuconostoc pseudomesenteroides G123），已于2014年4月3日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，其保藏登记号为CCTCC NO：M 2014115。
二、为实现本发明的第二目的提供的技术方案具体如下：
本发明的发酵方法包括如下步骤：
（1）种子液培养：
平板培养：取适量Leuconostoc pseudomesenteroides G123菌液划线至平板上好氧培养，培养温度30 ℃，培养时间16~24 h。
一级种子培养：取平板上单菌落接种于装液量为5 ml试管中，30℃、200 rpm培养12-14 h。
二级种子培养：以1%的接种量从一级种子液转接至装液量为150 ml的500 ml三角瓶中，30℃，200 rpm，培养8-10 h。
（2）发酵罐培养：将二级种子液以6%接种量接种至7L发酵罐中，装液量为2.5 L，空气通气量1 vvm，调节初始pH 6.0~ 7.5，控制pH不低于5.0或者5.5，加入蔗糖浓度20~100 g/l， 30℃，发酵培养时间为12~24 h。
（3）提取：
取步骤（2）所得的发酵液于离心管中，离心去除菌体。加入三氯乙酸（TCA）去除蛋白，离心后于上清液中加入冷乙醇。离心得沉淀物，40~60℃下干燥得右旋糖酐粗提物。所得的上清液利用旋转真空蒸发器去除乙醇，然后冷冻结晶得甘露醇粗品。
优选的，所述步骤（2）中pH的初始值为7.0。
优选的，所述步骤（2）中控制pH不低于5.0。
优选的，所述步骤（2）中的蔗糖浓度为80g/l。
优选的，所述步骤（3）所述的发酵液离心条件是9,000rpm、10 min，当初始蔗糖浓度大于40 g/l时，发酵液离心前需要稀释2~3倍。
优选的，所述步骤（3）加入TCA的终浓度控制在0.1%~0.2%。
优选的，所述步骤（3）中加入冷乙醇的量是上清液的2~3倍，离心条件9,000 rpm，10 min。
优选的，所述步骤（3）中冷冻结晶的条件是4℃。
本发明的积极进步效果在于：
本发明所述生产的右旋糖酐无色，在低浓度具有很好的粘度。本发明中该菌能高效获得右旋糖酐和甘露醇，其右旋糖苷粗品含量达34.0 g/l，生产强度达3.778 g/l/h，其甘露醇浓度达39.70 g/l，甘露醇生产强度达到了4.411 g/l/h，比出发菌株（2.533 g/l/h）提高了1.7倍，应用前景十分广阔。
附图说明
以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。
图1：原始菌株以初蔗糖为100 g/l，不调控pH，30℃的7L发酵罐发酵结果。
图2：筛选菌株以初蔗糖为100 g/l，不调控pH，30℃的7L发酵罐发酵结果。
图3: 筛选菌株以初蔗糖为100 g/l，不调控pH，30℃的7L发酵罐生物量和pH发酵结果。
图4：不同初始pH 6.0、6.5、7.0、7.5条件下对筛选菌株细胞生物量的影响。
图5：不同初始pH 6.0、6.5、7.0、7.5条件下对筛选菌株右旋糖酐和甘露醇的影响。
图6：不同最低pH 5.0、 5.5条件下对筛选菌株右旋糖酐和甘露醇的影响。
图7：不同初始蔗糖浓度20 g/l、40 g/l、60 g/l、80 g/l、100 g/l条件下对筛选菌株右旋糖酐和甘露醇的影响。
本发明提供的假肠膜明串珠菌（Leuconostocpseudomesenteroides）菌株，已于2014年4月3日保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏地址：武汉大学保藏中心，邮编：430072；该菌株的保藏编号为：CCTCC NO：M 2014115。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法的条件。本发明中，所述的制备方法可以是将所述的假肠膜明串珠菌按照现有技术内常规的培养方法培养得到发酵液，然后将发酵液采用常规的多糖分离方法分离得到右旋糖酐。本发明对常规方法的做了进一步优化，以得到最优的技术效果。
实施例1本实施例说明本发明所述的Leuconostoc pseudomesenteroidesG123的筛选方法。
将假肠膜明串珠菌Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC12291（购买于美国模式培养物寄存库ATCC）活化，培养温度30℃，500 ml 三角瓶装液量为150 ml，培养时间8-10 h，得到生长旺盛、菌体粗壮的菌液；接入装液量200～300 ml的自制连续培养装置中（本发明人团队在先专利申请，专利申请公开号CN101709263A），接种量为6%（v/v），培养8-10 h后，维持pH 5.0以上，流加含蔗糖的新鲜培养基驯化选育。随着蔗糖浓度的不断增加，菌株的OD不断增加，发酵液粘度不断增加，需要逐步提高稀释倍数，到蔗糖浓度升高到40 g/l时，传代改为取出一定菌液接种到新鲜培养基中，维持pH 5.0以上，到OD不再增长后继续传代。取中间驯化时间的菌液，涂布平板，进行罐子发酵筛选出耗糖速率增加的菌株。
在筛选方法中，所使用的培养基配方：
（1）固体平板培养基：蛋白胨10 g/l、牛肉膏10 g/l、酵母膏5 g/l、乙酸钠5 g/l、柠檬酸三铵2 g/l、磷酸氢二钾2 g/l、七水合硫酸镁0.2 g/l、一水合硫酸锰0.05 g/l、吐温-80 1 ml/l、琼脂2 g/l、蔗糖 20 g/l。
（2）种子培养基：蛋白胨10 g/l、牛肉膏10 g/l、酵母膏5 g/l、乙酸钠5 g/l、柠檬酸三铵2 g/l、磷酸氢二钾2 g/l、七水合硫酸镁0.2 g/l、一水合硫酸锰0.05 g/l、吐温-80 1 ml/l、蔗糖 20 g/l。
（3）发酵培养基：蛋白胨10 g/l、牛肉膏10 g/l、酵母膏5 g/l、乙酸钠5 g/l、柠檬酸三铵2 g/l、磷酸氢二钾2 g/l、七水合硫酸镁0.2 g/l、一水合硫酸锰0.05 g/l、吐温-80 1 ml/l、蔗糖 100 g/l。
筛选步骤：
1、平板初筛
将连续培养装置中驯化筛选得到的菌液稀释至OD 600=0.1～1.0涂布于平板上好氧培养，培养温度30 ℃，培养时间6~8 h。
2、摇瓶复筛
种子培养：取平板上短时间内生长良好地单菌落接种于装液量为5 ml试管中，30℃、200 rpm培养12-14 h。
摇瓶发酵：以1%的接种量将种子液转接至装液量为150 ml的500 ml三角瓶中，30℃，200 rpm，培养8-10 h，复筛出耗糖速率较快的菌株。
3、罐子发酵筛选
将复筛出的菌株接入种子培养基扩大培养，以6%接种量接种至7L发酵罐中，装液量为2.5 L，空气通气量1 vvm，30℃，发酵培养12~24 h。最终得到一株能较快利用蔗糖的菌株，命名为Leuconostoc pseudomesenteroides G123。
相比较于原始菌株12 h内耗100 g/l的蔗糖仍有56.2 g/l的残糖，如附图1，菌株Leuconostoc pseudomesenteroides G123发酵结果如附图2，可在5 h将100 g/l蔗糖消耗完毕，菌株Leuconostoc pseudomesenteroides G123的生物量和pH发酵结果见图3。
实施例2本实施例具体说明菌株Leuconostoc pseudomesenteroides G123发酵生产右旋糖酐和甘露醇的方法
（1）种子液培养：
平板培养：取适量Leuconostoc pseudomesenteroides G123菌液划线至平板上好氧培养，培养温度30 ℃，培养时间16 h。
一级种子培养：取平板上单菌落接种于装液量为5 ml试管中，30℃、200 rpm培养14 h。
二级种子培养：以1%的接种量从一级种子液转接至装液量为150 ml的500 ml三角瓶中，30℃，200 rpm，培养10 h。
（2）发酵罐培养：
将种子液以6%接种量接种至7 L发酵罐中，装液量为2.5 L，空气通气量1 vvm，初始蔗糖浓度为100 g/l，30℃，发酵20 h。
该菌株G123在5h内可将100g/l的蔗糖消耗完毕，右旋糖酐粗品含量为32.2 g/l，甘露醇浓度为 36.10 g/l，甘露醇的生产强度为2.578 g/l/h，相比较于原始菌株发酵12h内还剩余56.2g/l蔗糖，甘露醇浓度提高了2.2倍，甘露醇的生产强度提高了1.9倍。
实施例3本实施例说明对不同初始pH条件的制备右旋糖酐和甘露醇方法。
（1）种子液培养：
平板培养：取适量Leuconostoc pseudomesenteroides G123菌液划线至平板上好氧培养，培养温度30 ℃，培养时间24 h。
一级种子培养：取平板上单菌落接种于装液量为5 ml试管中，30℃、200 rpm培养12 h。
二级种子培养：以1%的接种量从一级种子液转接至装液量为150 ml的500 ml三角瓶中，30℃，200 rpm，培养8。
（2）发酵罐培养：
将种子液以6%接种量接种至7 L发酵罐中，装液量为2.5 L，空气通气量1 vvm，初始蔗糖浓度为80 g/l。调节初始pH 6.0、6.5、7.0、7.5，30℃，发酵30 h。
（3）提取
称取步骤（2）所得的发酵液3g于离心管中，稀释3倍，9,000 rpm，10 min离心去除菌体。加入终浓度为0.1% 三氯乙酸（TCA）去除蛋白，震荡10 min后，9,000 rpm，10 min离心后于上清液中加入冷乙醇。加入冷乙醇的量是上清液的2倍，静置10 min，9,000 rpm，10 min离心得沉淀物，50~55℃下干燥至恒重得右旋糖酐粗提物。所得的上清液利用旋转真空蒸发器去除乙醇，然后在4℃下冷冻结晶得甘露醇粗品。
细胞生长情况见图4，pH 7.0、pH 7.5生长情况较pH 6.0、pH 6.5好，较佳的选择pH 7.0。
所获得的发酵液中右旋糖酐粗品含量为29~33 g/l，甘露醇浓度为29.25~34.05 g/l，结果见图5。初始pH为6.0的发酵液中右旋糖酐粗品含量为27 g/l，甘露醇浓度为29.25 g/l。初始pH为6.5的发酵液中右旋糖酐粗品含量为29 g/l，甘露醇浓度为30.47 g/l。初始pH为7.0的发酵液中右旋糖酐粗品含量为33 g/l，甘露醇浓度为34.05 g/l。初始pH为7.5的发酵液中右旋糖酐粗品含量为31 g/l，甘露醇浓度为31.53 g/l。由此可见，最佳的初始pH为7.0，发酵时间调整到24 h。
实施例4本实施例说明在初始pH 7.0条件下，控制发酵过程中pH不低于5.0或者5.5制备右旋糖酐和甘露醇的方法。
（1）平板培养：取适量Leuconostoc pseudomesenteroides G123菌液划线至平板上好氧培养，培养温度30 ℃，培养时间20 h。
（2）一级种子培养：取平板上单菌落接种于装液量为5 ml试管中，30℃、200 rpm培养14 h。
（3）二级种子培养：以1%的接种量从一级种子液转接至装液量为150 ml的500 ml三角瓶中，30℃，200 rpm，培养10 h。
（4）将种子液以6%接种量接种至7 L发酵罐中，装液量为2.5 L，空气通气量1 vvm，初始pH 7.0，控制pH不低于5.0或者5.5，加入蔗糖100 g/l， 30℃，发酵培养时间为16 h。
所获得的发酵液中右旋糖酐粗品含量为32~34 g/l，甘露醇浓度为34.31~ 39.57 g/l，结果见图6。控制pH不低于5.0的发酵液中右旋糖酐粗品含量为34 g/l，甘露醇浓度为39.57 g/l，甘露醇的生产强度为4.396 g/l/h。控制pH不低于5.5的发酵液中右旋糖酐粗品含量为32 g/l，甘露醇浓度为34.31 g/l, 甘露醇的生产强度为3.813 g/l/h。由此可见，最佳的pH控制在不低于5.0。
实施例5本实施例说明在初始pH 7.0，控制发酵过程pH不低于5.0的条件下，不同初始蔗糖浓度下制备右旋糖酐和甘露醇的方法。
（1）平板培养：取适量Leuconostoc pseudomesenteroides G123菌液划线至平板上好氧培养，培养温度30 ℃，培养时间18 h。
（2）一级种子培养：取平板上单菌落接种于装液量为5 ml试管中，30℃、200 rpm培养12-14 h。
（3）二级种子培养：以1%的接种量从一级种子液转接至装液量为150 ml的500 ml三角瓶中，30℃，200 rpm，培养9 h。
（4）将种子液以6%接种量接种至7L发酵罐中，装液量为2.5 L，空气通气量1 vvm，初始pH 7.0，控制pH不低于5.0，加入初始蔗糖浓度20~100 g/l， 30℃，发酵培养时间为20h。
所获得的发酵液中右旋糖酐粗品含量为16.17~34.0 g/l，甘露醇浓度为12.01~34.0 g/l，结果见图7。蔗糖浓度20 g/l的发酵液中右旋糖酐粗品含量为22 g/l，甘露醇浓度为12.01 g/l，甘露醇的生产强度为1.712 g/l/h，是同等条件下培养的出发菌株的1.6倍。蔗糖浓度40 g/l的发酵液中右旋糖酐粗品含量为16.17 g/l，甘露醇浓度为20.37 g/l, 甘露醇的生产强度为3.009 g/l/h，是同等条件下培养的出发菌株的1.5倍。蔗糖浓度60 g/l的发酵液中右旋糖酐粗品含量为33.5 g/l，甘露醇浓度为23.77 g/l，甘露醇的生产强度为3.396 g/l/h，是同等条件下培养的出发菌株的1.7倍。蔗糖浓度80 g/l的发酵液中右旋糖酐粗品含量为34.0 g/l，甘露醇浓度为39.70 g/l，甘露醇的生产强度为4.411 g/l/h，是同等条件下培养的出发菌株的1.7倍。蔗糖浓度100 g/l的发酵液中右旋糖酐粗品含量为32.2 g/l，甘露醇浓度为33.32 g/l，甘露醇的生产强度为3.332 g/l/h，是同等条件下培养的出发菌株的1.6倍。由此可见，最佳的初始蔗糖浓度是80 g/l。
Claims (9)
1.一株联产右旋糖苷和甘露醇的菌株，其特征在于，其分类命名为假肠膜明串珠菌G123（Leuconostoc pseudomesenteroides G123），已于2014年4月3日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，其保藏登记号为CCTCC NO：M 2014115。
2. 一种利用权利要求1所述的假肠膜明串珠菌G123联产右旋糖酐和甘露醇的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）种子液培养：
平板培养：取适量假肠膜明串珠菌G123菌液划线至平板上好氧培养，培养温度30 ℃，培养时间16~24 h；
一级种子培养：取平板上单菌落接种于装液量为5 ml试管中，30℃、200 rpm培养12-14 h；
二级种子培养：以1%的接种量从一级种子液转接至装液量为150 ml的500 ml三角瓶中，30℃，200 rpm，培养8-10 h；
（2）发酵罐培养：
将二级种子液以6%接种量接种至7 L发酵罐中，装液量为2.5 L，空气通气量1 vvm，调节初始pH 6.0~ 7.5，控制pH不低于5.0或者5.5，加入蔗糖浓度20~100 g/l， 30℃，发酵培养时间为12~24 h；
（3）提取：
取步骤（2）所得的发酵液于离心管中，离心去除菌体；
加入三氯乙酸（TCA）去除蛋白，离心后于上清液中加入冷乙醇；
离心得沉淀物，40~60℃下干燥得右旋糖酐粗提物；
所得的上清液利用旋转真空蒸发器去除乙醇，然后冷冻结晶得甘露醇粗品。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中pH的初始值为7.0。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中控制pH不低于5.0。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中的蔗糖浓度为80g/l。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中的发酵液离心条件是9,000rpm、10 min，当初始蔗糖浓度大于40 g/l时，发酵液离心前需要稀释2~3倍。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）加入TCA的终浓度控制在0.1%~0.2%。
8. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述步骤（3）中加入冷乙醇的量是上清液的2~3倍，离心条件9,000 rpm，10 min。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）中冷冻结晶的条件是4℃。
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