CN105087715A - 一种联产右旋糖酐和乙醇的方法 - Google Patents

一种联产右旋糖酐和乙醇的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种联产右旋糖酐和乙醇的方法，该方法包括：在发酵培养基中加入肠膜明串珠菌培养后进行菌体分离，得到菌体和发酵上清液；将所述发酵上清液与乙醇混合，使得发酵上清液中的右旋糖酐沉淀析出，然后分离得到右旋糖酐和滤清液；将所述滤清液蒸馏回收乙醇，得到蒸馏剩余液；将菌体高温灭活后与所述蒸馏剩余液的一部分混合，得到种子培养基，将所述蒸馏剩余液的另一部分作为扩大培养基；将运动发酵单胞菌接种到所述种子培养基中培养得到种子液，并将所述种子液接种到所述扩大培养基中进行乙醇发酵。本发明能够利用右旋糖酐生产废水作为种子培养基，并且实现右旋糖酐生产废水的达标排放。

Description

一种联产右旋糖酐和乙醇的方法
技术领域
本发明涉及生物工程领域，具体地，涉及一种联产右旋糖酐和乙醇的方法。
背景技术
右旋糖酐是一种高分子葡萄糖聚合物，是目前最佳的血浆代用品之一。临床上常用的有中分子右旋糖酐，主要用作血浆代用品，用于出血性休克、创伤性休克及烧伤性休克等。低、小分子右旋糖酐，能改善微循环，预防或消除血管内红细胞聚集和血栓形成等，亦有扩充血容量作用，但作用较中分子右旋糖酐短暂；用于各种休克所致的微循环障碍、弥漫性血管内凝血、心绞痛、急性心肌梗塞及其他周围血管疾病等。右旋糖酐同时还普遍应用于轻工食品等众多行业，如乳化剂、增稠剂、高粘度胶水、炸药、纸品生产中的反絮凝剂、石油的二次回收、钻井添加剂、土壤改良剂和外科手术缝线等。
右旋糖酐的生产有很多方法，目前工业上比较成熟的生产方法是采用肠膜明串珠菌的微生物直接发酵法。该方法包括将含有100-150g/L的高浓度蔗糖以及需要量的蛋白胨、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾的培养基在接种肠膜明串珠菌Lm-31208的条件下进行发酵，在发酵过程中，高浓度的蔗糖水解为葡萄糖和果糖，其中葡萄糖参与右旋糖酐的形成，而果糖则作为副产物在残留在发酵液中，由此得到含有右旋糖酐、副产物果糖、杂质和菌体的发酵液。发酵液中的右旋糖酐的提取步骤一般包括：将发酵液中的菌体过滤除去，然后加入乙醇使得右旋糖酐以沉淀的形式得到过滤分离，过滤得到的滤液中含有大量的果糖和乙醇，其中乙醇经蒸馏得以回收使用，而蒸馏剩余的液体即成为右旋糖酐的生产废水。由于右旋糖酐的生产废水中含有大量的果糖，并且还含有其它的由肠膜明串珠菌发酵产生的废弃物，右旋糖酐的生产废水的COD和BOD都非常高而且难于进行废水无害化处理。
发明内容
本发明的发明人发现运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)ZM4菌株能够利用右旋糖酐生产废水作为培养基，进行乙醇发酵，从而将右旋糖酐生产废水中的副产物果糖以及残留的蔗糖和葡萄糖转化为乙醇。但是，本发明的发明人在将上述方案放大进行的过程中发现，运动发酵单胞菌ZM4菌株对种子液培养基的要求较高，即运动发酵单胞菌ZM4菌株需要在含有10g/L酵母提取物和20g/L的蔗糖的种子液培养基中活化培养24h为种子液后，并且以1:10的接种比接种到右旋糖酐生产废水中，才能实现将右旋糖酐生产废水中的副产物果糖以及残留的蔗糖和葡萄糖转化为乙醇；如果将种子液培养基更换为成本更低的培养基，例如更换为右旋糖酐生产废水本身，则存在右旋糖酐生产废水处理效率极低的缺陷。
本发明的发明人对运动发酵单胞菌ZM4菌株进行了多轮改良，出乎意料地得到了一株运动发酵单胞菌菌株，该菌株在种子培养阶段能够直接利用右旋糖酐生产废水作为种子培养基，并且得到的种子培养液以1:100的接种比接种到右旋糖酐生产废水中后能够以较高的效率处理右旋糖酐生产废水；由此得到了本发明。
本发明提供了一种联产右旋糖酐和乙醇的方法，该方法包括如下步骤：(1)在含蔗糖的发酵培养基中加入肠膜明串珠菌(Leuoconostocmesenteroides)种子液进行产右旋糖酐的发酵培养，得到第一发酵液；(2)将所述第一发酵液进行菌体分离，得到菌体和发酵上清液；(3)将所述发酵上清液与乙醇混合，使得发酵上清液中的右旋糖酐沉淀析出，然后分离得到右旋糖酐和滤清液；(4)将所述滤清液蒸馏回收乙醇，得到蒸馏剩余液；(5)将步骤(2)中的菌体高温灭活后与所述蒸馏剩余液的一部分混合，得到种子培养基，将所述蒸馏剩余液的另一部分作为扩大培养基；(6)将保藏编号为CGMCCNO.10946的运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)接种到所述种子培养基中培养得到种子液，并将所述种子液接种到所述扩大培养基中进行乙醇发酵，得到乙醇发酵液；然后从所述乙醇发酵液中提取乙醇。
通过上述技术方案，本发明能够利用右旋糖酐生产废水作为种子培养基，并且得到的种子培养液以1:100的接种比接种到右旋糖酐生产废水中后能够以较高的效率处理右旋糖酐生产废水。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
生物材料保藏
本文对比例中涉及的一种运动发酵单胞菌由实验室模式运动发酵单胞菌经诱变和筛选得到。该菌株分类命名为运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)，其保藏编号为CGMCCNo.9987，保藏日期为2014年11月18日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
本发明的运动发酵单胞菌由保藏编号为CGMCCNo.9987的运动发酵单胞菌经诱变和筛选得到。该菌株分类命名为运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)，其保藏编号为CGMCCNO.10946，保藏日期为2015年06月02日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明提供了一种联产右旋糖酐和乙醇的方法，该方法包括如下步骤：(1)在含蔗糖的发酵培养基中加入肠膜明串珠菌(Leuoconostocmesenteroides)种子液进行产右旋糖酐的发酵培养，得到第一发酵液；(2)将所述第一发酵液进行菌体分离，得到菌体和发酵上清液；(3)将所述发酵上清液与乙醇混合，使得发酵上清液中的右旋糖酐沉淀析出，然后分离得到右旋糖酐和滤清液；(4)将所述滤清液蒸馏回收乙醇，得到蒸馏剩余液；(5)将步骤(2)得到的菌体高温灭活后与所述蒸馏剩余液的一部分混合，得到种子培养基，将所述蒸馏剩余液的另一部分作为扩大培养基；(6)将保藏编号为CGMCCNO.10946的运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)接种到所述种子培养基中培养得到种子液，并将所述种子液接种到所述扩大培养基中进行乙醇发酵，得到乙醇发酵液；然后从所述乙醇发酵液中提取乙醇。
其中，含蔗糖的发酵培养基可以为常规的用于生产右旋糖酐的培养基，例如，含蔗糖的发酵培养基可以含有100-150g/L的蔗糖以及1-3g/L的蛋白胨、1-2g/L的磷酸氢二钠和0.1-0.8g/L的磷酸二氢钾。
其中，所述肠膜明串珠菌(Leuoconostocmesenteroides)可以为各种能够商购得到的用于生产右旋糖酐的肠膜明串珠菌(Leuoconostocmesenteroides)，例如可以为购自甘肃省科学院生物研究所的肠膜明串珠菌Lm-31208，还可以为购自ATCC的编号为10830的肠膜明串珠菌。
其中，产右旋糖酐的发酵培养的条件可以为常规的选择，例如，发酵温度为23-27℃，发酵时间为10-30小时。
其中，将所述第一发酵液进行菌体分离的方法可以为常规的离心和/或过滤。其中，分离得到右旋糖酐和滤清液的方法可以为常规的离心和/或过滤。
其中，使得发酵上清液中的右旋糖酐沉淀析出所用的乙醇的终浓度可以在较大范围内根据所需制备的右旋糖酐分子量而变化，例如可以为40-80体积％。其中，所述右旋糖酐的分子量可以在1万至20万的范围内变化。
其中，高温灭活步骤(2)得到的菌体的目的是使得种子液培养阶段和乙醇发酵阶段避免肠膜明串珠菌的干扰，并且将肠膜明串珠菌的菌体释放的物质作为运动发酵单胞菌的营养物质，高温灭活步骤(2)得到的菌体的条件没有特别的要求，例如可以包括：温度为115-123℃，压力为0.16-0.22MPa。
其中，制备所述种子培养基所用的高温灭活后的步骤(2)得到的菌体和制备所述种子培养基所用的所述蒸馏剩余液的重量比可以根据菌体产量和蒸馏剩余液的产量进行调节，优选为1:(50-500)，更优选为1：(100-250)。
其中，将保藏编号为CGMCCNO.10946的运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)接种到所述种子培养基中的接种浓度可以是较低的接种浓度，例如可以为102-104CFU/mL。
其中，所述种子液中，保藏编号为CGMCCNO.10946的运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)的菌体浓度可以为109-1011CFU/mL。其中，可以通过调整培养得到种子液的培养条件来调节得到的种子液中的菌体浓度，例如可以通过增加培养得到种子液的培养时间来调节得到的种子液中的菌体浓度。
其中，所述种子液接种到所述扩大培养基时，所述种子液与所述扩大培养基的体积比可以为常规的选择，例如为1:(10-100)。
其中，培养得到种子液的培养条件可以包括：温度为28-33℃，时间为15-30小时；优选地，温度为29-31℃，时间为22-26小时。
其中，进行乙醇发酵的发酵条件可以包括：温度为28-33℃，时间为50-120小时；优选地，温度为29-31℃，时间为80-100小时。
其中，进行乙醇发酵后，乙醇的浓度可以为10-40g/L，优选为20-30g/L。进行乙醇发酵后的物料可以进行乙醇蒸馏以获得乙醇，蒸馏剩余液的总糖浓度可以低于1重量％，可以直接排放。
以下通过实施例进一步详细说明本发明。
实施例1
将蔗糖、蛋白胨、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾以及水混合，得到含有130g/L的蔗糖以及2g/L的蛋白胨、1.5g/L的磷酸氢二钠和0.4g/L的磷酸二氢钾的含蔗糖的发酵培养基。
将购自ATCC的编号为10830的肠膜明串珠菌接种到上述含蔗糖的发酵培养基中，接种的浓度为104CFU/mL，在25℃下发酵24小时，得到第一发酵液。将所述第一发酵液在800×g的离心速度下离心，离心得到沉淀为菌体，上层液体为发酵上清液。在发酵上清液中加入乙醇，使得乙醇的终浓度为55体积％，发酵上清液中的右旋糖酐得到沉淀，剩下滤清液。将滤清液进行蒸馏，以回收滤清液中的乙醇，得到蒸馏剩余液。将如上获得的菌体在121℃，0.2MPa条件下进行高温灭活15分钟，然后得到的菌体高温灭活后与所述蒸馏剩余液的一部分混合，得到种子培养基，高温灭活后的步骤(2)得到的菌体和制备所述种子培养基所用的所述蒸馏剩余液的重量比为1:180；将所述蒸馏剩余液的另一部分作为扩大培养基。将保藏编号为CGMCCNO.10946的运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)接种到所述种子培养基中培养得到种子液，其中，接种的浓度为103CFU/mL，培养温度为31℃，培养时间为24小时，得到的种子液中的菌体浓度为1010CFU/mL。将种子液接种到所述扩大培养基，并进行乙醇发酵，所述种子液与所述扩大培养基的体积比为1:100，发酵的温度为30℃，发酵的时间为90小时，得到乙醇发酵的产物中，乙醇的浓度为29g/L，总糖浓度为0.9重量％。
对比例1
将蔗糖、蛋白胨、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾以及水混合，得到含有130g/L的蔗糖以及2g/L的蛋白胨、1.5g/L的磷酸氢二钠和0.4g/L的磷酸二氢钾的含蔗糖的发酵培养基。
将购自ATCC的编号为10830的肠膜明串珠菌接种到上述含蔗糖的发酵培养基中，接种的浓度为104CFU/mL，在25℃下发酵24小时，得到第一发酵液。将所述第一发酵液在800×g的离心速度下离心，离心得到沉淀为菌体，上层液体为发酵上清液。在发酵上清液中加入乙醇，使得乙醇的终浓度为55体积％，发酵上清液中的右旋糖酐得到沉淀，剩下滤清液。将滤清液进行蒸馏，以回收滤清液中的乙醇，得到蒸馏剩余液。将如上获得的菌体在121℃，0.2MPa条件下进行高温灭活15分钟，然后得到的菌体高温灭活后与所述蒸馏剩余液的一部分混合，得到种子培养基，高温灭活后的步骤(2)得到的菌体和制备所述种子培养基所用的所述蒸馏剩余液的重量比为1:180；将所述蒸馏剩余液的另一部分作为扩大培养基。将购自ATCC的编号为31281的运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)ZM4菌株接种到所述种子培养基中进行培养得到种子液，其中，接种的浓度为103CFU/mL，培养温度为31℃，培养时间为24小时，得到的种子液中的菌体浓度为106CFU/mL。将种子液接种到所述扩大培养基，并进行乙醇发酵，所述种子液与所述扩大培养基的体积比为1:20，发酵的温度为30℃，发酵的时间为90小时，得到乙醇发酵的产物中，乙醇的浓度为10g/L，总糖浓度为4重量％。
对比例2
将蔗糖、蛋白胨、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾以及水混合，得到含有130g/L的蔗糖以及2g/L的蛋白胨、1.5g/L的磷酸氢二钠和0.4g/L的磷酸二氢钾的含蔗糖的发酵培养基。
将购自ATCC的编号为10830的肠膜明串珠菌接种到上述含蔗糖的发酵培养基中，接种的浓度为104CFU/mL，在25℃下发酵24小时，得到第一发酵液。将所述第一发酵液在800×g的离心速度下离心，离心得到沉淀为菌体，上层液体为发酵上清液。在发酵上清液中加入乙醇，使得乙醇的终浓度为55体积％，发酵上清液中的右旋糖酐得到沉淀，剩下滤清液。将滤清液进行蒸馏，以回收滤清液中的乙醇，得到蒸馏剩余液。将如上获得的菌体在121℃，0.2MPa条件下进行高温灭活15分钟，然后得到的菌体高温灭活后与所述蒸馏剩余液的一部分混合，得到种子培养基，高温灭活后的步骤(2)得到的菌体和制备所述种子培养基所用的所述蒸馏剩余液的重量比为1:180；将所述蒸馏剩余液的另一部分作为扩大培养基。将保藏编号为CGMCCNo.9987的运动发酵单胞菌菌株接种到所述种子培养基中进行培养得到种子液，其中，接种的浓度为103CFU/mL，培养温度为31℃，培养时间为24小时，得到的种子液中的菌体浓度为107CFU/mL。将种子液接种到所述扩大培养基，并进行乙醇发酵，所述种子液与所述扩大培养基的体积比为1:20，发酵的温度为30℃，发酵的时间为90小时，得到乙醇发酵的产物中，乙醇的浓度为18g/L，总糖浓度为2重量％。
根据实施例1和对比例1和2的对比可见，本发明的保藏编号为CGMCCNO.10946的运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)在种子培养阶段能够直接利用右旋糖酐生产废水作为种子培养基，并且得到的种子培养液以1:100的接种比接种到右旋糖酐生产废水中后能够以较高的效率处理右旋糖酐生产废水；由此得到了本发明。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (9)

1.一种联产右旋糖酐和乙醇的方法，该方法包括如下步骤：(1)在含蔗糖的发酵培养基中加入肠膜明串珠菌(Leuoconostocmesenteroides)种子液进行产右旋糖酐的发酵培养，得到第一发酵液；(2)将所述第一发酵液进行菌体分离，得到菌体和发酵上清液；(3)将所述发酵上清液与乙醇混合，使得发酵上清液中的右旋糖酐沉淀析出，然后分离得到右旋糖酐和滤清液；(4)将所述滤清液蒸馏回收乙醇，得到蒸馏剩余液；(5)将步骤(2)得到的菌体高温灭活后与所述蒸馏剩余液的一部分混合，得到种子培养基，将所述蒸馏剩余液的另一部分作为扩大培养基；(6)将保藏编号为CGMCCNO.10946的运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)接种到所述种子培养基中培养得到种子液，并将所述种子液接种到所述扩大培养基中进行乙醇发酵，得到乙醇发酵液；然后从所述乙醇发酵液中提取乙醇。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，使得发酵上清液中的右旋糖酐沉淀析出所用的乙醇的终浓度为40-80体积％。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，高温灭活步骤(2)得到的菌体的条件包括：温度为115-123℃，压力为0.16-0.22MPa。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，制备所述种子培养基所用的高温灭活后的步骤(2)得到的菌体和制备所述种子培养基所用的所述蒸馏剩余液的重量比为1:(50-500)。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，将保藏编号为CGMCCNO.10946的运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)接种到所述种子培养基中的接种浓度为102-104CFU/mL。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述种子液中，保藏编号为CGMCCNO.10946的运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)的菌体浓度为109-1011CFU/mL。
7.根据权利要求1、5或6所述的方法，其中，所述种子液接种到所述扩大培养基时，所述种子液与所述扩大培养基的体积比为1:(10-100)。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，培养得到种子液的培养条件包括：温度为28-33℃，时间为15-30小时。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，进行乙醇发酵的发酵条件包括：温度为28-33℃，时间为50-120小时。
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