CN101525578A - 盾叶薯蓣内生真菌螺二萘类化合物的制备及作为杀菌剂的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种产螺二萘类化合物的盾叶薯蓣内生真菌Dzf12。本发明所述的内生真菌Dzf12是从盾叶薯蓣中采用内生真菌分离技术分离获得的，其特征是与伯克霉(Berkleasmium sp.)的ITS序列相似度为91.0％，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册编号为CGMCC No.2476。本发明首次从盾叶薯蓣中分离出产螺二萘类化合物的内生真菌，并明确了它们的抗菌活性，其中8－hydroxypalmarumycin CP₂是一未见报道的化合物。目的是利用植物内生真菌资源，获得天然活性成分。

Description

盾叶薯蓣内生真菌螺二萘类化合物的制备及作为杀菌剂的应用

技术领域

本发明涉及一种从盾叶薯蓣内生真菌中制备螺二萘类化合物的方法，以及螺二萘类化合物作为杀菌剂的应用，属于微生物技术领域。

背景技术

植物内生真菌是指那些在其生活史中的某一阶段或全部阶段生活在健康植物组织或器官内部，宿主植物不表现出外在病害症状的真菌(Saikkonen K，et al.Fungal endophytes：a continuum of interactions with hostplants.Annual Review of Ecology and Systematics，1998，29：319-343)。植物内生真菌是一种新的微生物资源，能产生多种结构类型的代谢产物，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗虫、调节植物生长等多种生物活性(TanRX ans Zou WX.Endophytes：a rich source of functional metabolites.Natural Product Reports，2001，18(4)：488-459)。由于植物内生真菌能产生结构新颖、功能独特的代谢产物而成为新化合物、新药物的潜在资源，它们在农业、医药、食品等领域具有重要的应用前景(Strobel G，et al.Natural products from endophyticmicroorganisms.Journal of Natural Products，2004，67(2)：257-268)。

螺二萘类化合物(spirobisnaphthalenes)是真菌产生一类生物活性成分。Schlingmann等(1993)从一种巴哈马树的树干上分离到一株内生真菌LL-07F725中分离到四个螺二萘类化合物，其中三个具有很好的抗白色念珠菌(Candida albicnns)、深红酵母菌(Rhodotorula rubra)以及一些细菌的活性(Schlingmann G，et al.Diepoxins，novel fungal metabolites with antibiotic activity.Tetrahedron Letters，1993，34(45)：7225-7228)。Chu等(1994)发现这类化合物具有抗肿瘤活性(Chu M，et al.A novel class of antitumor metabolites from thefungusNattrassia mangiferae.Tetrahedron Letters，1994，35(9)：1343-1346)。除此之外，研究人员还发现这类化合物可以作为氧硫蛋白-氧硫蛋白还原系统(thioredoxin-thioredoxin reductase system)抑制剂的先导结构(Wipf P，et al.Natural product based inhibitors of the thioredoxin-thioredoxin reductase system.Organic &Biomolecular Chemistry，2004，2(11)：1651-1658)。因此，研究内生真菌中螺二萘类化合物及其生物活性既具有理论意义，又具有重要的应用前景。

盾叶薯蓣(Dioscorea zingiberensis)别名枕头根、黄姜、黄连参、地黄姜、野洋姜，属于薯蓣科(Dioscoreaceae)薯蓣属(Dioscorea)，分布于我国陕西、江西、湖北、湖南、四川、云南、贵州等地。盾叶薯蓣根状茎可入药，具有解毒消肿功能，用于痈疖早期未破溃，皮肤急性化脓性感染，软组织损伤，蜂螫虫咬。盾叶薯蓣根状茎中薯蓣皂苷元含量较高，是合成肾上腺皮质激素类药物的重要原料。

目前尚未见从盾叶薯蓣内生真菌中分离到螺二萘类化合物的报道。本发明着重于盾叶薯蓣内生真菌螺二萘类代谢产物及其抗菌活性，为探讨该内生真菌的生理生态功能(如：提高宿主的抗病性等)及其应用提供依据。

本发明的目的是提供一种经发酵培养能产生螺二萘类化合物的微生物，即盾叶薯蓣内生真菌Dzf12，同时提供一种从盾叶薯蓣内生真菌中制备螺二萘类化合物的方法。

发明内容

本发明涉及一种产螺二萘类化合物的盾叶薯蓣内生伯克霉(Berkleasmium sp.)，菌株代号为Dzf12，为一种微生物材料，现保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，邮政编码100101)，保藏日期为2008年4月29日，登记入册编号为CGMCC No.2476。本发明提供如下的技术方法。

1、内生真菌Dzf12的分离

采集新鲜的盾叶薯蓣根状茎，采用内生真菌的分离和纯化技术，获得一株内生真菌，编号为Dzf12

2、内生真菌Dzf12的形态特征

(1)无性世代：内生真菌Dzf12在马铃薯-葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar，PDA)培养基上25℃培养，菌落较致密，绒毛状，灰色，表面有明显的水滴，背部产生大量深褐色色素。菌丝分隔，部分菌丝致密，有类似厚垣孢子的结构，但未发现分生孢子。内生真菌Dzf12的形态特征见图1、图2、图3和图4。

(2)有性世代：未发现。

3、内生真菌Dzf12的分子生物学特征

运用PCR技术，扩增采用ITS通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。将Dzf12菌株的ITS序列提交到GenBank核酸序列库中注册获得序列号(accession number)EU543255。同时将Dzf12菌株的ITS序列与GenBank中其他真菌的ITS序列进行比对，找出相似性最高，亲缘关系最近的真菌，Dzf12菌株的ITS序列与伯克霉(Berkleasmium sp.)DQ280263的ITS序列相似度为91.0％，其同源性的系统发育树图见图5。

4、内生真菌Dzf12的发酵培养特征

培养基：马铃薯-葡萄糖液体培养基(potato dextrose broth，PDB)。

培养温度：25℃。

发酵时间：15天。

摇床转速：150rpm。

发酵培养特征：培养第1至10天，菌液无色；从第11天至15天，菌液逐渐呈棕褐色，且颜色深度逐日递增。

5、内生真菌Dzf12粗提物的抗菌活性

采用薄层层析生物自显影法，噻唑蓝(MTT)为显色剂，对内生真菌Dzf12菌液和菌丝提取物中抗菌活性成分进行初步的检测。菌液提取物对大肠杆菌、根癌土壤杆菌、黄瓜角斑病菌、枯草芽孢杆菌、溶血葡萄球菌、番茄细菌斑点病菌和白色念珠菌具有明显的抑制作用。生物活性初步测定结果见表1。

6、螺二萘类化合物的分离特征

对内生真菌Dzf12培养物的提取物进行反复柱层析，包括常规的正相硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析、RP-18反相柱层析，以及制备性液相色谱，分离到5个螺二萘类化合物，其中两个无法分开，为混合物。

上述分离方法首先是采用正相硅胶柱层析，氯仿-甲醇梯度洗脱，依次得到以某一化合物为主的粗分段，然后分别用Sephadex LH-20凝胶柱层析、RP-18反相柱层析、制备性液相色谱和重结晶进行化合物的纯化。

7、螺二萘类化合物的的结构特征

分离得到的5个化合物，经过结构解析，分别鉴定为：8-hydroxy palmarumycin CP₂、diepoxinγ、diepoxinχ、diepoxin η和diepoxinζ。

8、螺二萘类化合物的抗菌活性特征

从真菌Dzf12分离到的5个螺二萘类化合物中，diepoxinχ、混合物diepoxinη和diepoxinζ对四种革兰氏阴性细菌(大肠杆菌、根癌土壤杆菌、黄瓜角斑病菌、番茄细菌斑点病菌)和一种革兰氏阳性细菌(枯草芽孢杆菌)有很好的抑制活性，同时混合物diepoxinη和diepoxinζ对稻瘟菌的孢子萌发表现出较强的抑制活性。

附图说明

图1为内生真菌Dzf12菌落正面。

图2为内生真菌Dzf12菌落背面。

图3为内生真菌Dzf12菌丝。

图4为内生真菌Dzf12菌丝及其类似厚垣孢子的结构。

图5为内生真菌Dzf12同源性的系统发育树图。

本发明的优点：本发明首次从盾叶薯蓣中分离到一株内生真菌Dzf12，并对其进行了分类鉴定。发现该菌粗提物对大肠杆菌、根癌土壤杆菌、番茄细菌斑点病菌、黄瓜角斑病菌、溶血葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和白色念珠菌的生长具有明显的抑制作用。通过对粗提物的分离纯化，从Dzf12菌株中分离到5个螺二萘类化合物：8-hydroxy palmarumycin CP₂、diepoxinγ、diepoxinχ、diepoxinη、diepoxinζ，其中8-hydroxypalmarumycin CP₂为一未见报道的化合物。抗菌活性测定结果表明，diepoxinχ、混合物diepoxinη和diepoxinζ具有很强的抗菌活性。本发明的目的是利用植物内生真菌资源，以求获得天然生物活性物质，为其开发和应用，以及探讨内生真菌的生理生态功能提供依据。

为了更好地理解本发明，下面结合本发明的实施例进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。

具体实施方式

实施例1：内生真菌Dzf12的分离

采集新鲜的盾叶薯蓣根状茎，表面先用70％乙醇处理30s，然后用0.2％氯化汞处理20min以进行彻底的表面灭菌，无菌条件下去除表皮，将根状茎分成约0.5cm×0.5cm×0.5cm大小的块段，摆放在PDA培养基上，每皿1块，在25℃，光照条件下，培养至第7～20天，从每个菌落的边缘挑取一小段菌丝接种到PDA培养基上进行纯化培养，连续纯化培养4～5次，至菌落形态一致。将纯化后的菌株在PDA斜面上保存，其中一株内生真菌的编号为Dzf12。

实施例2：内生真菌Dzf12提取物的抗菌活性

采用薄层层析生物自显影法，以噻唑蓝(MTT)为显色剂，分别对内生真菌Dzf12菌液正丁醇提取物和菌丝丙酮提取物的抗菌活性成分及其活性初步进行检测。

(1)提取物的少量制备：采用的是摇床发酵，两个500mL体积的三角瓶中分别盛PDB液体培养基250mL，将预先培养好的Dzf12菌丝接种到已灭菌的培养基中，在25℃、150rpm下，暗培养15天，得发酵液，通过减压过滤获得菌丝和菌液。菌液用等体积的正丁醇萃取(重复3次)，合并正丁醇萃取液，浓缩得正丁醇提取物；菌丝阴干后，用丙酮提取(重复3次)，合并丙酮提取液，浓缩得丙酮提取物。分别得到Dzf12的菌液和菌丝提取物。

(2)活性测定的供试菌株：供试细菌菌株：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis ATCC 11562)(革兰氏阳性)；黄瓜角斑病菌(Pseudomonas lachrymans ATCC 11921)(革兰氏阴性)；根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens ATCC 11158)(革兰氏阴性)；大肠杆菌(Escherichia coli ATCC 25922)(革兰氏阴性)；番茄细菌斑点病菌(Xanthomonas vesicatoria ATCC 11633)(革兰氏阴性)；溶血葡萄球菌(Staphylococcushaemolyticus)(革兰氏阳性)；供试真菌菌株：白色念珠菌(Candida albicans 2538)。上述供试菌株长期保存在-20℃下，在活性测定前，需要进行菌种活化。供试细菌和真菌分别在LB和PDA平板上进行活化培养(28℃，暗)48h，然后挑取单菌落，在LB(用于培养细菌)或PDB(用于培养真菌)液体培养基中摇培(28℃，暗，150rpm)24h，然后继代培养8-12h，菌液浓度达到10⁸cfu/mL，即可用于活性测定。

(3)培养基：采用的培养基包括：LB琼脂培养基(酵母浸膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，琼脂20g/L，pH 7.0)、LB液体培养基(酵母浸膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，pH 7.0)、PDA培养基(马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂20g/L，pH 7.0)和PDB培养基(马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L，pH 7.0)。

(4)抗菌活性测定：称取50mg样品，转入西林瓶中，加入1mL甲醇，超声助溶(25℃；20min)。用毛细管将样品溶液点在薄层板上，使点样处距薄层板边缘1cm。采用上行法展开，展开系统为氯仿∶甲醇＝10∶1(v/v)。向液体状态的LB培养基(琼脂浓度为0.5％，温度45℃)中加入一定量准备好的菌液(45mLLB+5mL菌液，将其浓度调至约10⁸cfu/mL)，迅速摇匀加到薄层板上，轻轻振动，使其均匀一致；待其凝固后，将该薄层板放入培养皿中保湿培养(薄层板下铺4层用适量无菌水湿润的吸水纸)，转入4℃冰箱中放置1-2h，然后将其转入恒温培养箱中(28℃)培养。培养12h后，取出薄层板，向上面喷加适量0.5mg/mL MTT溶液，约5min后可观察薄层板上出现的颜色和抑菌圈大小。微生物生长抑制区域不显色，其余区域显蓝紫色。通过抗菌斑点的迁移率(即Rf值)来初步评价样品中抗菌化合物的数量和极性，根据抗菌斑点的大小来初步评价化合物的活性和含量。Rf值计算公式如下：

(5)实验结果：结果见表1。

表1  内生真菌Dzf12的提取物的抗菌活性

实施例3：内生真菌Dzf12的形态特征观察

内生真菌Dzf12在PDA培养基上25℃培养，菌落较致密，绒毛状，灰色，表面有明显的水滴，背部产生大量深褐色色素。菌丝分隔，部分菌丝致密，有类似厚垣孢子的结构，但未发现分生孢子。形态特征见图1～图4。在培养条件下，未发现Dzf12有性世代。

实施例4：内生真菌Dzf12的ITS序列分析与分子鉴定

首先将在平板上活化的Dzf12菌株的菌丝接种到PDB培养基中，悬浮培养5天后获得新鲜的菌丝，采用常规的分子生物学方法提取基因组DNA。运用PCR技术，DNA扩增采用ITS通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。DNA测序所用的引物分别为ITS1和ITS4，采用ABI PRISM 3730测序仪，分别进行正向(5′→3′)和反向(3′→5′)双向测序。

反向序列经DNAMAN软件反向互补后与正向序列拼接形成5′→3′完整序列。把所得的IST rDNA序列提交到GenBank数据库(National Center for Biotechnology Information Website，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，获得序列号(accession number)EU543255。利用Blast工具进行序列比对，找出与该序列相似度最高菌的序列信息。Dzf12菌株的ITS序列与伯克霉(Berkleasmium sp.)DQ280263的ITS序列相似度为91.0％。

根据Blast比对结果，从中抽取与所分离的内生真菌Dzf12菌株序列相似性高的菌株的序列，采用ClustalX 1.8软件进行序列对准，再用MEGA软件计算遗传距离，然后利用距离依靠法中的邻位相连法(neighbor-joining，NJ)构建进化树，计算Bootstrap值来评价系统发育树的可靠性。Dzf12同源性的系统发育树图见图5。

实施例5：内生真菌Dzf12的发酵工艺和提取物的制备工艺

内生真菌Dzf12采用液体发酵培养10-20天，得总发酵液，经离心或过滤得菌丝和菌液部分，菌液用正丁醇萃取，菌丝用丙酮提取，分别浓缩，得到正丁醇提取物和丙酮提取物。

实施例6：内生真菌Dzf12提取物的制备

按实施例5的发酵工艺和提取物制备工艺，采用摇床发酵，1000mL体积的三角瓶中盛PDB液体培养基300mL，将预先培养好的Dzf12菌丝接种到已灭菌的培养基中，在25℃、150rpm下暗培养15天，得总发酵液67L，通过减压过滤获得菌丝和菌液，菌液依次用等体积的正丁醇萃取(重复3次)，合并正丁醇萃取液，浓缩的浸膏165g。菌丝阴干后，用丙酮提取(重复3次)，合并丙酮提取液，浓缩得浸膏41.3g。通过薄层层析(TLC)检测，表明菌丝丙酮提取物和菌液正丁醇萃取物所含成分几乎一致，故将菌丝和菌液提取物合并，共206.3g。

实施例7：内生真菌Dzf12代谢产物的分离、纯化与制备

实施例6得到的菌丝和菌液提取物合并(206.3g)，用丙酮溶解后，正相硅胶(100-200目)拌样，硅胶(200-300目)980g装柱，氯仿-甲醇系统梯度洗脱(100∶0～100∶20，v/v)。

氯仿洗脱组分合并后，经Sephadex LH-20、正相硅胶柱色谱和反相硅胶柱色谱，然后重结晶，得化合物1(8-hydroxy palmarumycin CP₂)，共得到15mg。

氯仿∶甲醇＝100∶1(v/v)的洗脱组分合并后，经Sephadex LH-20柱色谱、反相硅胶(silica gel RP-18)柱色谱，纯化得化合物3(diepoxinχ)，共得到6mg。

氯仿∶甲醇＝100∶2(v/v)的洗脱组分合并后，经Sephadex LH-20柱色谱、反相硅胶(RP-18)柱色谱、重结晶后得到化合物4(diepoxinη)和化合物5(diepoxinζ)的混合物，共得到120mg。

氯仿∶甲醇＝100∶3(v/v)的洗脱组分合并后，经Sephadex LH-20柱色谱、反相硅胶(RP-18)柱色谱、制备性液相色谱得化合物2(diepoxinγ)，共得到25mg。

实施例8：8-hydroxy palmarumycin CP₂(1)的结构鉴定

用实施例7所述的方法制备到化合物1为一黄色针状晶体(氯仿)。m.p.173-175℃。结合核磁谱和高分辨质谱(HR-ESI-MS)的结果(测定值：333.07689[M-1]，计算值：333.07685)确定其分子式为C₂₀H₁₄O₅。

¹H NMR(CDCl₃，500MHz)谱图共给13个质子信号。其中有八个芳香质子信号，结合二维核磁数据(HMQC，HMBC)可将化学位移值在δ(ppm)：7.06(2H，m，H-2′，H-7′)、7.49(2H，t，J＝7.5Hz，H-3′，H-6′)、7.60(2H，d，J＝8.0Hz，H-4′，H-5′)的质子归属为1，8二取代萘环上的质子；化学位移值在δ(ppm)：7.06(1H，m，H-6)、7.26(1H，m，H-7)的质子归属为苯环上相邻的两个质子；在高场处有四个质子信号δ(ppm)：2.76(2H，m，H-3)、2.51(2H，m，H-2)可归属为两个脂肪碳上的质子；最低场的质子信号δ(ppm)：12.37(1H，s，H-5)可归属为活泼质子。

¹³C NMR(CDCl₃，125MHz)谱图给出16个碳信号，其中有一个为羰基碳信号δ(ppm)：202.4(C-4)；：芳香区共给出12个信号，其中δ(ppm)：146.2(C-1′，C-8′)、110.5(C-2′，C-7′)、127.6(C-3′，C-6′)、121.8(C-4′，C-5′)、113.5(C-8a′)、134.2(C-4a′)为一个1，8位二氧取代的萘环的碳信号；其余的芳香碳信号157.2(C-5)、121.9(C-6)、128.9(C-7)、147.7(C-8)、114.4(C-4a)、119.7(C-8a)可归属为苯环上的碳；高场区的信号δ(ppm)：29.0(C-2)、33.8(C-3)可归属为脂肪碳；化学位移值在δ(ppm)102.0(C-1)的信号，说明分子中还可能存在一个缩醛结构。

经以上的结构解析，初步确定此化合物1为一个螺二萘类化合物。经与文献中同类化合物的数据相比较，发现此化合物与文献中报道的化合物cladospivore B(Bode HB，et al.Secondary metabolites by chemicalscreening，42.Cladospirones B to I from Sphaeropsidales sp.F-24′707by variation of culture conditions.European Journal of Organic Chemistry，2000，3185-3193)最为接近。与之相比较，此化合物的分子式比cladospivore B的分子式C₂₀H₁₄O₆少一个氧原子，并且化合物1的C-2(δ29.0)位置的碳信号向高场位移(cladospivore B：C-2(δ66.4))，这说明化合物1是cladospivore B的2位羟基被还原的衍生物。因此最终化合物1鉴定为如下图所示，这是一个未见文献报道的新化合物。该化合物与文献报道的化合物palmarumycin CP₂(Krohn A，et al.Palmarumycins CP₁-CP₄ from Coniothyrium palmarum：isolation，structureelucidation，and biological activity.Liebigs Annalen der Chemie，1994，1093-1097)和deoxypreussomerin B(Singh SB，et al.Preussomerins and deoxypreussomerins：novel inhibitors of ras farnesyl-protein transferase.Journal of Organic Chemistry，1994，59(21)：6296-6302)相比，在C-8的位置，氢被羟基取代，故将化合物1命名为8-hydroxy-palmarumycin CP₂或8-hydroxy-dexoypreussomerin B，其系统命名为：2，3-dihydro-5，8-dihydroxy-spiro[naphthalene-1-(4H)，2′naphtho[1，8-de][1，3]dioxin]-4-one。8-hydroxy palmarumycin CP₂的¹HNMR和¹³CNMR数据见表2。

表2  8-hydroxy palmarumycin CP₂(1)的¹H NMR和¹³C NMR数据(δin ppm；J in Hz)

^a溶剂为CDCl₃

化合物1的结构式如下：

实施例9：diepoxin γ(2)的结构鉴定

用实施例7所述的方法制备到化合物2，为一无色针状晶体(丙酮)。m.p.198-202℃。¹³C NMR(DMSO-d₆，125MHz)谱显示出20个碳信号。¹³CNMR在低场区给出的碳信号δ(ppm)：108.6(C-2′orC-7′)108.9(C-2′or C-7′)、111.4(C-8a′)、120.6(C-4′，C-5′)、127.6(C-3′or C-6′)、127.7(C-3′or C-6′)、133.7(C-4a′)、145.1(C-1′or C-8′)、145.4(C-1′or C-8)与8-hydroxy palmarumycin CP₂(1)的一致，而¹H NMR芳香区δ(ppm)：7.04(2H，m，H-2′，H-7′)、7.50(2H，m，H-3′，H-6′)、7.61(2H，m，H-4′，H-5′)的信号与8-hydroxypalmarumycin CP₂(1)的萘结构中氢信号基本一致，从而推出该化合物中含萘结构，与8-hydroxypalmarumycin CP₂(1)为同一系列化合物。δ197.7的信号说明分子结构中存在一个羰基。¹H NMR谱图中在化学位移δ：6.02(1H，d，J＝7.5Hz，H-4)、5.74(1H，d，J＝5.0Hz，H-5)、4.97(1H，d，J＝5.5Hz，H-6)的活泼质子信号说明分子中存在三个羟基。COSY谱图显示δ：2.37(1H，m，H-7)、2.46(1H，m，H-7)的质子信号相关，HMQC谱图显示这两个质子信号与化学位移值在δ41.8(C-7)的碳相关，HMBC谱图显示这两个质子信号与δ197.7(C-8)的碳信号相关，说明这两个质子位于同一个化学位移值在δ41.8(C-7)的碳上，这个碳为仲碳，并与化学位移值为δ197.7(C-8)的羰基相连。将化合物2核磁共振波谱数据与文献(Schlingmann G，et al.Diepoxins，novel fungal metabolites with antibiotic activity.Tetrahedron Letters，1993，34(45)：7225-7228；Schlingmann G，et al.Absolute stereochemistry of the diepoxins.Tetrahedron，1996，52(2)：435-446)值比对，其信号跟diepoxin γ基本一致。最终确定化合物2为diepoxin γ，其系统命名为：(2R，3R，4S，4aS，5S，8aR)-3，4，7-trihydro-4，5，6R-trihydroxy-spiro[2，3：4a，8a-diepoxynaphthalene-1(2H)，2′-naphtho[1，8-de]-[1，3]dioxin]-8(5H)-one)。diepoxin γ(2)的¹H NMR和¹³C NMR数据见表3。其结构式如下：

表3  diepoxin γ(2)的¹H NMR和¹³C NMR数据(δin ppm；J in Hz)

^a溶剂为DMSO-d₆

实施例10：diepoxinχ(3)的结构鉴定

用实施例7所述的方法制备到化合物3，为一无色针状晶体(氯仿)，m.p.164-168℃。¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)，高场区δ(ppm)3.30(3H，m，H-6)的信号说明分子中存在一个甲氧基；芳香区δ(ppm)：7.06(2H，m，H-2′，H-7′)、7.52(2H，m，H-3′，H-6′)、7.62(2H，m，H-4′，H-5′)的信号与8-hydroxy palmarumycinCP₂(1)的萘结构氢谱的化学位移信号相符，说明这个化合物分子中存在一个萘的结构；δ(ppm)：5.85(1H，d，J＝4.9Hz，H-4)、6.12(1H，d，J＝7.3Hz，H-5)化学位移信号显示化合物中存在两个羟基。根据¹H NMR谱的比对，与diepoxinχ的文献(Schlingmann G，et al.Diepoxins，novel fungal metabolites with antibioticactivity.Tetrahedron Letters，1993，34(45)：7225-7228；Schlingmann G，et al.Absolute stereochemistry of thediepoxins.Tetrahedron，1996，52(2)：435-446)值基本一致。最终确定化合物3为diepoxinχ，其系统命名为：(2R，3R，4S，4aS，5S，8aR)-3，4，7-trihydro-4，5-dihydroxy-6S-methoxy-spiro[2，3：4a，8a-diepoxynaphthalene-1(2H)，2′naphtho[1，8-de]-[1，3]dioxin]-8(5H)-one。diepoxinχ(3)的¹H NMR数据见表4。

表4  diepoxinχ(3)的¹H NMR数据(δin ppm；J in Hz)

^a溶剂为DMSO-d₆

化合物3的结构式如下：

实施例11：diepoxin η(4)和diepoxinζ(5)的结构鉴定

用实施例7所述的方法制备到一无色针状晶体(氯仿)。此物质经正相薄层层析(GF₂₅₄硅胶板，展开系统：氯仿∶甲醇＝10∶1，Rf＝0.5)和反相薄层层析(ChromatrorexC18，展开系统：水∶甲醇＝1∶3，Rf＝0.65)检测在紫外光(254nm)下均为单一斑点，经熔点仪测试，具有240-241℃和154-155℃两个明显的熔程，说明此物质可能为两个化合物的混合物。使用各种分离手段后，均不能将其做很好的分离，故将此混合物作为一个样品进行结构的鉴定。此混合物的理化性征与前述化合物相似，初步断定这两个化合物也是螺二萘类化合物，观察此样品的¹H NMR数据发现在δ(ppm)：5.93(1H，d，J＝8.0Hz，)、5.67(1H，d，J＝4.5Hz)、6.22(1.7H，d，J＝7.5Hz)、5.97(1.7H，d，J＝7.5Hz)位置出现的氢质子在HMQC谱图中没有和任何的碳相关，因此说明这些信号分别为两个化合物上的羟基质子信号，根据它们的积分面积可以判断出这两个化合物是以约2∶3的比例混合，并由此将样品的NMR数据分为两组(化合物4和化合物5)分别进行结构的解析。

化合物4的解析：¹H NMR谱图中在化学位移δ(ppm)：5.93(1H，d，J＝8Hz，H-4)、5.67(1H，d，J＝4.5Hz，H-5)的活泼质子信号说明分子中存在两个羟基。将这个化合物的¹³C NMR谱图数据与diepoxinγ的进行比对，发现只有6-C和7-C的化学位移值存在明显差异，¹³C NMR谱图中出现化学位移值在δ(ppm)：23.8、32.5的信号，可以推断出6位和7位的碳为脂肪碳。从COSY谱图和HMQC谱图可以推断出化学位移值在δ(ppm)：2.26(1H，m，H-7)、2.43(1H，m，H-7)的氢同时跟化学位移值δ(ppm)为32.5(C-7)的碳相连，化学位移值在δ(ppm)：1.68(1H，m，H-6)、1.85(1H，m，H-6)的氢与化学位移值δ为23.8(C-6)的碳相连。HMBC谱图显示δ(ppm)：2.26(1H，m，H-7)、2.43(1H，m，H-7)的质子信号与化学位移值δ为198.6(C-8)的碳信号相关，说明化学位移值在δ32.5(C-7)的仲碳与化学位移值为δ198.6(C-8)的羰基相连。以上数据可以推出化合物4与diepoxinγ的结构相似，只是在C-6的位置未被羟基取代。将化合物4的波谱数据与文献(Schlingmann G，et al.Diepoxins，novel fungal metabolites with antibiotic activity.Tetrahedron Letters，1993，34(45)：7225-7228；Schlingmann G，et al.Absolute stereochemistry of the diepoxins.Tetrahedron，1996，52(2)：435-446)值比对，基本一致，因此推断此化合物4为diepoxinη，其系统命名为：(2R，3R，4S，4aS，5S，8aR)-3，4，6，7-Tetrahydro-4，5-dihydroxy-spiro[2，3：4a，8a-diepoxynaphthalene-1(2H)，2′-naphtho[1，8-de]-[1，3]dioxin]-8(5H)-one。其¹H NMR和¹³C NMR数据见表5。diepoxin η(4)的¹H NMR和¹³C NMR数据见表5，其结构式如下：

表5  diepoxin η(4)的¹H NMR和¹³C NMR数据(δin ppm；J in Hz)

^a溶剂为DMSO-d₆

化合物5的解析：混合物的¹H NMR谱图中在化学位移值δ(ppm)：5.97(1H，d，J＝7.5Hz，H-5)、6.22(1H，d，J＝7.5Hz，H-4)的活泼质子信号，说明分子中存在两个羟基。与diepoxin η的¹³C NMR谱图进行比对，发现只有6-C和7-C的化学位移值有差异。¹³C NMR谱图中出现化学位移值δ(ppm)为144.8(C-6)、125.4(C-7)的信号，可以推断这个化合物的6位和7位为烯碳。将其波谱数据与文献值(Schlingmann G，etal.Diepoxins，novel fungal metabolites with antibiotic activity.Tetrahedron Letters，1993，34(45)：7225-7228；Schlingmann G，et al.Absolute stereochemistry of the diepoxins.Tetrahedron，1996，52(2)：435-446)比对，基本一致，因此推断化合物5为diepoxinζ，其系统命名为：(2R，3R，4S，4aS，5S，8aR)-3，4-dihydro-4，5-4，5-dihydroxy-spiro[2，3：4a，8a-diepoxynaphthalene-1(2H)，2′-naphtho[1，8-de]-[1，3]dioxin]-8(5H)-one。diepoxinζ(5)的¹HNMR和¹³CNMR数据见表6。

表6  diepoxinζ(5)的¹H NMR和¹³C NMR数据(δin ppm；J in Hz)

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化合物5的结构式如下：

实施例12：测定化合物对细菌的最低抑制浓度

用实施例7所述的方法，对从盾叶薯蓣内生真菌Dzf12中分离到的3个螺二萘类化合物：8-hydroxypalmarumycin CP₂(1)、diepoxin γ(2)和diepoxinχ(3)，以及1个由diepoxin η(4)和diepoxinζ(5)组成混合物，对细菌的最低抑制浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)进行测定。

(1)活性测定的菌株：见实施例2。

(2)培养基：见实施例2。

(3)测试样品母液的配制：取1mg单体化合物溶于0.5mL丙酮中，配成2000μg/mL的母液，然后用丙酮依次稀释成如下系列浓度：1500μg/mL、1000μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、200μg/mL、150μg/mL、125μg/mL、100μg/mL、75μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、20μg/mL、10μg/mL。

选用硫酸链霉素(SERVA公司产品)1mg单体化合物溶于1.0mL丙酮中，配成1000μg/mL的母液，然后用丙酮依次稀释成如下系列浓度：400μg/mL、200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL。

MTT用pH 7.2、0.2mol/L的磷酸缓冲液(PBS)配制成5mg/mL的溶液，过滤除菌待用。

(4)最低抑制浓度(MIC)的测定：采用多孔板-MTT法测定化合物对细菌的MIC值。具体步骤如下：在洁净无菌的96孔培养板中加入浓度为10⁶cfu/mL的供试菌液90μL，然后加入不同浓度(2000μg/mL、1500μg/mL、1000μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、200μg/mL、150μg/mL、125μg/mL、100μg/mL、75μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、20μg/mL、10μg/mL)梯度的测试样品母液10μL，溶剂(丙酮)终浓度为10.0％。阳性对照为不同浓度(400μg/mL、200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL)的硫酸链霉素母液10μL。同时设空白对照和溶剂对照(10.0％丙酮)，每个处理6个重复。化合物在菌液中的浓度均为母液浓度的十分之一。将96孔板于28℃下，振荡(15rpm)、暗培养24h后每孔中加入MTT溶液(5mg/mL)10μL，继续培养4h后，在1500g下离心20min，去上清，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150μL，振荡(15rpm)30min，以终止反应并助其溶解。肉眼即可观察判断化合物的MIC值，即培养基中刚好无监色物质生成的药剂浓度。为了进一步验证MIC值，从多孔板每个孔中吸取10μL培养液涂布到LB平板上，在28℃下培养24h后观察统计平板菌落数。

(5)实验结果：结果(表7)显示diepoxin η和diepoxinζ的混合物、diepoxinχ具有很好的抗细菌活性。其另外3个化合物在所试浓度下未检测出MIC值。

表7  diepoxinχ(3)、diepoxin η(4)和diepoxinζ(5)的混合物的对细菌最低抑制浓度

实施例13：测定化合物对细菌的半抑制浓度

用实施例7所述的方法，对从盾叶薯蓣内生真菌Dzf12中分离到的3个螺二萘类化合物：8-hydroxypalmarumycin CP₂(1)、diepoxin γ(2)和diepoxinχ(3)，以及1个由diepoxin η(4)和diepoxinζ(5)组成混合物，对抗细菌的半抑制浓度(median inhibitory concentration，IC₅₀)进行测定。

(1)活性测定的菌株：见实施例12。

(2)培养基：见实施例12。

(3)测试样品母液的配制：见实施例12。

(4)半抑制浓度(IC₅₀)的测定：采用多孔板-MTT-分光光度法测定化合物对细菌的IC₅₀。具体步骤如下：在洁净无菌的96孔培养板中加入浓度为10⁶cfu/mL的供试菌液90μL，然后加入不同浓度(2000μg/mL、1500μg/mL、1000μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、200μg/mL、150μg/mL、125μg/mL、100μg/mL、75μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、20μg/mL、10μg/mL)梯度的测试样品母液10μL，溶剂(丙酮)终浓度为10.0％。阳性对照为不同浓度(400μg/mL、200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL)的硫酸链霉素母液10μL。同时设空白对照和溶剂对照(10.0％丙酮)，每个处理6个重复。化合物在菌液中的浓度均为母液浓度的十分之一。将96孔板于28℃下，振荡(15rpm)、暗培养24h后每孔中加入MTT溶液(5mg/mL)10μL，继续培养4h后，在1500g下离心20min，去上清，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150μL，振荡(15rpm)30min，以终止反应并助其溶解。将显色的菌悬液在1500g下离心20min，将上清(100μL DMSO)转移至另一干净的96孔板中，采用多孔板阅读器(Bio-Rad-550，USA)测定590nm处的光吸收值，按下式计算供试药物(化合物)的抑制率(％)：

根据抑制率，查机率值表，可得抑制率机率值(Y)，将药液浓度(μg/mL)换算成浓度对数(X)，即可求出线性方程Y＝aX+b，根据线性方程可求出半抑制浓度(IC₅₀)。

(5)实验结果：结果(表8)显示，diepoxin χ、diepoxin η和diepoxinζ的混合物具有明显的抗细菌活性。

表8  diepoxin χ、diepoxin η和diepoxinζ的混合物对细菌半抑制浓度

实施例14：螺二萘类化合物对稻瘟菌孢子萌发的抑制活性

用实施例7所述的方法，对从内生真菌Dzf12中分离到的5个螺二萘类化合物：diepoxin η(4)和diepoxinζ(5)的混合物、diepoxinγ(2)、diepoxinχ(3)、8-hydroxy palmarumycin CP₂(1)进行对稻瘟菌孢子萌发的抑制活性测定。

(1)培养基：采用燕麦西红柿培养基(oat-tomato agar medium，OTA)。配制1L的燕麦西红柿培养基的步骤为：将成熟的西红柿切碎，用榨汁机榨汁，汁液用四层纱布过滤，取已过滤的汁液150mL待用。同时，称取燕麦片30g，加入1000mL去离子水，煮沸30min，注意边煮边搅拌。煮好的燕麦片用两层纱布过滤。收集滤液，然后往滤液中加入已准备好的番茄汁150mL和20g琼脂，加热融化，趁热用纱布过滤，然后加去离子水定容至1000mL。分装后121℃湿热灭菌20min。该培养基用于稻瘟菌的培养。

(2)供试的植物病原真菌：稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)。

(3)稻瘟菌活化培养：用灭菌的接种针从保存菌种的试管中挑取少量菌丝，接种到燕麦番茄汁培养基平板上，用封口膜封好，25℃下黑暗培养。

(4)稻瘟菌继代培养：倒燕麦番茄汁培养基平板，每皿倒培养基约40mL。用移液枪在稻瘟菌菌落中央滴加无菌水1mL，然后用灭菌后的接种针轻轻擦洗菌落表面，注意用力要轻，以免擦破培养基表面。待无菌水变浑浊后，再用移液枪吸取100μL滴加到倒好的燕麦番茄汁培养基平板表面，然后用玻璃涂棒将其涂散均匀。待培养基表面干燥后，盖好倒置25℃下培养。

(5)机械刺激诱导产孢：接种活化的稻瘟菌室温下培养48h后，在其表面滴加无菌水约3mL，然后用灭菌后的棉签轻轻擦洗菌丝，将菌丝机械擦断，连续擦洗两次，待灰色菌落变为黑色后即可，将表面的水倒掉，然后倒扣于灭菌后的吸水纸上，晾干水分，用三层灭菌后的纱布将皿口封住，置于干燥有光的条件下培养48h即可得到稻瘟菌孢子。

(6)配制化合物母液：称取分离到的抗菌活性成分各1mg，加入乙醇溶解，配成2000μg/mL的母液，然后稀释成含20％乙醇的母液浓度梯度：400μg/mL、300μg/mL、200μg/mL、180μg/mL、160μg/mL、140μg/mL、120μg/mL、100μg/mL、80μg/mL、50μg/mL、25μg/mL。

阳性对照采用多菌灵(Aldrich公司产品)，称取多菌灵1.0mg到Eppendorf管中，向其中加入纯乙醇溶液1.0mL，振荡溶解，得到1000μg/mL的多菌灵母液。然后将多菌灵母液配制成系列浓度为10μg/mL、8μg/mL、6μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.4μg/mL，溶剂为20％乙醇的溶液。

(7)配制孢子悬浮液：在完成机械诱导产孢的稻瘟菌平板上滴加无菌水3.0mL，然后用无菌棉签轻轻擦洗菌落表面，洗下孢子，将孢子洗液装到1.0mL的离心管中，离心3次(离心力8000g，每次离心15min)。然后配制孢子悬液，利用血球记数板测定孢子浓度，将孢子浓度配制为2×10⁶个/mL。

(8)进行活性测定：准备洁净培养皿，然后在每个培养皿中放上四层吸水纸，进行灭菌。灭菌后，往每皿中加无菌水5.0mL，在吸水纸上平行放置两根无菌牙签。另准备好凹玻片，用75％的乙醇浸泡24h，然后晾干。配制好的稻瘟菌孢子悬浮液(2×10⁶个/mL)和系列浓度梯度的Dzf12化合物溶液1∶1(v/v)混合，充分混匀后滴加到凹玻片的凹洞上，每个凹洞加50μL。这样得到Dzf12化合物的检测终浓度为200μg/mL、150μg/mL、100μg/mL、90μg/mL、80μg/mL、70μg/mL、60μg/mL、50μg/mL、40μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL。而阳性对照的检测终浓度为5μg/mL、4μg/mL、3μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.2μg/mL。同时设空白对照和溶剂对照(10％乙醇)，每个处理3个重复。将凹玻片放在培养皿中的牙签上，室温下黑暗培养8h后进行观察孢子的萌发情形。

(9)观察记录实验结果和孢子萌发率的计算

在显微镜10×10(目镜×物镜)倍下观测每一凹玻片上的孢子萌发情况，选择3个不同的视野，每个视野中100个以上孢子，共数300个孢子，用计数器记下萌发的孢子数，将3个重复合到一块计算孢子萌发率(％)。

(10)数据处理和半抑制浓度的计算

试验结果采用Microsoft Excel软件进行数据整理，在分析中，供试样品浓度(μg/mL)取对数(X)，抑制率换算成生物统计机率值(Y)，求得抑制活性回归方程(Y＝aX+b)，从而可以求得半抑制浓度(IC₅₀)。实验设空白对照和溶剂对照(10％乙醇，v/v)，每个处理两个重复。

(11)实验结果

diepoxinη(4)和diepoxinζ(5)的混合物对稻瘟菌孢子萌发具有明显的抑制活性，抑制活性回归方程为：Y＝13.076X-19.438(R＝0.9527)，半抑制浓度(IC₅₀)为73.94μg/mL。diepoxinχ(3)在浓度为150μg/mL和200μg/mL时，对稻瘟菌孢子萌发的抑制率分别为10％和30％。其它化合物在浓度为200μg/mL对稻瘟菌孢子萌发抑制活性未达到30％。阳性对照多菌灵对稻瘟菌的抑制活性回归方程为：Y＝1.2088X+4.9626(R＝0.9820)，半抑制浓度(IC₅₀)为1.07μg/mL。

Claims (8)

1、一株产螺二萘类化合物的盾叶薯蓣内生真菌，其特征是与伯克霉(Berkleasmium sp.)的ITS序列相似度为91.0％，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册编号为CGMCC No.2476。

2、一种按权利要求1所述的内生真菌，是通过严格的表面消毒，从植物内部分离出来的，并通过形态和分子鉴定，将ITS rDNA序列提交到GenBank数据库，获得序列号EU543255。

3、一种从按权利要求1所述的内生真菌中分离螺二萘类化合物，是指在分离化合物的同时，进行抗菌活性检测，分离化合物的方法包括常压正相硅胶柱层析、常压反相硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析、反相硅胶柱层析、重结晶，抗菌活性检测包括薄层层析-生物自显影-MTT法、多孔板-MTT法、孢子萌发法。

4、一种按权利要求3所述的分离内生真菌中螺二萘类化合物方法，首先是采用正相硅胶柱层析，氯仿-甲醇梯度洗脱，依次得到以某一化合物为主的粗分段，然后分别用Sephadex LH-20凝胶柱层析、RP-18反相柱层析、制备性液相色谱和重结晶进行化合物的纯化。

5、一种从按权利要求1所述的内生真菌中分离8-hydroxy palmarumycin CP₂方法，该化合物的系统命名为2，3-dihydro-5，8-dihydroxy-spiro[naphthalene-1-(4H)，2′naphtho[1，8-de][1，3]dioxin]-4-one，是一未见报道的化合物。

6、一种从按权利要求1所述的内生真菌中分离diepoxinγ方法。

7、一种从按权利要求1所述的内生真菌中分离diepoxinχ方法，该化合物对细菌生长和稻瘟菌孢子萌发具有抑制活性。

8、一种从按权利要求1所述的内生真菌中分离diepoxinη和diepoxinζ混合物方法，该混合物对细菌生长和稻瘟菌孢子萌发具有抑制活性。

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