CN101412971A - 一种产抗菌活性成分的滇重楼内生镰孢菌 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种产抗菌活性成分的滇重楼内生镰孢菌。本发明所述的内生真菌Ppf4是从滇重楼中采用内生真菌分离技术分离获得的，经微生物分类鉴定为镰孢菌(Fusarium sp.)，该菌株已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册编号为CGMCC No.2473。本发明首次从滇重楼中分离出产5α，8α－过氧麦角甾－6，22－二烯－3β－醇、麦角甾－8(9)，22－二烯－ 3β，5α，6β，7α－四醇和丁二酸的内生真菌，并明确了它们的抗菌活性。目的是利用植物内生真菌资源，获得天然活性成分。

Description

一种产抗菌活性成分的滇重楼内生镰孢菌

技术领域

本发明涉及一种产抗菌活性成分的滇重楼内生镰孢菌，属于微生物技术领域。

背景技术

植物内生真菌是指那些在其生活史中的某一阶段或全部阶段生活在健康植物组织或器官内部，宿主植物不表现出外在病害症状的真菌。植物内生真菌是一种新的微生物资源，能产生多种结构类型的代谢产物，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗虫、调节植物生长等多种生物活性。由于植物内生真菌能产生结构新颖、功能独特的代谢产物而成为新化合物、新药物的潜在资源，它们在农业、医药、食品等领域具有重要的应用前景。

一些内生真菌能产生抗菌活性成分，主要包括生物碱类、肽类、甾体类、萜类、酚类、醌类、脂肪族类、异香豆素类等多种结构类型，这些抗菌活性成分在内生真菌中具有重要的生理生态功能，同时有可能直接开发成杀菌剂，也可以作为研制新型杀菌剂的先导结构。因此，研究内生真菌的抗菌活性成分既具有理论意义，又具有重要的应用前景。

滇重楼(Paris polyphylla var.yunnanensis Hand.)在分类上属于单子叶百合目延龄草科(Trilliaceae)，为我国特有的药用植物，分布于云南、四川、贵州等省区，其根状茎多年生长在地下，对土传病原菌具有强的抵抗能力，这很可能与其共生的内生菌有关。

目前尚未见从滇重楼内生镰孢菌中分离抗菌活性成分的报道。本发明着重于滇重楼内生镰孢菌抗菌活性成分的研究，为探讨该内生真菌的生理生态功能(如：提高宿主的抗病性等)提供依据。

本发明的目的是提供一种经发酵培养能产生抗菌活性成分的微生物，即滇重楼内生镰孢菌。

发明内容

本发明涉及一种产抗菌活性成分的滇重楼内生镰孢菌(Fusarium sp.)，菌株代号为Ppf4，为一种微生物材料，现保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，邮政编码100101)；保藏日期为2008年4月29日，登记入册编号为CGMCC No.2473。本发明提供如下的技术方法。

1、内生镰孢菌Ppf4的分离

采集新鲜的滇重楼根状茎，采用内生真菌的分离和纯化技术，获得一株内生真菌，编号为Ppf4。

2、内生镰孢菌Ppf4的形态特征

(1)无性世代：内生真菌Ppf4在PDA培养基上25℃培养，菌落疏松，绒毛状，浅红色至暗红色，边缘白色，表面有明显的水滴，背部产生大量红色色素，分生孢子梗细长，分隔，分生孢子无色，单胞，聚集在粘液滴中，分生孢子卵圆形，长椭圆形，4.8-16.8μm×2.9-6.0μm。内生真菌Ppf4的形态特征(见图1、图2、图3和图4)符合镰孢菌属(Fusarium)真菌的形态特征。

(2)有性世代：未发现。

3、内生镰孢菌Ppf4的分子生物学特征

运用PCR技术，扩增采用ITS通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。将Ppf4菌株的ITS序列提交到GenBank核酸序列库中注册获得序列号(accession number)EF495241。同时将Ppf4菌株的ITS序列与GenBank中其他真菌的ITS序列进行比对，找出相似性最高，亲缘关系最近的真菌，Ppf4菌株的ITS序列与镰孢菌(Fusarium sp.)DQ780425的ITS序列相似度为99.0％，其同源性的系统发育树图见图5。

4、内生镰孢菌Ppf4的发酵培养特征

培养基：马铃薯-葡萄糖(PD)液体培养基。

培养温度：25±1℃。

发酵时间：7天。

摇床转速：120rpm。

发酵培养特征：培养第2天，菌液无色；培养第4天，菌液略带橙红色；培养第7天，菌液为深红色。

5、内生镰孢菌Ppf4粗提物的抗菌活性

采用琼脂打孔药剂扩散法，内生真菌Ppf4菌液和菌丝提取物均表现出一定的抗菌活性，菌液提取物的活性强于菌丝提取物。采用多孔板液体稀释法，噻唑蓝(MTT)为显色剂，测定了内生真菌Ppf4菌液和菌丝提取物的最低抑制浓度(MIC)，菌丝提取物对大肠杆菌、根癌土壤杆菌和溶血葡萄球菌的MIC值分别为：1.50mg/mL、1.50mg/mL和1.00mg/mL。菌液提取物对大肠杆菌、根癌土壤杆菌、黄瓜角斑病菌、溶血葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的MIC值分别为：0.25mg/mL、0.125mg/mL、1.50mg/mL、0.25mg/mL和1.50mg/mL。

6、抗菌化合物的追踪分离特征

通过薄层层析-生物自显影抗菌活性检测，对内生真菌Ppf4培养物的提取物进行反复的柱层析，包括常规的硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析、RP-18反相柱层析，分离到3个抗菌化合物。

7、抗菌化合物的结构特征

追踪分离得到的3个抗菌化合物，经结构解析，分别为：5α，8α-过氧麦角甾-6，22-二烯-3β-醇(分子式为C₂₈H₄₄O₃，分子量为428)；麦角甾-8(9)，22-二烯-3β，5α，6β，7α-四醇(分子式为C₂₈H₄₆O₄，分子量为446)；丁二酸(分子式为C₄H₆O₄，分子量为118)。

8、抗菌化合物的抗菌活性特征

内生镰孢菌Ppf4中3个抗菌化合物对四种革兰氏阴性细菌(大肠杆菌、根癌土壤杆菌、黄瓜角斑病菌、番茄细菌斑点病菌)和两种革兰氏阳性细菌(枯草芽孢杆菌、溶血葡萄球菌)，以及稻瘟菌的孢子萌发均表现出较强的抑制活性。

附图说明

图1为内生真菌Ppf4菌落正面。

图2为内生真菌Ppf4菌落背面。

图3为内生真菌Ppf4的菌丝、分生孢子梗、分生孢子。

图4为内生真菌Ppf4的分生孢子。

图5为内生真菌Ppf4同源性的系统发育树图。

本发明的优点：本发明首次明确了具有广谱抗菌活性的内生镰孢菌Ppf4菌株的微生物学分类地位，同时发现该菌提取物对大肠杆菌、根癌土壤杆菌、番茄细菌斑点病菌、黄瓜角斑病菌、溶血葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的生长具有明显的抑制作用。采用活性追踪的分离方法，从Ppf4菌株中分离到3个具有明显抗菌活性的化合物：5α，8α-过氧麦角甾-6，22-二烯-3β-醇、麦角甾-8(9)，22-二烯-3β，5α，6β，7α-四醇和丁二酸。本发明的目的是利用植物内生真菌资源，以求获得天然抗生素类成分，为探讨内生真菌的生理生态功能提供依据。

为了更好地理解本发明，下面结合本发明的实施例进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。

具体实施方式

实施例1：内生真菌Ppf4的分离

采集新鲜的滇重楼根状茎，表面先用70％乙醇处理30s，然后用0.2％氯化汞处理20min以进行彻底的表面灭菌，无菌条件下去除表皮，将根状茎分成约0.5cm×0.5cm×0.5cm大小的块段，摆放在PDA培养基上，每皿1块，在25℃，光照条件下培养至第7～20天，从每个菌落的边缘挑取一小段菌丝接种到PDA培养基上进行纯化培养，连续纯化培养4-5次，至菌落形态一致。将纯化后的菌株在PDA斜面上保存，其中一株内生真菌的编号为Ppf4。

实施例2：内生真菌Ppf4菌株提取物的抗菌活性

采用琼脂打孔药剂扩散法，分别对内生真菌Ppf4菌液和菌丝提取物进行检测，结果见表1。

表1  内生真菌Ppf4提取物的抗细菌活性

注：抑制效果是基于生长抑制区域的直径(mm)进行估算的(-：表示无抑制效果；+：表示0<D≤10；++：表示10<D≤20；+++：表示20<D≤35)。每孔中提取物量为2.5mg。CK^-：为空白对照，每孔为50μL 10％的DMSO。CK⁺：为阳性对照，每孔为10μg的硫酸链霉素。

采用多孔板液体稀释法，以噻唑蓝(MTT)为显色剂，测定了内生真菌Ppf4菌液和菌丝提取物对细菌生长的最低抑制浓度(MIC)，结果见表2。

表2  内生真菌Ppf4提取物对细菌生长的最低抑制浓度

注：表中数据为MIC(mg/mL)；CK^-为溶剂对照(4％的乙醇)；CK⁺为阳性对照(硫酸链霉素)；“*”表明没有检测到MIC值。“-”表明无抑制效果

实施例3：内生真菌Ppf4菌株的形态特征观察

内生真菌Ppf4在PDA培养基上25℃培养，菌落疏松，绒毛状，浅红色至暗红色，边缘白色，表面有明显的水滴，背部产生大量红色色素，分生孢子梗细长，分隔，分生孢子无色，单胞，聚集在粘液滴中，分生孢子卵圆形，长椭圆形，4.8-16.8μm×2.9-6.0μm。形态特征图分别见图1～图4。在培养条件下，未发现Ppf4的有性世代。

实施例4：内生真菌Ppf4菌株ITS序列分析与分子鉴定

首先将在平板上活化的Ppf4菌株的菌丝转移到PDA液体培养基中，悬浮培养5天后获得新鲜的菌丝，采用常规的分子生物学方法提取基因组DNA。运用PCR技术，DNA扩增采用ITS通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。DNA测序所用的引物分别为ITS1和ITS4，采用ABI PRISM 3730测序仪，分别进行正向(5′→3′)和反向(3′→5′)双向测序。

反向序列经DNAMAN软件反向互补后与正向序列拼接形成′→3′完整序列。把所得的IST rDNA序列提交到GenBank数据库(National Center for Biotechnology Information Website，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，获得序列号(accession number)EF495241。利用Blast工具进行序列比对，找出与该序列相似度最高的菌的序列信息。Ppf4菌株的ITS序列与镰孢菌(Fusarium sp.)DQ780425的ITS序列相似度为99.0％。

根据Blast比对结果，从中抽取与所分离的内生真菌Ppf4菌株序列相似性高的菌株的序列，采用ClustalX 1.8软件进行序列对准，再用MEGA软件计算遗传距离，然后利用距离依靠法中的邻位相连法(Neighbor-joining，NJ)构建进化树，计算Bootstrap值来评价系统发育树的可靠性。Ppf4同源性的系统发育树图见图5

实施例5：内生真菌Ppf4的发酵工艺和提取物的制备

本发明采用的是摇床发酵，1000mL体积的三角瓶中盛马铃薯-葡萄糖(PD)液体培养基400mL，将预先培养好的Ppf4菌丝接种到已灭菌的培养基中，在25±1℃、120rpm下暗培养7天，得总发酵液60L，通过减压过滤获得菌丝和菌液，菌液依次用等体积的石油醚(重复3次)和正丁醇(重复3次)萃取，分别得浸膏1.2g和163.7g。菌丝阴干后，用丙酮提取3次，得浸膏45g。菌丝体用水混悬后，依次用等体积石油醚(重复3次)和正丁醇(重复3次)萃取，得到石油醚和正丁醇层各9.5g和32.1g。通过薄层层析(TLC)和薄层层析-生物自显影(TLC-bioautography)抗菌活性检测，表明菌丝石油醚萃取部分和菌液石油醚萃取部分所含成分一致，并具有较好的抗菌活性，故将菌丝和菌液石油醚部分合并(10.7g)。

实施例6：内生真菌Ppf4抗菌活性成分的追踪分离

取实施例5中石油醚合并部分样品10g，丙酮溶解后，正相硅胶(200-300目)15g拌样，硅胶(200-300目)100g装柱，环己烷-丙酮系统梯度洗脱。环己烷:丙酮＝100:20(v/v)组分合并后，经Sephadex LH-20和反相硅胶(RP-18)柱色谱纯化后得5α，8α-过氧麦角甾-6，22-二烯-3β-醇(8mg)，环己烷:丙酮＝100:30(v/v)组分合并经纯化后得麦角甾-8(9)，22-二烯-3β，5α，6β，7α-四醇(10mg)，环己烷:丙酮＝100:100(v/v)组分经重结晶得到丁二酸(100mg)。

实施例7：5α，8α-过氧麦角甾-6，22-二烯-3β-醇的结构鉴定

用实施例6所述的方法制备到一无色针状晶体(氯仿)。m.p.175-177℃；10％硫酸显绿色，提示该化合物可能为甾体。

EI-MS：428[M]⁺，410[M-H₂O]⁺，396[M-O₂]⁺，363[M-O₂-H₂O-CH₃]⁺，303[M-C₉H₁₇]⁺，253[M-H₂O-O₂-C₉H₁₇]⁺。

¹H-NMR(CDCl₃，300MHz)δ(ppm)：0.81(3H，d，J＝6.8Hz，H-26 or H-27)，0.84(3H，s，H-18)，0.85(3H，d，J＝6.8Hz，H-27或H-26)，0.90(3H，s，H-19)，0.92(3H，d，J＝6.8Hz，H-28)，1.01(3H，d，J＝6.6Hz，H-21)，3.99(1H，m，H-3)，5.18(1H，dd，J＝15.3，7.8Hz，H-23)，5.22(1H，dd，J＝15.3，7.8Hz，H-22)，6.26(1H，d，J＝8.5Hz，H-6)，6.52(1H，d，J＝8.5Hz，H-7)。

¹³C-NMR(CDCl₃，75MHz)δ(ppm)：12.9(C-18)，17.5(C-28)，18.2(C-19)，19.6(C-26)，19.9(C-27)，20.6(C-15)，20.9(C-21)，23.4(C-11)，28.6(C-16)，30.1(C-2)，33.1(C-25)，34.7(C-1)，36.9(C-4和C-10)，39.3(C-12)，39.7(C-20)，42.8(C-24)，44.6(C-13)，51.1(C-9)，51.7(C-14)，56.2(C-17)，66.4(C-3)，79.4(C-8)，82.1(C-5)，130.7(C-7)，132.3(C-23)，135.2(C-6)，135.4(C-22)。

¹H-NMR(CDCl₃，300MHz)谱在高场区给出的六个甲基质子信号δ：1.01(3H，d，J＝6.6Hz，H-21)、0.92(3H，d，J＝6.8Hz，H-28)、0.90(3H，s，H-19)、0.85(3H，d，J＝6.8Hz，H-27 or H-26)、0.84(3H，s，H-18)、0.81(3H，d，J＝6.8Hz，H-26 or H-27)，推测其基本骨架可能为麦角甾醇类；低场区δ 5.22(1H，dd，J＝15.3，7.8Hz，H-22)以及δ 5.18(1H，dd，J＝15.3，7.8Hz，H-2)氢信号，提示结构中存在-CH-CH＝CH-CH-片段，且两烯氢为E构型，与22(E)-麦角甾烯侧链中烯键的化学位移值及偶合情况均比较相近，说明该化合物可能为麦角甾烯醇；另外低场区还给出了δ：6.52(1H，d，J＝8.5Hz，H-7)和6.26(1H，d，J＝8.5Hz，H-6)两个烯氢信号，是与其它质子无偶合关系的双键氢信号，说明此双键的两个烯丙位为季碳，推测此双键在甾体母核环内。¹³C-NMR(CDCl₃，75MHz)谱中给出了3个连氧碳信号δ：82.1、79.4、66.4，但是在氢谱中只有一个连氧碳上的氢信号δ3.99(1H，m，H-3)(可能为3-羟基麦角甾醇3位上的H信号)，提示另外两个连氧碳为季碳。EI-MS中m/z：428[M]⁺、410[M-H₂O]⁺、396[M-2O]⁺、363[M-2O-H₂O-CH₃]⁺、303[M-C₉H₁₇]⁺、253[M-H₂O-2O-C₉H₁₇]⁺提示化合物结构中存在一个羟基，一个过氧桥和一个单烯侧链C₉H₁₇。结合氢谱与碳谱数据和EI-MS给出分子离子峰为m/z：428[M]⁺，推测分子式为C₂₈H₄₄O₃。与文献(汤海峰等。褐藻铁钉菜中的甾醇成分。中国海洋药物，2002，1(1)：1-4。)波谱数据进行对照基本一致，故推断该化合物为5α，8α-过氧麦角甾-6，22-二烯-3β-醇(5α，8α-Epidioxyergosta-6，22-dien-3β-ol)。其结构式如下：

实施例8：麦角甾-8(9)，22-二烯-3β，5α，6β，7α-四醇的结构鉴定

用实施例6所述的方法制备到一无色针状晶体(氯仿)。m.p.145-150℃；10％硫酸显绿色，提示该化合物可能为甾体。

¹H-NMR(CDCl₃，300MHz)δ(ppm)：0.58(3H，s，H-18)，0.82(3H，d，J＝6.6Hz，H-26 or H-27)，0.84(3H，d，J＝6.6Hz，H-27 or H-26)，0.92(3H，d，J＝6.7Hz，H-28)，1.02(3H，d，J＝6.6Hz，H-21)，1.14(3H，s，H-19)，3.32(1H，m，H-7)，3.96(1H，m，H-3)，4.21(1H，brs，H-6)，5.19(2H，m，H-22，23)。

¹³C-NMR(CDCl₃，75MHz)δ(ppm)：11.2(C-18)，17.6(C-28)，19.6(C-26)，19.9(C-27)，20.9(C-21)，22.8(C-19)，23.4(C-15)，23.8(C-11)，29.0(C-16)，30.2(C-1)，30.8(C-2)，33.1(C-25)，35.6(C-12)，37.9(C-10)，39.2(C-4)，40.4(C-20)，42.0(C-13)，42.8(C-24)，49.6(C-14)，53.6(C-17)，62.5(C-7)，65.6(C-5)，67.1(C-6)，68.6(C-3)，126.9(C-8)，132.0(C-23)，134.5(C-9)，135.5(C-22)。

¹H-NMR(CDCl₃，300MHz)谱高场区给出的六个甲基质子信号δ：1.14(3H，s，H-19)、1.02(3H，d，J＝6.6Hz，H-21)、0.92(3H，d，J＝6.7Hz，H-28)、0.84(3H，d，J＝6.6Hz，H-27或者H-26)、0.82(3H，d，J＝6.6Hz，H-26或者H-27)、0.58(3H，s，H-18)，提示其基本骨架可能为麦角甾醇烷；两个烯氢信号δ：5.19(2H，m，H-22，23)和三个连氧氢信号δ：4.21(1H，bs，H-6)、3.96(1H，m，H-3)、3.32(1H，m，H-7)。¹³C-NMR(CDCl₃，75MHz)谱中给出28个碳信号，其中有4个烯碳信号δ：135.5、134.5、132.0、126.9说明分子中存在两个双键，4个连氧碳信号δ：68.6、67.1、65.6、62.5，说明结构中有四个羟基，除此以外还给出了20个化学位移小于δ 60的碳信号。波谱数据与文献(Hou et al.Anew cytotoxic sterol produced by an endophytic fungus from Castaniopsis fissa at the South China Sea coast.Chinese Chemical Letters，2004，15(4)：419-422.)报道的麦角甾-8(9)，22-二烯-3β，5α，6β，7α-四醇相比较，基本一致，故确定该化合物为麦角甾-8(9)，22-二烯-3β，5α，6β，7α-四醇(Ergosta-8(9)，22-diene-3β，5α，6β，7α-tetraol)。其结构式如下：

实施例9：丁二酸的结构鉴定

用实施例6所述的方法制备到一白色块状晶体(甲醇)。m.p.184-186℃；溴甲酚绿试剂显色，说明分子中存在羧基基团。

¹H-NMR(DMSO-d₆，300MHz)δ(ppm)：2.42(4H，s，H-2，3)，说明分子中存在两个化学环境相同的亚甲基；12.16(2H，brs，H-1，4)，说明分子中存在两个羧酸，因此将该化合物鉴定为丁二酸(Butanedioicacid)。其结构式如下：

实施例10：化合物对细菌的抑制活性

用实施例6所述的方法，对从内生真菌Ppf4中分离到的3个抗菌活性成分：5α，8α-过氧麦角甾-6，22-二烯-3β-醇、麦角甾-8(9)，22-二烯-3β，5α，6β，7α-四醇、丁二酸进行抗细菌活性测定。

(1)活性测定的细菌菌株：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis ATCC 11562)(革兰氏阳性)；溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus ATCC 29970)(革兰氏阳性)；黄瓜角斑病菌(Pseudomonas lachrymansATCC 11921)(革兰氏阴性)；根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens ATCC 11158)(革兰氏阴性)；大肠杆菌(Escherichia coliATCC 25922)(革兰氏阴性)；番茄细菌斑点病菌(Xanthomonas vesicatoria ATCC11633)(革兰氏阴性)。上述供试菌株长期保存在-20℃下，在活性测定前，需要在LB平板上对供试细菌进行活化培养(28℃，暗)48h，然后挑取单菌落，在LB液体培养基中摇培(28℃，暗，150rpm)24h，然后继代培养8-12h，菌液浓度达到10⁸cfu/mL，即可用于活性测定。

(2)培养基：采用LB琼脂培养基(酵母浸膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，琼脂20g/L，pH 7.0)和LB液体培养基(酵母浸膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，pH 7.0)。

(3)抗菌活性测定

最低抑制浓度(MIC)的测定：采用多孔板-MTT法测定化合物对细菌的MIC，结果见表3。具体步骤如下。每孔加入浓度为10⁶cfu/mL的供试菌液90μL，然后加入不同浓度(20mg/mL、15mg/mL、10mg/mL、8.0mg/mL、6.0mg/mL、4.0mg/mL、2.0mg/mL、1.5mg/mL、1.0mg/mL、0.8mg/mL、0.6mg/mL、0.4mg/mL、0.2mg/mL、0.1mg/mL、0.05mg/mL、0.025mg/mL)的药液10μL(40％乙醇溶液，v/v)。而阳性对照为不同浓度(15mg/mL、10mg/mL、8.0mg/mL、6.0mg/mL、4.0mg/mL、2.0mg/mL、1.5mg/mL、1.0mg/mL、0.8mg/mL、0.6mg/mL、0.4mg/mL、0.2mg/mL、0.1mg/mL、0.05mg/mL、0.025mg/mL)的硫酸链霉素母液10μL(40％乙醇溶液，v/v)。空白对照(无乙醇)和溶剂对照(终浓度为4.0％乙醇)，每个处理设3个重复。

将多孔板于28℃暗培养24h后，每孔中加入5.0mg/mL的MTT溶液10μL(pH 7.2、0.2mol/L PBS溶液)，继续培养4h后，3000g下离心10min，弃去上清液，加入100％二甲基亚砜(DMSO)100μL，振荡30min，以终止反应并助其溶解。肉眼即可观察判断化合物的MIC值。为了进一步验证MIC值，从多孔板每个孔中吸取10μL培养液涂布到LB平板上，在28℃下培养24h后观察统计平板菌落数即可。

半抑制浓度(IC₅₀)的测定：采用多孔板-MTT法测定化合物对细菌的IC₅₀，结果见表3。具体步骤为：每孔加入浓度为10⁶cfu/mL的供试菌液90μL，然后加入不同浓度(2.0mg/mL、1.5mg/mL、1.0mg/mL、0.8mg/mL、0.6mg/mL、0.4mg/mL、0.2mg/mL、0.1mg/mL、0.05mg/mL、0.025mg/mL)的药液10μL(40％乙醇溶液，v/v)，同时设阳性对照、空白对照和溶剂对照，28℃暗培养24h后，每孔中加入5mg/mL的MTT溶液10μL，继续培养4h，3000g下离心10min，去上清液，再加入100％二甲基亚砜100μL，继续振荡30min，以终止反应并助其溶解。将显色的菌悬液在3000g下离心10min，上清液转到另一多孔板中，用酶标仪测定其在590nm处的吸光值(OD_590nm)，按下式计算药物抑制率(％)：

根据抑制率，查机率值表，可得抑制率机率值(Y)，将药液浓度(mg/mL)换算成浓度对数(X)，即可求出线性方程Y＝aX+b，根据线性方程可求出半数抑制浓度(IC₅₀)。本发明中的数据均为3次重复平均值。

表3  多孔板-MTT比色法测定化合物的抗细菌活性

实施例11：化合物对稻瘟菌孢子萌发的抑制活性

用实施例6所述的方法，从内生真菌Ppf4中追踪分离到3个抗菌活性成分：5α，8α-过氧麦角甾-6，22-二烯-3β-醇、麦角甾-8(9)，22-二烯-3β，5α，6β，7α-四醇和丁二酸，进行对稻瘟菌孢子萌发的抑制活性测定。

(1)培养基：采用燕麦西红柿培养基(Oat-tomato agar medium，OTA)。配制1L的燕麦西红柿培养基的步骤为：将成熟的西红柿切碎，用榨汁机榨汁，汁液用四层纱布过滤，取已过滤的汁液150mL待用。同时，称取燕麦片30g，加入1000mL去离子水，煮沸30min，注意边煮边搅拌。煮好的燕麦片用两层纱布过滤。收集滤液，然后往滤液中加入已准备好的番茄汁150mL和20g琼脂，加热融化，趁热用纱布过滤，然后加去离子水定容至1000mL。分装后121℃湿热灭菌20min。该培养基用于稻瘟菌的培养。

(2)供试的植物病原真菌：稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)。

(3)稻瘟菌活化培养：用灭菌的接种针从保存菌种的试管中挑取少量菌丝，接种到燕麦番茄汁培养基平板上，用封口膜封好，25℃下培养。

(4)稻瘟菌继代培养：倒燕麦番茄汁培养基平板，每皿倒培养基约40mL。用移液枪在稻瘟菌菌落中央滴加无菌水1mL，然后用灭菌后的接种针轻轻擦洗菌落表面，注意用力要轻，以免擦破培养基表面。待无菌水变浑浊后，再用移液枪吸取100μL滴加到倒好的燕麦番茄汁培养基平板表面，然后用玻璃涂棒将其涂散均匀。待培养基表面干燥后，盖好倒置25℃下培养。

(5)机械刺激诱导产孢：接种活化的稻瘟菌室温下培养48h后，在其表面滴加无菌水约3mL，然后用灭菌后的棉签轻轻擦洗菌丝，将菌丝机械擦断，连续擦洗两次，待灰色菌落变为黑色后即可，将表面的水倒掉，然后倒扣于灭菌后的吸水纸上，晾干水分，用三层灭菌后的纱布将皿口封住，置于干燥有光的条件下培养48h即可得到稻瘟菌孢子。

(6)配制化合物母液：称取从内生真菌Ppf4中追踪分离到的3个抗菌活性成分各1mg，加入乙醇溶解，配成2000μg/mL的母液，然后稀释成含20％乙醇的母液浓度梯度：400μg/mL、300μg/mL、200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL。

阳性对照采用多菌灵(Aldrich)，称取多菌灵1.0mg到Eppendorf管中，向其中加入纯乙醇溶液1.0mL，振荡溶解，得到1.0mg/mL的多菌灵母液。然后将多菌灵母液配制成系列浓度为0.03mg/mL、0.02mg/mL、0.016mg/mL、0.010mg/mL、0.004mg/mL、0.002mg/mL、0.001mg/mL，溶剂为20％乙醇的溶液。

(7)配制孢子悬浮液：在机械诱导产孢好的平板上滴加无菌水3.0mL，然后用无菌棉签轻轻擦洗菌落表面，洗下孢子，将孢子洗液装到1.0mL的离心管中，离心3次(离心力8000g，每次离心10min)。然后配制孢子悬液，利用血球记数板测定孢子浓度，将孢子浓度配制为2×10⁶个/mL。

(8)进行活性测定：准备洁净培养皿，然后在每个培养皿中放上四层吸水纸，进行灭菌。灭菌后，往每皿中加无菌水5.0mL，在吸水纸上平行放置两根无菌牙签。另准备好凹玻片，用75％的乙醇浸泡24h，然后晾干。在每个凹洞上滴加25μL配制好的稻瘟菌孢子悬浮液(2×10⁶个/mL)和25μL系列浓度梯度的Ppf4化合物溶液(滴加前应在振荡器上充分震荡，以保证孢子悬浮液和药剂溶液充分混匀)，这样得到Ppf4化合物的检测终浓度为200μg/mL、150μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL。而阳性对照的检测终浓度为15μg/mL、10μg/mL、8μg/mL、5μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL。同时设空白对照和溶剂对照(10％乙醇)，每个处理3个重复。然后将凹玻片放在培养皿中的牙签上，室温下培养7h后进行观察。

(9)观察记录实验结果和孢子萌发率的计算

在显微镜10×10(目镜×物镜)倍下观测每一凹玻片上的孢子萌发情况，选择3个不同的视野，每个视野中100个以上孢子，共数300个孢子，用计数器记下萌发的孢子数，将3个重复合到一块计算孢子萌发率(％)。

(10)数据处理和半抑制浓度的计算

试验结果采用Microsoft Excel软件进行数据整理，在分析中，供试样品浓度取对数(X)，抑制率换算成生物统计机率值(Y)，求得抑制活性回归方程(Y＝aX+b)，从而可以求得半抑制浓度(IC₅₀)。实验设空白对照和溶剂对照(10％乙醇，v/v)，每个处理两个重复。

(11)实验结果

化合物对稻瘟菌孢子萌发抑制活性结果见表4，从内生真菌Ppf4中分离到的3个化合物中，以5α，8α-过氧麦角甾-6，22-二烯-3β-醇的抑制活性最强，其次是丁二酸。

表4  化合物对稻瘟菌孢子萌发抑制活性

Claims (5)

1、一株产5α，8α-过氧麦角甾-6，22-二烯-3β-醇、麦角甾-8(9)，22-二烯-3β，5α，6β，7α-四醇和丁二酸的滇重楼内生真菌，其特征是命名为镰孢菌(Fusarium sp.)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册编号为CGMCC No.2473。

2、一种按权利要求1所述的内生真菌的分离方法，通过严格的表面消毒，从植物内部分离出来的，并通过形态和分子鉴定，将ITS rDNA序列提交到GenBank数据库，获得序列号EF495241。

3、一种从按权利要求1所述的内生真菌中分离5α，8α-过氧麦角甾-6，22-二烯-3β-醇的方法，该化合物对细菌生长和稻瘟菌孢子萌发具有抑制活性。

4、一种从按权利要求1所述的内生真菌中分离麦角甾-8(9)，22-二烯-3β，5α，6β，7α-四醇的方法，该化合物对细菌生长和稻瘟菌孢子萌发具有抑制活性。

5、一种从按权利要求1所述的内生真菌中分离丁二酸的方法，该化合物对细菌生长和稻瘟菌孢子萌发具有抑制活性。

Images