CN108486002B - 一株产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株及其生产胞外多糖的方法和胞外多糖的应用 - Google Patents

一株产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株及其生产胞外多糖的方法和胞外多糖的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株及其生产胞外多糖的方法和胞外多糖的应用，属于微生物技术领域。该菌株的名称为芽孢杆菌ND‑6(Bacillus sp.ND‑6)，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15227，保藏日期为2018年1月16日。本发明还公开了利用上述产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株生产胞外多糖的方法和应用。本发明的罗汉果内生菌菌株能生产胞外多糖，该胞外多糖在体外既有降糖作用又有抗氧化作用，将为开发糖尿病预防、治疗药物提供新的思路，是一个非常有潜力的菌株。

Description

一株产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株及其生产胞外多糖的方 法和胞外多糖的应用
技术领域
本发明涉及一株产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株及其生产胞外多糖的方法和胞外多糖的应用，属于微生物技术领域。
背景技术
罗汉果[Siraitia grosvenorii(Swingle)C.Jeffrey]为葫芦科罗汉果属的多年生宿根茎性藤本植物罗汉果的果实，是我国特有植物，生长于广西、广东、江西、湖南及贵州等地，其中广西桂林市永福县是罗汉果发源地和主产地。罗汉果果实富含多种人体必需氨基酸、微量元素以及多种维生素等，此外含有黄酮、多糖、甜甙和多酚等活性成分。现代药理研究证实，罗汉果具有多种药理作用如镇咳平喘、润肠通便、降血糖、抗氧化和提高免疫力等，具有良好的保健价值。
植物内生菌是指其生活史中某一阶段或整个阶段生活在生长健康的植物组织或细胞内，并对宿主植物没有引起明显病害症状的一类微生物群，其主要包括内生细菌、内生真菌、内生放线菌这三种类群。植物内生真菌独特多样性的微生物类群，造就了其非常丰富的次级代谢产物，是近年来人们寻找新型杀虫、抗菌、抗肿瘤、抗氧化等天然药物的重要资源。近年来，新药研究的一个热点问题在于天然药物的筛选，大多数情况下以天然产物为先导，近年来的研究表明，内生真菌与宿主协同进化，可以产生与宿主相同或相似的代谢产物，对相应的内生真菌及其代谢产物的研究已经成为寻找重要代谢产物的一种新途经。
随着生物技术应用的深入，以微生物发酵方法生产药物得到更多企业的青睐。目前，很多药用成分都是通过微生物发酵生产获得的，这大大提高了产量，简化了加工过程的复杂性，有效降低了成本。微生物发酵是获得药理生物活性物质的重要途径。而扩大微生物资源，提高微生物的多样性，可获得多样性代谢产物是新药开发的重要保证。研究表明，新植物分离得到的内生菌通常都会产生新的代谢产物，这些是发现新的天然产物的理想途径。因此从植物内生菌次级代谢产物中分离出结构新颖、具有较好药理活性的化合物已渐渐成为新药研发的先导。植物内生菌可以产生与宿主植物结构相同或相似的生物活性物质，从而拓宽了药用资源并且具有巨大的应用价值。
罗汉果皂苷具有诸多保健功效，已有的研究指出罗汉果皂苷或其苷元具有抗氧化、防癌及降血糖等功效。因此，如果能从罗汉果中分离出内生菌筛选出对人体有益的成分，研究来自于罗汉果内生菌的活性成分，可拓宽化学成分的来源，增加获得活性成分的来源，将有重要的实际应用意义。
自由基是人体正常生理反应的产物，但是受到外界条件的刺激和一些特殊情况下会刺激自由基过多的产生，如果自由基过多或清除过慢，具有高度的活泼性和极强的氧化反应能力的自由基就会对生物膜和其它组织造成损伤、破坏细胞结构、干扰人体的正常代谢活动、引起疾病、加速人体衰老进程。越来越多的临床和干预实验，以及来自基础研究的证据表明，自由基参与许多疾病的病理过程，从而诱发如心血管疾病、某些癌症、老年白内障和黄斑变性、某些炎症及多种神经元疾病。目前认为，老年性聋与自由基受损关系密切；自由基侵蚀胰脏细胞引起糖尿病与糖尿病也有比较复杂的关系等等。由此可见，自由基攻击生命大分子和各种细胞器造成组织损伤，是引起机体衰老的根本原因，也是诱发一些疾病的重大原因。因此，目前社会需要能够清除过多的自由基以保证人体健康的活性物质。清除自由基的过程就是抗氧化的过程，可以清除自由基的物质称为抗氧化物质，是抑制或消除以及减缓氧化反应的一类物质。随着健康意识的增强近年来抗氧化药物的开发与研究倍受人们的关注，目前天然抗氧化药物的开发已从单纯作为油脂和含脂食品的抗氧化药物，发展到作为人体内氧自由基的清除剂被应用。其天然抗氧化物质主要是从动植物中提取的，如维生素类、酶类和天然药物类等。但是动植物中天然抗氧化物质含量较低，提取工艺复杂，资源受限而且会使这些动植物资源遭到严重破坏，造成生物多样性和生态环境的损失。而通过微生物发酵法获得抗氧化药物不失为一个良好的途径。近年来，利用一些微生物具有产生和宿主相同或相似生理活性物质的特点，对植物来源菌进行了抗氧化活性成分的研究。
糖尿病是由胰岛素分泌不足和/或胰岛素作用受损引起的一组以高血糖为特征的代谢性疾病。流行病学的研究表明，餐后血糖水平高是引起糖尿病人并发症的重要因素，这些并发症是引起糖尿病死亡率增大的一个主要原因。所以，严格控制餐后血糖对糖尿病的防治具有非常重要的意义，而能够显著降低餐后血糖水平的抗糖尿病药物具有很大的应用价值。
目前对于Ⅱ型糖尿病的治疗药物中α-淀粉酶抑制剂(α-amylaseinhibitor简称α-AI)就是其中的一种。临床试验发现，α-AI类药物的副作用比前几种小，而且作用范围也较前几种广。对既不能用双胍类及磺脲类而又不能用胰岛素的糖尿病患者，α-AI是一种新型有效药物，可适用于各种类型糖尿病。1977年德国拜耳公司从游动放线菌的代谢产物中提取到拟低聚糖寡糖成分的抑制α-淀粉酶和葡萄糖苷酶的活性物质，并且开发为第一个α-AI类降糖药物阿卡波糖(Acarbose)，在1995年成功上市。
在糖尿病的防治中，减少各种糖尿病引发的并发症是治疗的关键。α-AI是一种糖苷水解酶抑制剂，它是第一个以降低餐后血糖为目标的新型糖尿病治疗药物，它可以通过抑制人体消化道内糖代谢的关键酶的活性，使血糖维持在一定水平，对糖尿病及其并发症具有良好的疗效，受到人们的青睐。在临床上具有很好的应用价值，可有效预防和治疗糖尿病和高脂血症，既可单独使用，也可以与其他降糖药或降血脂药联合使用。尤其适合长期使用以达到预防和治疗的作用。亚洲人的饮食结构以淀粉为主。因此，从控制机体糖代谢中的关键酶的活性入手，开发α-AI对特定人群的降糖，降脂及减肥具有极大的应用前景。因此，筛选和寻找有效、安全的α-AI是目前各国科学家关注的热点之一。鉴于α-淀粉酶抑制剂的重要生物学功能，许多学者对不同来源的α-淀粉酶抑制剂结构、理化特性以及药理作用进行研究，以寻找更多更好的α-淀粉酶抑制剂。
综上所述，抗氧化药物和降糖活性成分的研究是目前社会的热点问题。但目前尚未有从罗汉果内生菌中得到的芽孢杆菌属中所产的具有体外降糖活性并兼具抗氧化的多糖的菌株的相关报道。
发明内容
本申请的发明人先从罗汉果根、茎和果实中分离出罗汉果内生菌菌株，对菌株进行液体摇床发酵，获得的发酵液经离心，取上清液，浓缩，得到发酵液。然后采用体外降糖的测定方法筛选具有降糖的菌株，挑选出一株具有体外降糖活性的优势菌株——芽孢杆菌ND-6(Bacillussp.ND-6)。在此基础上对该菌株的经离心、浓缩的发酵液进行系统溶剂萃取，获得4个相进行体外降糖和体外抗氧化测定，筛选出有效相；对有效相再次进行分离(醇沉法和去蛋白)，获得2部分，然后采用体外降糖和体外抗氧化的测定方法筛选具有降糖和抗氧化的成分，筛选出该芽孢杆菌ND-6具有降糖兼具抗氧化活性的成分——多糖，最终筛选出一株产胞外多糖的具有降糖兼具抗氧化活性的菌株芽孢杆菌ND-6。
本发明的目的之一，是提供一株产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株。本发明的罗汉果内生菌菌株能生产胞外多糖，该胞外多糖既有降糖作用又有抗氧化作用，将为开发糖尿病预防、治疗药物提供新的思路，是一个非常有潜力的菌株。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一株产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株，该菌株的名称为芽孢杆菌ND-6(Bacillussp.ND-6)，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.15227，保藏日期为2018年1月16日。
本发明的产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株，具有以下特性：
(1)个体形态：菌体呈杆状，革兰氏染色为阳性，有芽孢，且芽孢位于菌体中间。
(2)在固体培养基平板上的菌落性状：菌落呈圆形、中间皱起，边缘平整，略带黄色。
(3)在液体发酵培养基中发酵液较混浊，液面有菌膜，底有絮状沉淀。
(4)生长适温30-50℃，pH值5.0-6.0，好氧。
上述固体培养基由葡萄糖10g、蛋白胨5g、酵母浸膏5g、K2HPO4 0.2g、MgSO4·7H2O0.2g、Na2CO3 0.2g、琼脂20g和水1L组成，自然pH值。
上述固体培养基在使用前，先于0.1MPa下121℃灭菌15min。
上述液体发酵培养基由可溶性淀粉10g、蛋白胨5g、酵母浸膏5g、K2HPO4 0.2g、MgSO4·7H2O 0.2g、Na2CO3 0.2g和水1L组成，上述原料混合均匀后即得液体发酵培养基，自然pH值。
上述液体发酵培养基在使用前，先于0.1MPa下121℃灭菌15min。
本发明的产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株的鉴定
本申请的发明人将上述筛选得到的产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株暂时命名为ND-6。为了进一步确定菌株ND-6的种属,用细菌的16S rDNA通用引物从ND-6的基因组DNA中PCR扩增得到1条1445bp的条带,将PCR扩增产物测序,获得的序列进行同源序列检索(送检单位：北京六合华大基因科技有限公司武汉分公司),结果显示ND-6与Bacillusamyloliquefaciens、Bacillussubtilis、Bacillussp.、Bacillusvelezensis等的16S rDNA序列同源性超过99％。因此，菌株ND-6在分子系统发育分类学上属于芽孢杆菌。该结果与生理生化鉴定结果相符，因此综合菌落形态、菌体形态特征观察、分子生物学测序结果，最终确定ND-6菌株为芽孢杆菌，命名为Bacillussp.ND-6，简称ND-6。
本发明的目的之二，是提供上述产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株在生产胞外多糖中的应用。本发明的产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株可以生产胞外多糖，且该胞外多糖具有良好的降糖活性和抗氧化活性。而自由基侵蚀胰脏细胞会引起糖尿病，抗氧化就可能预防糖尿病。因此，该多糖是一种有潜力的用于抗氧化药物和预防和治疗糖尿病的活性成分。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：上述产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株在生产胞外多糖中的应用。
糖尿病是目前危害人类健康的一种常见病和多发病，糖尿病的预防和治疗一直是人类攻克的目标之一，世界各国一直都在寻找新的有效的预防和治疗糖尿病的活性成分，α-淀粉酶抑制剂是目前用于治疗糖尿病的一种药物，筛选和寻找有效、安全的α-AI是目前各国科学家关注的热点之一。同时，由于α-AI是一种糖苷水解酶抑制剂，而亚洲人的饮食结构以淀粉为主，该酶的抑制剂更适合我国国情。因此，目前国内外都在寻找更多更好的α-淀粉酶抑制剂。
采用本发明的产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株生产得到的胞外多糖在体外降糖试验中呈现良好的降糖活性，其降糖效果与现有的降糖药物阿卡波糖(一种α-淀粉酶抑制剂)相比具有较强的降糖活性。当浓度为5mg/mL时，该多糖对α-淀粉酶的抑制率为87.79％(阿卡波糖为86.79％)，表明该多糖对α-淀粉酶的抑制率与阳性对照阿卡波糖对α-淀粉酶的抑制率的相当，显示出良好的体外降糖活性。
因此，本发明的产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株Bacillus sp.ND-6所产的胞外多糖在体外试验中显示出较强的降糖活性，是一个非常有潜力的降糖活性成分，有望为糖尿病的预防和药物的开发提供新的活性成分和来源。
越来越多的临床和干预实验，以及来自基础研究的证据表明，自由基参与许多疾病的病理过程，自由基攻击生命大分子和各种细胞器造成组织损伤，是引起机体衰老的根本原因，也是诱发一些疾病的重大原因。因此，目前社会需要能够清除过多的自由基以保证人体健康的活性物质——抗氧化药物。抗氧化、抗衰老一直是人类的梦想，随着健康意识的增强近年来抗氧化药物的开发与研究倍受人们的关注。
采用本发明的产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株生产得到的胞外多糖在体外抗氧化试验中也呈现良好的抗氧化活性，其胞外多糖与抗氧化剂Vc相比，当浓度为1mg/mL时，对DPPH·的清除率为95.73％(Vc为95.77％)、对羟基自由基(·OH)的清除率为92.15％(Vc为99.36％)、总还原力为0.488(Vc为0.945)，表明该胞外多糖的抗氧化能力基本与Vc相当，显示出良好的体外抗氧化能力。
因此，本发明的产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株Bacillus sp.ND-6所产的胞外多糖在体外试验中显示出较强的抗氧化活性，有望为抗氧化药物的开发提供新的活性成分和来源。
本发明的目的之三，是提供利用上述产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株生产胞外多糖的方法。本发明采用上述产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株Bacillus sp.ND-6为出发菌株，生产胞外多糖，且该多糖具有良好的体外降糖作用和抗氧化作用,且工艺简单，市场前景广阔，适合规模化生产。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种利用上述产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株生产胞外多糖的方法，包括如下步骤：
步骤1：将权利要求1所述的产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株Bacillus sp.ND-6划线接种于新鲜的斜面培养基上，于37℃培养24h，得到活化的斜面菌种；
步骤2：将步骤1得到的活化的斜面菌种，用接种环挑取5环接种于装有70mL种子培养基的250mL锥形瓶中，于37℃、160r/min摇床培养24h，即得种子液；
然后按照5％(v/v)-8％(v/v)的接种量，将种子液接种于装有600mL液体发酵培养基的1000mL锥形瓶中，35℃、160r/min摇床培养72h，得到发酵液；
步骤3：将步骤2得到的发酵液真空抽滤，得到的抽滤液进行减压浓缩，纯化,再透析，对透析液进行真空冷冻干燥，即得到胞外多糖。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，步骤1中，所述斜面培养基由葡萄糖10g、蛋白胨5g、酵母浸膏5g、K2HPO40.2g、MgSO4·7H2O 0.2g、Na2CO3 0.2g、琼脂20g和水1L组成，自然pH值。
上述斜面培养基在使用前，先于0.1MPa下121℃灭菌15min。
进一步，步骤2中，所述种子培养基和液体发酵培养基均由可溶性淀粉10g、蛋白胨5g、酵母浸膏5g、K2HPO4 0.2g、MgSO4·7H2O 0.2g、Na2CO3 0.2g和水1L组成，上述原料混合均匀后即得种子培养基或液体发酵培养基，pH值自然。
上述液体种子培养基或发酵培养基在使用前，先于0.1MPa下121℃灭菌15min。
进一步，步骤3中，所述减压浓缩为浓缩至发酵液体积的1/8-1/10。
进一步，步骤3中，所述纯化的方法为：在减压浓缩后的溶液中，加入95％(v/v)的乙醇溶液，至乙醇含量达到60％(v/v)以上，于4℃冷藏12h，4000r/min离心15min，得第一次沉淀和第一次上清液；在第一次上清液再加95％(v/v)的乙醇溶液，至乙醇含量达到70％(v/v)，于4℃冷藏12h，4000r/min离心15min，得第二次沉淀和第二次上清液；合并第一次沉淀和第二次沉淀，再按质量体积比(g/mL)1:25的比例，加蒸馏水溶解后过滤，滤液加95％(v/v)的乙醇，至乙醇含量达到80％(v/v)，于4℃冷藏12h，4000r/min离心15min，得沉淀物粗多糖；将沉淀物粗多糖用蒸馏水溶解为质量百分数为5％-10％的溶液后，加三氯乙酸溶液，震荡混合均匀，使溶液中三氯乙酸的含量达到15％(v/v)，5-10℃静置12h，4000r/min离心15min，得蛋白质沉淀和上清液；上清液再加入95％(v/v)的乙醇，至乙醇含量达到80％(v/v)，于4℃冷藏12h，4000r/min离心15min，得到胞外多糖沉淀物。
进一步，步骤3中，所述透析的方法为：在胞外多糖沉淀物里，按质量体积比(g/mL)1:20的比例，加蒸馏水溶解，得到胞外多糖沉淀物的水溶液；将胞外多糖沉淀物的水溶液装入透析袋，放入蒸馏水中，胞外多糖沉淀物的水溶液与蒸馏水的体积比为1:20，透析48h，12h换一次水，换3次蒸馏水，得到透析液。
本发明的目的之四，是提供利用上述生产胞外多糖的方法生产的胞外多糖。本发明的胞外多糖，由上述生产胞外多糖的方法所生产，具有良好的体外降糖作用和抗氧化作用。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种上述生产胞外多糖的方法生产的胞外多糖。
本发明的目的之五，是提供利用上述胞外多糖在制备降血糖药物中的应用。本发明的胞外多糖具有良好的体外降糖活性，是一个非常有潜力的降糖活性成分，有望为糖尿病的预防和药物的开发提供新的活性成分和来源，有望应用于制备降血糖药物。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：上述胞外多糖在制备降血糖药物中的作用。
糖尿病是目前危害人类健康的一种常见病和多发病，糖尿病的预防和治疗一直是人类攻克的目标之一，世界各国一直都在寻找新的有效的预防和治疗糖尿病的活性成分，α-淀粉酶抑制剂是目前用于治疗糖尿病的一种药物，筛选和寻找有效、安全的α-AI是目前各国科学家关注的热点之一。同时，由于α-AI是一种糖苷水解酶抑制剂，而亚洲人的饮食结构以淀粉为主，该酶的抑制剂更适合我国国情。因此，目前国内外都在寻找更多更好的α-淀粉酶抑制剂。
采用本发明的胞外多糖利用Bernfeld法进行体外降糖活性测定，当浓度为5mg/mL时，该多糖对α-淀粉酶的抑制率为87.79％，降糖药物阿卡波糖(一种α-淀粉酶抑制剂)为86.79％，表明该多糖对α-淀粉酶的抑制率与阳性对照阿卡波糖对α-淀粉酶的抑制率的相当，显示出良好的体外降糖活性。
因此，本发明的胞外多糖在体外试验中显示出较强的降糖活性，是一个非常有潜力的降糖活性成分，有望为糖尿病的预防和药物的开发提供新的活性成分和来源，有望应用于制备降血糖药物。
本发明的目的之六，是提供利用上述胞外多糖在制备抗氧化药物中的应用。本发明的胞外多糖在体外试验中显示出较强的抗氧化活性，有望为抗氧化药物的开发提供新的活性成分和来源，有望应用于制备抗氧化药物。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：上述胞外多糖在制备抗氧化药物中的应用。
越来越多的临床和干预实验，以及来自基础研究的证据表明，自由基参与许多疾病的病理过程，自由基攻击生命大分子和各种细胞器造成组织损伤，是引起机体衰老的根本原因，也是诱发一些疾病的重大原因。因此，目前社会需要能够清除过多的自由基以保证人体健康的活性物质——抗氧化药物。抗氧化、抗衰老一直是人类的梦想，随着健康意识的增强近年来抗氧化药物的开发与研究倍受人们的关注。
本发明的胞外多糖在体外抗氧化试验中也呈现良好的抗氧化活性，其胞外多糖与抗氧化剂Vc相比，当浓度为1mg/mL时，对DPPH·的清除率为95.73％(Vc为95.77％)、对羟基自由基(·OH)的清除率为92.15％(Vc为99.36％)、总还原力为0.488(Vc为0.945)，表明该胞外多糖的抗氧化能力基本与Vc相当，显示出良好的体外抗氧化能力。
因此，本发明的胞外多糖在体外试验中显示出较强的抗氧化活性，有望为抗氧化药物的开发提供新的活性成分和来源，有望应用于制备抗氧化药物。
本发明的有益效果是：
1.本发明的罗汉果内生菌菌株能生产胞外多糖，该胞外多糖既有降糖作用又有抗氧化作用，将为开发糖尿病预防、治疗药物提供新的思路，是一个非常有潜力的菌株。
2.本发明的产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株可以生产胞外多糖，且该多糖具有良好的降糖活性和抗氧化活性。自由基侵蚀胰脏细胞会引起糖尿病，抗氧化就可能预防糖尿病。因此，该多糖是一种有潜力的用于抗氧化药物和预防和治疗糖尿病的活性成分。
3.本发明采用上述产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株Bacillus sp.ND-6为出发菌株，生产胞外多糖，且该多糖具有良好的体外降糖作用和抗氧化作用,且工艺简单，市场前景广阔，适合规模化生产。
4.本发明的胞外多糖，由上述生产胞外多糖的方法所生产，具有良好的体外降糖作用和抗氧化作用。
5.本发明的胞外多糖在体外降糖试验中与现有降糖药物阿卡波糖(α-淀粉酶抑制剂)相比显示出较强的降糖活性，有望应用于制备降血糖药物。
6.本发明的胞外多糖在体外抗氧化试验中与现有抗氧化剂Vc相比显示出较强的体外抗氧化活性，有望应用于制备抗氧化药物。
附图说明
图1为本发明的产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株的菌落图。
图2为本发明的产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株的细胞形态及芽孢染色图(10X显微镜视野)。
图3为本发明的产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株采用滤纸片法初筛降糖菌株的空白对照的结果图。
图4为本发明的产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株采用滤纸片法初筛降糖菌株的阳性对照的结果图。
图5为本发明的产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株采用滤纸片法初筛降糖菌株的NR-8菌株的结果图。
图6为本发明的产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株采用滤纸片法初筛降糖菌株的ND-6菌株的结果图。
图7为本发明的产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株采用滤纸片法初筛降糖菌株的NR-1菌株的结果图。
图8为本发明的产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株采用滤纸片法复筛降糖菌株的水相的结果图。
图9为本发明的产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株采用滤纸片法复筛降糖菌株的空白对照的结果图。
图10为本发明的产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株采用滤纸片法复筛降糖菌株的阳性对照的结果图。
图11为本发明的产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株采用滤纸片法复筛降糖菌株的50％(v/v)乙醇溶液的结果图。
图12为本发明的产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株采用滤纸片法复筛降糖菌株的正丁醇相的结果图。
图13为本发明的产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株采用滤纸片法复筛降糖菌株的5乙酸乙酯相的结果图。
图14为本发明的产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株采用滤纸片法复筛降糖菌株的石油醚相的结果图。
图15为本发明的产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物图。
图16为本发明的产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株的系统发育图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1：一株产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株
一株产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株，该菌株的名称为芽孢杆菌ND-6(Bacillussp.ND-6)，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.15227，保藏日期为2018年1月16日。
实施例2：上述产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株的筛选方法
上述产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株的筛选方法，包括如下步骤：
步骤1：从罗汉果的根、茎和果实中分离、纯化出罗汉果内生菌菌株
罗汉果材料的消毒：在超净工作台上，将洗净的罗汉果根、茎和果实，分别用以下方法进行表面消毒处理。
根：先用75％(v/v)酒精浸泡2min，再用质量百分数为3.0％的NaClO溶液浸泡5min，然后用75％(v/v)酒精浸泡30s,最后用无菌水冲洗5次，每次5min。
茎：先用75％(v/v)酒精浸泡3min，再用质量百分数为3.0％的NaClO溶液浸泡8min，然后75％(v/v)酒精浸泡30s，最后用无菌水冲洗5次，每次5min。
果实：先用75％(v/v)酒精浸泡3min，无菌水冲洗2次，再用质量百分数为3.0％的NaClO溶液浸泡10min，无菌水冲洗2次，最后用75％(v/v)酒精浸泡30s，无菌水冲洗3次，每次5min。
在以上的根、茎和果实在表面消毒处理中最后一次无菌水冲洗的下来的水中，吸取1mL涂布于PDA培养基平板上(至少设三个重复),在30℃培养5d，做为阴性对照。如果只有阴性对照上没有任何微生物菌落生长，则为消毒合格，可以进行下一步罗汉果组织材料的剪切和接种。
对已完成表面消毒处理的罗汉果的茎、根和果实进行剪切，取大小约为0.5cm×0.5cm×0.2cm的组织，分别接种到PDA培养基平板上(至少设三个重复)，分别置于26℃、37℃培养，观察生长情况，待PDA培养基平板上罗汉果组织周围长出菌落，分别挑起各菌落再在PDA培养基平板上稀释涂布进行分离、纯化，最后得到各个单的菌落，即得到罗汉果内生菌菌株。
其中，PDA培养基由如下方法制备得到：称取已去皮马铃薯200g，切块，煮30min，四层纱布过滤，加入蔗糖20g，琼脂20g，水定容至1000mL，自然pH值，0.1MPa下121℃灭菌30min。
将罗汉果内生菌菌株接种于斜面培养基上，4℃保藏，备用。
其中，所述斜面培养基为可溶性淀粉10g、蛋白胨5g、酵母浸膏5g、K2HPO4 0.2g、MgSO4·7H2O 0.2g、Na2CO3 0.1g、琼脂20g和水1L，自然pH值。
上述斜面培养基在使用前，先于0.1MPa下121℃灭菌15min。
步骤2：发酵
步骤2.1：斜面菌种活化
将步骤1保藏的菌株接种于斜面培养基上，于30℃培养24h，得到活化的斜面菌种；
步骤2.2：发酵
将步骤1.1得到的活化的斜面菌种，用接种环挑取5环，接种于装有300mL液体发酵培养基(将斜面培养基中的琼脂去除即为发酵培养基)的500mL锥形瓶中，30℃、160r/min摇床培养72h，真空抽滤，得到发酵液；
步骤3：降糖菌株的筛选
在降糖试验中均以阿卡波糖为阳性对照。
步骤3.1：降糖菌株的初筛
将步骤2所得的各个菌株的发酵液，采用α-淀粉酶抑制剂筛选模型中的滤纸片法对降糖菌株进行初筛。
上述滤纸片法的具体方法为：
琼脂板平皿配制：取质量百分数为1％的可溶性淀粉和质量百分数为1.5％的琼脂，混合均匀后，煮好，得到混合液；
每个直径为12cm的培养皿加入20mL上述混合液，冷却至室温，待琼脂凝固，得到冷凝的琼脂平板。
用打孔器将厚度为0.5mm的滤纸打成直径为6mm的小圆片，用镊子将上述滤纸小圆片放在上述冷凝的琼脂平板上，每个平皿放3个滤纸小圆片。
样品：取干净试管，分别加入步骤2.2的发酵液5mL(样品)以及浓度为1mg/mL的α-淀粉酶溶液5mL，在37℃的水浴中结合作用10min，得到样品混合液。
用微量取样器吸取50μL上述样品混合液，滴入上述琼脂平板里的每个滤纸小圆片上，然后置于37℃恒温箱保温24h后，滴入稀碘液，淹没平板10s，染色完成后倒掉稀碘液，加入蒸馏水洗掉残余的碘液，观察滤纸片周围颜色变化，用十字交叉的方法测量透明圈的直径。
空白对照：用蒸馏水代替步骤2.2的发酵液。
如果发酵液中没有抑制淀粉酶的活性成分，则无法抑制滤纸片上的淀粉酶分解平板上的淀粉，在37℃培养箱中放置24h后，用碘液染色后在滤纸片的周围因为混合溶液中的淀粉酶分解平板上的淀粉而形成较大的透明圈。反之，如果发酵溶液中含有抑制淀粉酶的活性成分，就可以抑制淀粉酶分解淀粉，在37℃培养箱中放置24h后，用碘液染色后在滤纸片的周围形成的透明圈就小(与空白对照相比)，并且，含有的抑制剂越多，透明圈越小。采用滤纸片法选出透明圈最小，以及比值较小的3-5株菌株，作为初筛菌株。
结果：如图3-图7所示，菌株ND-6、NR-1、NR-8在筛选平板上的的透明圈与阳性对照(阿卡波糖)的类似，与空白对照相比差异显著，透明圈都较小，表明这3株菌株所产的代谢产物具有降糖作用。因此，初筛获得3个降糖活性较强的菌株，分别是ND-6、NR-1、NR-8。
步骤3.2：降糖菌株的复筛
采用α-淀粉酶抑制剂筛选模型中的Bernfeld法，也叫3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法[1，2]对步骤3.1初筛选出的3个菌株的降糖活性进行复筛。
样品管：在具塞试管中加入发酵液0.25mL,与等量的浓度为1mg/mL的a-淀粉酶溶液在37℃水浴预温20min,然后加入质量百分数为1.5％的可溶性淀粉溶液0.5mL,准确反应5min，再加入DNS试剂1mL，沸水浴10min终止反应，流水冷却后,作适当稀释后在,540nm测定吸光度,记为A样品。
对照管：用蒸馏水代替a-淀粉酶,记为A本底基数；以0.5mL蒸馏水作空白,记作Amin，0.25mL的蒸馏水与0.25mL的a-淀粉酶作为最大值，记作Amax。a-淀粉酶抑制剂对α-淀粉酶活性的抑制活性用EA表示,还原糖产生量减少造成吸光值A的降低。计算方法如下：
阳性对照：称取阿卡波糖0.5g，定容至100mL备用，用时稀释10倍。
发酵液为采用步骤2的方法每株采用3次重复所得的发酵液。
EA(％)＝[(AEmax-AEmin)-(A样本-A本底基数)]/AEmax-AEmin)×100％
＝[(AEmax-A样本)/AEmax]×100％
其中,Emax为以水代替供试液；
Emin为以水代替供试液和α-的淀粉酶；
A本底基数为以水代替α-的淀粉酶。
通过测定和计算筛选出对α-淀粉酶抑制率最大的菌株，获得具有体外降糖作用的菌株。
结果：阿卡波糖的抑制率是50.1％，初筛中选出的3个菌株ND-6、NR-8、NR-1的三次平行发酵液经测定，对α-的淀粉酶的抑制率(三次平行试验的结果采用Q检验法检验[3])分别是48.5％、42.1％、35.8％，其中ND-6为最大，未经纯化的发酵液都显示出具有降糖作用。因此，选择菌株ND-6为降糖菌株。
步骤3.3：降糖菌株降糖部位的筛选
采用步骤3.1中的滤纸片法对降糖菌株ND-6降糖部位进行筛选。
对获得的降糖菌株ND-6采用步骤2.2的方法进行液体发酵，取发酵液300mL，减压浓缩成浸膏，然后用蒸馏水混悬，依次用体积比为3:1的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取三次，合并萃取液，分别得到石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相，三种有机相均减压浓缩成浸膏，用30mL的50％(v/v)乙醇配成待测液。然后采用滤纸片法测定4个相的样品的水解圈，筛选出水解圈最小的相为降糖有效部位。用50％(v/v)乙醇溶液做试剂对照，以排除假阳性。
结果：如图8-图14所示，与空白对照、阳性对照相比,降糖有效部位是水相，因为水相的透明圈最小。
步骤3.4：降糖菌株降糖部位有效成分的筛选
采用步骤3.1中的滤纸片法和步骤3.2中Bernfeld法对降糖菌株降糖部位有效成分进行筛选。
获得降糖有效部位后，采用化学成分预实验的方法初步确定其含有的化学成分，然后进行分离纯化后得到几种成分后在进行体外降糖活性测定即可找到降糖的有效成分。
采用化学成分预实验的方法可知，有效部位水相中主要含有蛋白质和多糖。因此，采用多糖纯化方法(醇沉法、三氯乙酸沉淀法除蛋白以及透析法)得到胞外多糖，其中采用三氯乙酸沉淀法，又可得到蛋白质。然后，将胞外多糖和蛋白质分别配成一定浓度(质量百分数)的水溶液，用于检测体外降糖活性成分。
其中胞外多糖的检测方法为Molish反应、Fehling反应、Tollen′s反应；蛋白质的检测方法为双缩脲反应，茚三酮[4]。用于检测沉淀物是否是多糖或是蛋白质。
纯化法：在发酵液中采用以下方法，沉淀出胞外多糖。具体步骤如下：
将步骤2得到的发酵液真空抽滤，得到的抽滤液进行减压浓缩至发酵液体积的1/8-1/10。
纯化的方法为：在减压浓缩后的溶液中，加入95％(v/v)的乙醇溶液，至乙醇含量达到60％(v/v)以上，于4℃冷藏12h，4000r/min离心15min，得第一次沉淀和第一次上清液；在第一次上清液再加95％(v/v)的乙醇溶液，至乙醇含量达到70％(v/v)，于4℃冷藏12h，4000r/min离心15min，得第二次沉淀和第二次上清液；合并第一次沉淀和第二次沉淀，再按质量体积比(g/mL)1:25的比例，加蒸馏水溶解后过滤，滤液加95％(v/v)的乙醇，至乙醇含量达到80％(v/v)，于4℃冷藏12h，4000r/min离心15min，得沉淀物粗多糖；将沉淀物粗多糖用蒸馏水溶解为质量百分数为5％-10％的溶液后，加三氯乙酸溶液，震荡混合均匀，使溶液中三氯乙酸的含量达到15％(v/v)，5-10℃静置12h，4000r/min离心15min，得蛋白质沉淀(样品1，经检测确认为蛋白质[4])和上清液；上清液再加入95％(v/v)的乙醇，至乙醇含量达到80％(v/v)，于4℃冷藏12h，4000r/min离心15min，得到胞外多糖沉淀物。
所述透析的方法为：在胞外多糖沉淀物里，按质量体积比(g/mL)1:20的比例，加蒸馏水溶解，得到胞外多糖沉淀物的水溶液；将胞外多糖沉淀物的水溶液装入透析袋，放入蒸馏水中，胞外多糖沉淀物的水溶液与蒸馏水的体积比为1:20，透析48h，12h换一次水，换3次蒸馏水，得到透析液。
对透析液进行真空冷冻干燥，即得到多糖(样品2)。经检测确认为多糖[4]。
将样品1、样品2分别用蒸馏水配制成浓度为1mg/mL的溶液，用蒸馏水将阿卡波糖亦配成相同浓度的溶液，采用步骤3.1中的滤纸片法进行降糖活性的测定，找到体外降糖有效成分。然后，把找到的有效成分用蒸馏水配制成梯度浓度，分别为1.25mg/mL、2.5mg/mL、5.0mg/mL，阿卡波糖亦配成相同浓度的溶液，再采用步骤3.2中Bernfeld法进行降糖活性的测定，最终找到该菌株有效成分体外降糖作用的量效关系。
结果：结果如表1所示。降糖有效成分是样品2的胞外多糖，样品1的蛋白质没有降糖作用。Bernfeld法结果显示，与阳性对照阿卡波糖相比随着样品2浓度的增加其降糖效果也增加，呈现剂量效应关系。当浓度为5.0mg/mL时，样品2(胞外多糖)的降糖效果与阳性对照阿卡波糖相当，可见该胞外多糖具有良好的降糖效果。从而确定降糖菌株ND-6的降糖成分是胞外多糖。
表1 Bernfeld法测定结果(对α-淀粉酶的抑制率％)
Figure GDA0002904576790000161
步骤4：降糖菌株抗氧化成分的筛选
抗氧化试验中均以Vc为阳性对照。
步骤4.1：降糖菌株抗氧化活性的测定
采用步骤3所选的降糖菌株(ND-6)在步骤2.2所获得的发酵液，进行其体外抗氧化能力的测定，以确认该菌株是否产有体外抗氧化的活性成分。
体外抗氧化测定的方法为：采用DPPH自由基清除能力的测定、羟自由基(·OH)清除能力的测定和总还原力的测定三种方法。
其中，DPPH自由基清除能力的测定方法[5]为：
原理：DPPH自由基是一种稳定的以氮为中心的质子自由基，其乙醇溶液呈紫色，在517nm处有强烈吸收。在有自由基清除剂存在时，自由基清除剂提供一个电子与DPPH的孤对电子配对，而使其褪色，褪色程度与其接受的电子数量成定量关系，在517nm处的吸收度变小，其变化程度与自由基清除程度呈线形关系，即自由基清除剂的清除自由基能力越强，吸光度越小。
将DPPH溶于95％(v/v)乙醇中，配制成0.15mmol/L的DPPH溶液。取1.0mL待测的样品溶液(发酵液)，与1.0mL DPPH溶液混合，摇匀后置于黑暗处室温反应30min，以无水乙醇调零，在517nm波长处测定吸光度为A1；用无水乙醇代替DPPH，摇匀后置于黑暗处室温反应30min，以无水乙醇调零，在517nm波长处测定吸光度为A2；用无水乙醇代替待测液所测值为吸光值A0，同时与抗氧化阳性对照1mg/mL Vc溶液对DPPH·清除能力进行比较[4]。每个样品重复3次。
DPPH自由基的清除率按下式进行计算：
Figure GDA0002904576790000162
羟自由基(·OH)清除能力的测定——水杨酸(2-羟基苯甲酸)法[6]
原理：H2O2和Fe2+混合发生Fenton反应，生成具有很高反应活性的·OH，·OH能被水杨酸有效地捕获，并生成有色物质，但若加入具有清除作用的物质，便会与水杨酸竞争，有色产物的生成量减少。利用吸光度值的变化间接测定所产生的羟自由基。
试管中依次加入1.0mL样品液(发酵液)、9mmol/L的硫酸亚铁1.0mL、9mol/L的H2O2溶液1.0mL，静置10min，再加入9.0mmol/L水杨酸-乙醇溶液1.0mL，混合均匀，静置30min，在510nm处测定吸光度值A1，用蒸馏水代替水杨酸测得吸光值A2，蒸馏水代替待测液为A0，同时与1mg/mL Vc溶液对·OH清除能力进行比较。每个样品重复3次。略有改动。
羟自由基的清除率按下式进行计算：
Figure GDA0002904576790000171
总还原力的测定方法——普鲁士蓝法[7]
原理：用样本将铁氯化钾还原成亚铁氯化钾，亚铁氯化钾再与铁离子作用，生成普鲁士蓝，在700nm波长测定吸光度值，以检测普鲁士蓝的生成量，以此作为样本的还原力，吸光度值越高，表示还原力越强。
在15mL离心管中依次加入pH值为6.6的磷酸盐缓冲液2.5mL、样品溶液(发酵液)2.5mL和质量百分数为1％的铁氰化钾溶液2.5mL，混合均匀后，置于50℃水浴中温育20min，然后迅速冷却，再加入质量百分数为10％的三氯乙酸溶液2.5mL，混匀后，4000r/min离心10min，取上清液5mL于20mL的比色管中，再加入蒸馏水4mL和质量百分数为0.1％的三氯化铁溶液1mL，混匀后，放置10min，在700nm处测定吸光度。
结果：降糖菌株(ND-6)的发酵液对DPPH自由基清除能力为65.8％、对羟自由基(·OH)清除能力为57.2％、总还原力为0.362。由此可见，降糖菌株(ND-6)的发酵液对三种自由基具有较好的清除作用，说明发酵液中含有具有抗氧化的活性成分，值得找出该活性成分。
步骤4.2降糖菌株抗氧化部位的筛选
在步骤4.1完成的基础上，为确认该菌株具有体外抗氧化活性的部位，进行本步骤的筛选。
对步骤3.3获得的降糖菌株(ND-6)的4个相：石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相作为待测液，分别进行体外抗氧化能力的测定，用配制几个相样品的溶剂50％(v/v)乙醇溶液做试剂对照，以排除假阳性。检测各相的抗氧化作用，筛选出其抗氧化的部位。
体外抗氧化测定的方法为：采用DPPH自由基清除能力的测定、羟自由基(·OH)清除能力的测定和总还原力的测定三种方法。
结果如表2所示，50％(v/v)乙醇溶液没有抗氧化作用，与阳性对照Vc相比，水相具有抗氧化作用，几种体外抗氧化的测定都有较好的效果，显示出较好的抗氧化作用。
表2抗氧化测定结果(样品浓度1mg/mL)
Figure GDA0002904576790000181
步骤4.3：降糖菌株抗氧化部位有效成分的筛选
将步骤4.2所得到的抗氧化部位，进行分离纯化，由于筛选出的抗氧化最好的有效部位是水相，再分别采用步骤4.1中3种体外抗氧化方法测定水相中2个样品(步骤3.4所得的)的抗氧化能力，以筛选出抗氧化部位的有效成分。
水相2个样品浓度的设置：用蒸馏水分别配制成浓度为1mg/mL的溶液，Vc配成相同浓度，进行抗氧化能力的测定。
结果如表3所示。样品1没有抗氧化作用，与阳性对照Vc相比，样品2的多糖对2种自由基具有较好的清除作用，总还原力则稍低，说明发酵液中含有的抗氧化的活性成分主要是多糖。
表3抗氧化测定结果(样品浓度1mg/mL)
Figure GDA0002904576790000182
实施例3：上述产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株的鉴定
如图1、图2所示，本发明的产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株，具有以下特性：
(1)个体形态：菌体呈杆状，革兰氏染色为阳性，有芽孢，且芽孢位于菌体中间。
(2)在固体培养基平板上的菌落性状：菌落呈圆形、中间皱起，边缘平整，略带黄色。
(3)在液体发酵培养基中发酵液较混浊，液面有菌膜，底有絮状沉淀。
(4)生长适温30-50℃，pH值5.0-6.0，好氧。
上述固体培养基由葡萄糖10g、蛋白胨5g、酵母浸膏5g、K2HPO4 0.2g、MgSO4·7H2O0.2g、Na2CO3 0.2g、琼脂20g和水1L组成，自然pH值。
上述固体培养基在使用前，先于0.1MPa下121℃灭菌15min。
上述液体发酵培养基由可溶性淀粉10g、蛋白胨5g、酵母浸膏5g、K2HPO4 0.2g、MgSO4·7H2O 0.2g、Na2CO3 0.2g和水1L组成，上述原料混合均匀后即得液体发酵培养基，自然pH值。
上述液体发酵培养基在使用前，先于0.1MPa下121℃灭菌15min。
本申请的发明人将上述筛选得到的产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株暂时命名为ND-6。该菌株的基因组DNA采用酶解法提取，得到的DNA样品储存于-20℃，将该DNA样品作为DNA模板进行16S rRNA基因PCR扩增：
上游引物27f：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'(如SEQ ID NO.2所示)；
下游引物1492r：5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'(如SEQ ID NO.3所示)。
反应体系为：
Figure GDA0002904576790000191
16S rDNA PCR扩增程序为：
Figure GDA0002904576790000201
PCR产物送北京六合华大基因科技有限公司武汉分公司测序；测序结果如SEQ IDNO.1所示。产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物图,如图15所示。自上而下，Marker条带组成分别为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp、3000bp和5000bp。其中，750bp条带浓度为60ng/3μL,显示为加亮带，其余条带浓度均为30ng/3μL。经扩增，得到1条1445bp的条带。
将所测得的16S rDNA序列进行同源序列检索,如图16所示，ND-6与Bacillusamyloliquefaciens、Bacillus subtilis、Bacillus sp.、Bacillus velezensis等的16SrDNA序列同源性超过99％。因此，菌株ND-6在分子系统发育分类学上属于芽孢杆菌。该结果与生理生化鉴定结果相符，因此综合菌落形态、菌体形态特征观察、分子生物学测序结果，最终确定ND-6菌株为芽孢杆菌，命名为Bacillus sp.ND-6，简称ND-6。
实施例4：上述产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株在生产胞外多糖中的应用
糖尿病是目前危害人类健康的一种常见病和多发病，糖尿病的预防和治疗一直是人类攻克的目标之一，世界各国一直都在寻找新的有效的预防和治疗糖尿病的活性成分，α-淀粉酶抑制剂是目前用于治疗糖尿病的一种药物，筛选和寻找有效、安全的α-AI是目前各国科学家关注的热点之一。同时，由于α-AI是一种糖苷水解酶抑制剂，而亚洲人的饮食结构以淀粉为主，该酶的抑制剂更适合我国国情。因此，目前国内外都在寻找更多更好的α-淀粉酶抑制剂。
采用实施例3的产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株生产得到的胞外多糖在体外降糖试验中呈现良好的降糖活性，其降糖效果与现有的降糖药物阿卡波糖(一种α-淀粉酶抑制剂)相比具有较强的降糖活性。当浓度为5mg/mL时，该多糖对α-淀粉酶的抑制率为87.79％(阿卡波糖为86.79％)，表明该多糖对α-淀粉酶的抑制率与阳性对照阿卡波糖对α-淀粉酶的抑制率的相当，显示出良好的体外降糖活性。
因此，实施例3的产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株Bacillus sp.ND-6所产的胞外多糖在体外试验中显示出较强的降糖活性，是一个非常有潜力的降糖活性成分，有望为糖尿病的预防和药物的开发提供新的活性成分和来源。
越来越多的临床和干预实验，以及来自基础研究的证据表明，自由基参与许多疾病的病理过程，自由基攻击生命大分子和各种细胞器造成组织损伤，是引起机体衰老的根本原因，也是诱发一些疾病的重大原因。因此，目前社会需要能够清除过多的自由基以保证人体健康的活性物质——抗氧化药物。抗氧化、抗衰老一直是人类的梦想，随着健康意识的增强近年来抗氧化药物的开发与研究倍受到人们的关注。
采用实施例3的产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株生产得到的胞外多糖在体外抗氧化试验中也呈现良好的抗氧化活性，其胞外多糖与抗氧化剂Vc相比，当浓度为1mg/mL时，对DPPH·的清除率为95.73％(Vc为95.77％)、对羟基自由基(·OH)的清除率为92.15％(Vc为99.36％)、总还原力为0.488(Vc为0.945)，表明该胞外多糖的抗氧化能力基本与Vc相当，显示出良好的体外抗氧化能力。
因此，实施例3的产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株Bacillus sp.ND-6所产的胞外多糖在体外试验中显示出较强的抗氧化活性，有望为抗氧化药物的开发提供新的活性成分和来源。
实施例5：一种利用上述产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株生产胞外多糖的方法
一种利用上述产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株生产胞外多糖的方法，包括如下步骤：
步骤1：将罗汉果内生菌菌株Bacillus sp.ND-6划线接种于新鲜的斜面培养基上，于37℃培养24h，得到活化的斜面菌种。
其中，所述斜面培养基由葡萄糖10g、蛋白胨5g、酵母浸膏5g、K2HPO4 0.2g、MgSO4·7H2O 0.2g、Na2CO3 0.2g、琼脂20g和水1L组成，自然pH值。
上述斜面培养基在使用前，先于0.1MPa下121℃灭菌15min。
步骤2：将步骤1得到的活化的斜面菌种，用接种环挑取5环，接种于装有70mL种子培养基的250mL锥形瓶中，于37℃、160r/min摇床培养24h，即得种子液；
然后按照5％(v/v)-8％(v/v)的接种量将种子液接种于装有600mL液体发酵培养基的1000mL锥形瓶中，37℃、160r/min摇床培养72h，得到发酵液。
其中，所述种子培养基和液体发酵培养基均由可溶性淀粉10g、蛋白胨5g、酵母浸膏5g、K2HPO4 0.2g、MgSO4·7H2O 0.2g、Na2CO3 0.2g和水1L组成，上述原料混合均匀后即得种子培养基或液体发酵培养基，pH值自然。
上述种子培养基或液体发酵培养基在使用前，先于0.1MPa下121℃灭菌15min。
步骤3：将步骤2得到的发酵液真空抽滤，得到的抽滤液进行减压浓缩至发酵液体积的1/8-1/10，纯化,再透析，对透析液进行真空冷冻干燥，即得到胞外多糖。
其中，所述纯化的方法为：在减压浓缩后的溶液中，加入95％(v/v)的乙醇溶液，至乙醇含量达到60％(v/v)以上，于4℃冷藏12h，4000r/min离心15min，得第一次沉淀和第一次上清液；在第一次上清液再加95％(v/v)的乙醇溶液，至乙醇含量达到70％(v/v)，于4℃冷藏12h，4000r/min离心15min，得第二次沉淀和第二次上清液；合并第一次沉淀和第二次沉淀，再按质量体积比(g/mL)1:25的比例，加蒸馏水溶解后过滤，滤液加95％(v/v)的乙醇，至乙醇含量达到80％(v/v)，于4℃冷藏12h，4000r/min离心15min，得沉淀物粗多糖；将沉淀物粗多糖用蒸馏水溶解为质量百分数为5％-10％的溶液后，加三氯乙酸溶液，震荡混合均匀，使溶液中三氯乙酸的含量达到15％(v/v)，5-10℃静置12h，4000r/min离心15min，得蛋白质沉淀和上清液；上清液再加入95％(v/v)的乙醇，至乙醇含量达到80％(v/v)，于4℃冷藏12h，4000r/min离心15min，得到胞外多糖沉淀物。
所述透析的方法为：在胞外多糖沉淀物里，按质量体积比(g/mL)1:20的比例，加蒸馏水溶解，得到胞外多糖沉淀物的水溶液；将胞外多糖沉淀物的水溶液装入透析袋，放入蒸馏水中，胞外多糖沉淀物的水溶液与蒸馏水的体积比为1:20，透析48h，12h换一次水，换3次蒸馏水，得到透析液。
实施例6：一种上述生产胞外多糖的方法生产的胞外多糖
本实施例的胞外多糖，由实施例5生产胞外多糖的方法所生产，具有良好的体外降糖作用和抗氧化作用。
实施例7：上述胞外多糖在制备降血糖药物中的应用
由实施例4可知，本发明的胞外多糖在体外降糖试验中呈现良好的降糖活性，其降糖效果与现有的降糖药物阿卡波糖(一种α-淀粉酶抑制剂)相比具有较强的降糖活性。当浓度为5mg/mL时，该多糖对α-淀粉酶的抑制率为87.79％(阿卡波糖为86.79％)，表明该多糖对α-淀粉酶的抑制率与阳性对照阿卡波糖对α-淀粉酶的抑制率的相当，显示出良好的体外降糖活性。
因此，本发明的胞外多糖在体外试验中显示出较强的降糖活性，是一个非常有潜力的降糖活性成分，有望为糖尿病的预防和药物的开发提供新的活性成分和来源，有望应用于制备降血糖药物。
实施例8：上述胞外多糖在制备抗氧化药物中的应用
由实施例4可知，采用本发明的胞外多糖在体外抗氧化试验中也呈现良好的抗氧化活性，其胞外多糖与抗氧化剂Vc相比，当浓度为1mg/mL时，对DPPH·的清除率为95.73％(Vc为95.77％)、对羟基自由基(·OH)的清除率为92.15％(Vc为99.36％)、总还原力为0.488(Vc为0.945)，表明该胞外多糖的抗氧化能力基本与Vc相当，显示出良好的体外抗氧化能力。
因此，本发明的胞外多糖在体外试验中显示出较强的抗氧化活性，有望为抗氧化药物的开发提供新的活性成分和来源，有望应用于制备抗氧化药物。
本发明在培养基制备时，所述自然pH值，是在本发明所述的培养基组成条件下，不需要另外调节pH值。
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以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 广西师范大学
<120> 一株产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株及其生产胞外多糖的方法和胞外多糖的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1445
<212> DNA
<213> 产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株ND-6(Bacillus sp. )
<400> 1
gggcgcgtgc tatacatgca gtcgagcgga cagatgggag cttgctccct gatgttagcg 60
gcggacgggt gagtaacacg tgggtaacct gcctgtaaga ctgggataac tccgggaaac 120
cggggctaat accggatgct tgtttgaacc gcatggttca aacataaaag gtggcttcgg 180
ctaccactta cagatggacc cgcggcgcat tagctagttg gtgaggtaac ggctcaccaa 240
ggcgacgatg cgtagccgac ctgagagggt gatcggccac actgggactg agacacggcc 300
cagactccta cgggaggcag cagtagggaa tcttccgcaa tggacgaaag tctgacggag 360
caacgccgcg tgagtgatga aggttttcgg atcgtaaagc tctgttgtta gggaagaaca 420
agtgccgttc aaatagggcg gcaccttgac ggtacctaac cagaaagcca cggctaacta 480
cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgttg tccggaatta ttgggcgtaa 540
agggctcgca ggcggtttct taagtctgat gtgaaagccc ccggctcaac cggggagggt 600
cattggaaac tggggaactt gagtgcagaa gaggagagtg gaattccacg tgtagcggtg 660
aaatgcgtag agatgtggag gaacaccagt ggcgaaggcg actctctggt ctgtaactga 720
cgctgaggag cgaaagcgtg gggagcgaac aggattagat accctggtag tccacgccgt 780
aaacgatgag tgctaagtgt tagggggttt ccgcccctta gtgctgcagc taacgcatta 840
agcactccgc ctggggagta cggtcgcaag actgaaactc aaaggaattg acgggggccc 900
gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt accaggtctt 960
gacatcctct gacaatccta gagataggac gtccccttcg ggggcagagt gacaggtggt 1020
gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac 1080
ccttgatctt agttgccagc attcagttgg gcactctaag gtgactgccg gtgacaaacc 1140
ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg 1200
ctacaatggg cagaacaaag ggcagcgaaa ccgcgaggtt aagccaatcc cacaaatctg 1260
ttctcagttc ggatcgcagt ctgcaactcg actgcgtgaa gctggaatcg ctagtaatcg 1320
cggatcagca tgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca 1380
cgagagtttg taacacccga agtcggtgag gtaacctttt ggagccagcc gccgaaggtg 1440
acaga 1445
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tacggctacc ttgttacgac tt 22

Claims (6)

1.一种产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株在生产胞外多糖中的应用，所述产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株的名称为芽孢杆菌（Bacillus sp.）ND-6，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15227，保藏日期为2018年1月16日。
2.一种产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株生产胞外多糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：将权利要求1所述的产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株Bacillus sp. ND-6划线接种于新鲜的斜面培养基上，于37℃培养24h，得到活化的斜面菌种；
步骤2：将步骤1得到的活化的斜面菌种，用接种环挑取5环接种于装有70mL种子培养基的250mL锥形瓶中，于37℃、160r/min摇床培养24h，即得种子液；
然后按照5%v/v-8%v/v的接种量，将种子液接种于装有600mL液体发酵培养基的1000mL锥形瓶中，35℃、160r/min摇床培养72h，得到发酵液；
步骤3：将步骤2得到的发酵液真空抽滤，得到的抽滤液进行减压浓缩，纯化,再透析，对透析液进行真空冷冻干燥，即得到胞外多糖。
3.根据权利要求2所述的生产胞外多糖的方法，其特征在于，步骤1中，所述斜面培养基由葡萄糖10g、蛋白胨5g、酵母浸膏5g、K2HPO4 0.2g、MgSO4·7H2O 0.2g、Na2CO3 0.2g、琼脂20g和水1L组成，自然pH值。
4.根据权利要求2所述的生产胞外多糖的方法，其特征在于，步骤1中，步骤2中，所述种子培养基和液体发酵培养基均由可溶性淀粉10g、蛋白胨5g、酵母浸膏5g、K2HPO4 0.2g、MgSO4·7H2O 0.2g、Na2CO3 0.2g和水1L组成，上述原料混合均匀后，即得种子培养基或液体发酵培养基，pH值自然。
5.根据权利要求2所述的生产胞外多糖的方法，其特征在于，步骤3中，所述纯化的方法为：在减压浓缩后的溶液中，加入95%v/v的乙醇溶液，至乙醇含量达到60%v/v以上，于4℃冷藏12h，4000r/min离心15min，得第一次沉淀和第一次上清液；在第一次上清液再加95%v/v的乙醇溶液，至乙醇含量达到70%v/v，于4℃冷藏12h，4000r/min离心15min，得第二次沉淀和第二次上清液；合并第一次沉淀和第二次沉淀，再按质量体积比1g:25mL的比例，加蒸馏水溶解后过滤，滤液加95%v/v的乙醇，至乙醇含量达到80%v/v，于4℃冷藏12h，4000r/min离心15min，得沉淀物粗多糖；将沉淀物粗多糖用蒸馏水溶解为质量百分数为5%-10%的溶液后，加三氯乙酸溶液，震荡混合均匀，使溶液中三氯乙酸的含量达到15%v/v，5-10℃静置12h，4000r/min离心15min，得蛋白质沉淀和上清液；上清液再加入95%v/v的乙醇，至乙醇含量达到80%v/v，于4℃冷藏12h，4000r/min离心15min，得到胞外多糖沉淀物。
6.根据权利要求2所述的生产胞外多糖的方法，其特征在于，步骤3中，步骤3中，所述透析的方法为：在胞外多糖沉淀物里，按质量体积比1g:20mL的比例，加蒸馏水溶解，得到胞外多糖沉淀物的水溶液；将胞外多糖沉淀物的水溶液装入透析袋，放入蒸馏水中，胞外多糖沉淀物的水溶液与蒸馏水的体积比为1:20，透析48h，12h换一次水，换3次蒸馏水，得到透析液。
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