CN104694594A

CN104694594A - 海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖的制备方法及其应用

Info

Publication number: CN104694594A
Application number: CN201310644111.1A
Authority: CN
Inventors: 张付云; 刘晔; 王维才; 赵宇; 李振
Original assignee: Dalian Ocean University
Current assignee: Dalian Ocean University
Priority date: 2013-12-05
Filing date: 2013-12-05
Publication date: 2015-06-10

Abstract

本发明公开一种海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖的制备方法，其操作简单，成本低廉，能够稳定的获得海参共附生枯草芽孢杆菌的胞外多糖；同时利用该方法制备的海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖，具有较强的抗氧化活性，能够抑制蚕豆根尖细胞微核的形成，可以广泛应用于医药抗肿瘤、生物防治、食品保鲜、仿佛和化妆品添加剂等领域，具有广泛的市场前景和产业价值。

Description

海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖的制备方法，以及该种多糖在细菌和植物病原菌的生长抑制、过氧化物的清除、抗肿瘤和抑制微核形成方面的应用。

背景技术

海参属棘皮动物门（Echinodermata）、海参纲动物（Holothuroidea）。全世界约有1200种海参，主要生活在热带和温带的海洋中，常见的可食海参有刺参、梅花参、白瓜参，这些海参除了食用价值之外，还含有丰富的生物活性物质，如海参毒素、海参多糖、海参皂苷、脂肪酸、多肽、海参神经节苷酯等，这些成分具有多种生物活性。另海参体内及肠道内生活着大量的细菌，这些细菌代谢产物具有独特的结构与功能，但这些代谢产物迄今未止还没有被充分利用。

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述不足，提出一种操作简单、成本低廉的海参共附生枯草芽孢杆菌HS22（Bacillus subtilis HS22）的胞外多糖的制备方法，以及该多糖细菌和植物病原菌的生长抑制、过氧化物的清除、抗肿瘤和抑制微核形成方面的应用。

本发明的技术解决方案是：一种海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖的制备方法，其特征在于：所述的方法按照以下步骤进行：

a、将淀粉、硝酸钾、NaCl、K2HPO4、MgSO4、FeSO4混合到水中形成培养基溶液，且各组分的质量百分比为淀粉：1.5%，硝酸钾：2%，NaCl：0.05%，K2HPO4：0.05%，MgSO4：0.05%，FeSO4：0.001%，并将培养基溶液的pH值调节至5，

b、取海参共附生枯草芽孢杆菌HS22，将其按照1:800-1000的比例与培养基溶液混合，在温度为35-40℃，转速为150-200rpm的条件下摇床振荡培养3-5d，获得发酵液；

c、将发酵液在6000rpm的条件下离心并去除沉淀，向上清液中加入2倍体积的95%乙醇，4℃沉淀14-16h，然后在9000rpm的条件下离心30min，将得到的沉淀用蒸馏水溶液后，利用savage法去除蛋白后，再加入2倍体积的95%乙醇并在4℃沉淀14-16h，然后再次在9000rpm的条件下离心30min，取沉淀，沉淀即为海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖。

所述的海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖抑制细菌和植物病原菌生长方面的应用。

所述的海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖在过氧化物的清除方面的应用。

所述的海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖在抗肿瘤方面的应用。

所述的海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖在抑制微核形成方面的应用。

本发明同现有技术相比，具有如下优点：

本发明所公开的海洋芽孢杆菌胞外多糖的制备方法，其操作简单，成本低廉，能够稳定的获得海参共附生枯草芽孢杆菌的胞外多糖；同时利用该方法制备的海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖，具有较强的抗氧化活性，能够抑制蚕豆根尖细胞微核的形成，可以广泛应用于医药抗肿瘤、生物防治、食品保鲜、仿佛和化妆品添加剂等领域，具有广泛的市场前景和产业价值。

附图说明

图1是海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖对微核形成的抑制率。

具体实施方式

下面将说明本发明的具体实施方式。

一种海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖的制备方法，其特征在于所述的方法按照以下步骤进行：

首先配置培养基溶液。将淀粉、硝酸钾、NaCl、K2HPO4、MgSO4、FeSO4混合到水中形成培养基溶液，且在培养基溶液中各组分的质量百分比为淀粉：1.5%，硝酸钾：2%，NaCl：0.05%，K2HPO4：0.05%，MgSO4：0.05%，FeSO4：0.001%，并将培养基溶液的pH值调节至5；

然后取海参共附生枯草芽孢杆菌HS22（Bacillus subtilis HS22），该菌株已于2013年1月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号: CGMCC No: 7080；将其放置在培养基溶液中，HS22与培养基溶液的比例为1:1000；在温度为35-40℃，转速为150-200rpm的条件下摇床振荡培养3-5d，获得发酵液；

将发酵液在6000 rpm的条件下离心并去除沉淀，向上清液中加入2倍体积的95%乙醇，4℃沉淀16h，然后在9000 rpm的条件下离心30 min，将得到的沉淀用蒸馏水溶液后，利用savage法去除蛋白后，再加入2倍体积的95%乙醇并4℃沉淀16h，然后再次在9000 rpm的条件下离心30 min，取沉淀，所获得的沉淀即为海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖。

海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖抑菌活性的测定。

抑真菌活性的检测：苹果粉红单端孢霉，番茄灰霉和毛霉均受赠于中科院大连化学物理研究所。将各菌种分别接种于沙氏固体培养基中，静置培养5-7 d作指示菌。

取海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖的溶液400 μL，与10 mL沙氏固体培养基在60 mm培养皿中混匀，使多糖终浓度分别为100 μg/mL、200 μg/mL和300 μg/mL，待培养基凝固后，用打孔器在事先培养好的好的长满指示菌的平板上打孔，用镊子小心取出带有指示菌的琼脂块，倒置于凝固好的固体培养基中央，空白对照加入400 μL的无菌水，每种植物病原菌做3个重复。28℃培养至空白对照培养基上的指示菌布满整个培养皿，观察并记录菌落直径计算抑制率，方法是按照十字交叉测量2次，以其平均值代表菌落直径的大小。根据抑制率的计算公式：纯生长量=菌落平均直径—菌饼直径，抑制率=（对照纯生长量—处理纯生长量）/对照纯生长量进行计算。结果该海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖对三种指示真菌的抑制率如下表所示：

由此可见，该海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖具有很强的抑制植物病原菌活性，可作为粉剂或液体制剂用于生物农药的制备。

滤纸片法检测海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖的抑菌活性：大肠杆菌Escherichia coli (EC)、变形杆菌Proteus vulgaris(PV)、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus (SA)、产气杆菌Enterobacter aerogenes (EA)和枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis (BS)用牛肉膏蛋白胨培养基振荡培养24 h作指示菌。分别用移液枪取指示菌液100 μL于牛肉膏蛋白胨固体培养基，用无菌三角涂棒涂抹均匀，然后将平板分成三个区，每个区分别放入一张滤纸片，再分别用移液枪移取500μg/mL的海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖10 μL滴入滤纸片中央，置于37 ℃培养箱中培养。每个处理做3次重复，阳性对照为75%酒精，阴性对照为无菌水。三天后观察指示菌的生长情况,测定抑菌圈的直径大小。结果该海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖对大肠杆菌、产气杆菌和变形杆菌三种指示菌有抑制活性。

因此用这种海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖开发食品添加剂可因其抑菌活性而延长产品的保藏时间，还可直接开发成食品保鲜防腐剂。

海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖对超氧阴离子自由基（O^2-）清除作用的测定。

取邻苯三酚0.1 mL于试管中，加入pH 8.2的Tris-HCl缓冲溶液5 mL，加入浓度为1mg/mL的海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖溶液0.25 mL，迅速混匀。在25℃反应15 min。使用1 cm比色皿，以蒸馏水做空白对照，在320 nm处时测吸光度A i，并测定本底扣除水解液自身的干扰。海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖溶液对超氧阴离子自由基清除率的计算公式如下：清除率S(%)=Ao－(Ai－Aj)/Ao×100％。式中，Ao为试剂空白的吸光度值；Ai为样液的吸光度值；Aj为样液本底的吸光度值。虽然超氧阴离子自由基(0^2-)不能直接诱导生物和食品体系中的脂类氧化，但它会在金属离子催化下发生Fenton反应产生有高活性的·OH，因此常用样品对超氧阴离子自由基(O^2-)的清除能力来反映其抗氧化活性。结果该海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖（1mg/mL）的超氧阴离子自由基清除率为34.66%。

海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖对羟自由基（·OH）清除作用的测定。

取9 mmol/L的FeSO₄ 1mL、9 mmol/L的水杨酸-乙醇溶液1 mL、1 mg/mL的海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖溶液1 mL，最后加入8.8 mmol/L 的H₂O₂1 mL启动反应。在37℃反应30分钟。以水为参比，用可见光分光光度计在510 nm下测各反应液的吸光度值。多糖对羟自由基的清除效果用清除率表示，按下式计算：

SA=[(Ac—As)／(Ac—Ao)]×100％

式中，Ac为对照组0D值；As为样品组OD值；A0为空白组OD值。

羟基自由基(·OH)是一种能够激发油脂过氧化反应的较强的氧化剂，被认为是体内最活跃的活性氧自由基，辐射损伤等物理、化学因子都会促进其形成，是造成生物有机体过氧化损伤的主要因素。羟自由基可介导许多病理变化，如引发不饱和脂肪酸的脂质过氧化反应，并损伤生物膜的功能和结构，因此羟自由基的清除对于生物体具有重要意义。H₂O₂和Fe₂+混合发生Fenton反应，生成具有很高反应活性的·OH，能被水杨酸有效的捕捉，并生成有色物质；但若加入具有清除作用的物质，便会与水杨酸竞争，从而使有色产物生成量减少。

结果该海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖（1 mg/mL）对羟自由基（·OH）的清除率为22.45%。

由此可见，该海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖具有很强的抗氧化活性，可用作抗氧化药物的制备或食品抗氧化添加剂。

海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖的抗肿瘤活性检测。

肿瘤细胞培养：将神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y P7）接种于含有10％小牛血清的RPMI-1640培养液中，在培养基中加入100国际单位青霉素和链霉素，pH 7.1，置于37 ℃、5％ CO2培养箱中培养。细胞呈单层生长达到70％-80％密度饱和时，进行传代。

MTT法检测海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖对肿瘤细胞的影响：实验分为空白对照组（未经试样处理的细胞悬液）和实验组（加入不同浓度的多糖溶液），多糖浓度梯度为：10 μg/mL、30 μg/mL、90 μg/mL、180 μg/mL、360 μg/mL，每个浓度做5个复孔。取对数生长期的肿瘤细胞，调细胞浓度1～3×104 个/ mL，将细胞悬液加入96孔培养板中，每孔100 μL，于饱和湿度37 ℃、5％ CO2培养箱中培养24 h，细胞完全贴壁后，实验组加入多糖溶液150μL，饱和湿度37 ℃、5％ CO2培养箱中培养24 h，每孔均加入MTT 20 μL，继续于饱和湿度37 ℃、5％ CO2培养箱中培养4 h，终止培养，吸弃上清，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150 μL, 振荡摇匀，使结晶物充分溶解，用酶标仪于570 nm波长处测定各孔的OD值。抑制率(%)=（A对照组—A实验组）/A对照组×100。结果该海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖在360 μL/mL时对神经母细胞瘤的抑制率为21.44%，

由此可见，该海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖具有一定的抗肿瘤活性，具有医药保健品应用的潜力。

海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖的抑制微核形成活性检测。

首先将蚕豆浸泡于清水中24h，使种皮松软，然后放入垫有吸水脱脂棉的培养皿中，并盖上双层湿纱布，于25℃恒温培养箱中培养，待根尖长至1～1.5cm时即可使用。将萌发蚕豆分成6组，每组8个，每组设3个平行样，分别在含2μg/mL丝裂霉素的50、100、150、200和250μg/mL的海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖溶液中浸根培养10 h，对照组仅用2μg/mL 的丝裂霉素浸根培养10 h，然后用自来水冲洗，并于25℃清水中恢复培养24 h。取蚕豆根尖于卡诺固定液中固定24h，然后分别用95%、85%、75%乙醇处理10 min，最后于70% 乙醇中保存，待制片用。通过制片观察，计算微核抑制率。计算公式：抑制率( %) =阳性对照组微核细胞数—试验组微核细胞数/阳性对照组微核细胞数×100%。由于染色体有丝分裂受到干扰时，导致着丝粒散失甚至发生染色体断裂，产生各种染色体片段，这些染色体片段分布在主核周围形成微核。微核形成频率可反映细胞遗传物质损伤的程度，而遗传物质损伤又是机体癌变的原因之一。结果该海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖对微核形成的抑制率如图1所示，其中最高为53.91%。

由此可见，该海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖能够抑制不良因素对遗传物质的改变，从而减少癌变的几率，因此可应用于医药及保健品的开发。

Claims

1.一种海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖的制备方法，其特征在于：所述的方法按照以下步骤进行：

a. 将淀粉、硝酸钾、NaCl、K2HPO4、MgSO4、FeSO4混合到水中形成培养基溶液，且各组分的质量百分比为淀粉：1.5%，硝酸钾：2%，NaCl：0.05%，K2HPO4：0.05%，MgSO4：0.05%，FeSO4：0.001%，并将培养基溶液的pH值调节至5，

b. 取海参共附生枯草芽孢杆菌HS22，将其按照1:800-1000的比例与培养基溶液混合，在温度为35-40℃，转速为150-200rpm的条件下摇床振荡培养3-5d，获得发酵液；

c. 将发酵液在6000rpm的条件下离心并去除沉淀，向上清液中加入2倍体积的95%乙醇，4℃沉淀14-16h，然后在9000rpm的条件下离心30min，将得到的沉淀用蒸馏水溶液后，利用savage法去除蛋白后，再加入2倍体积的95%乙醇并在4℃沉淀14-16h，然后再次在9000rpm的条件下离心30min，取沉淀，沉淀即为海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖。

2.一种如权利要求1所述的方法制备的海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖，其特征在于：所述的海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖抑制细菌和植物病原菌生长方面的应用。

3.一种如权利要求1所述的方法制备的海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖，其特征在于：所述的海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖在过氧化物的清除方面的应用。

4.一种如权利要求1所述的方法制备的海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖，其特征在于：所述的海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖在抗肿瘤方面的应用。

5.一种如权利要求1所述的方法制备的海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖，其特征在于：所述的海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖在抑制微核形成方面的应用。