CN1908182A - 一种芽孢杆菌胞外多糖的制备与其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术制药领域，涉及枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)产生胞外多糖的制备及其在抗肿瘤方面的应用。用50mg/kg和100mg/kg剂量多糖给昆明种荷瘤小鼠灌胃可以显著抑制肿瘤的生长，抑瘤率分别为45.0％和65.6％，同时还能促进巨噬细胞、白细胞和淋巴细胞的增殖，表明本发明多糖可作为制备治疗肿瘤药物、免疫调节保健品或免疫调节药物。
Description
一、技术领域
本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一株从海洋潮间带中分离的芽孢杆菌胞外多糖的制备方法及其用途。
二、背景技术
恶性肿瘤是一类威胁人类健康的多发病和常见病，据世界卫生组织2003年公布的数据，2000年全球共有恶性肿瘤患者1000万，因恶性肿瘤死亡者高达620万，其中中国的患者约180万-200万，占世界总数的1/5，死亡人数140万-150万，占世界总数的1/4，肿瘤性疾病的防治已成为21世纪人类健康面临的最大挑战之一。
目前用于肿瘤治疗的药物多为细胞毒性药物，虽然活性较高，可直接杀伤肿瘤细胞，但毒副作用严重，往往在损伤肿瘤细胞的同时也会损伤正常细胞。为此，越来越多的科学家将开发抗肿瘤药物的重点转移到免疫调节药物上，旨在通过激发和提高机体的免疫力来产生间接的抑瘤、杀瘤作用，如卡介苗、干扰素、IL-2和多糖等。
目前抗肿瘤多糖的研究主要集中在真菌多糖和中草药多糖，其中比较成功的案例是香菇多糖，因其具有活性高、安全性好、成本低等优势，香菇多糖已应用于肿瘤的临床治疗。然而，目前上市的香菇多糖是直接从香菇子实体中提取的，具有质控较难，导致疗效不稳定的缺点。如能找到具有较强免疫增强作用的细菌胞外多糖，则可以通过规范发酵条件和提取方法，得到组成及功能稳定的多糖产品。根据文献调研，目前鲜有抗肿瘤细菌胞外多糖的报道。本专利描述一种分离自江苏黄海沿岸潮间带土壤细菌胞外多糖的制备及其在制备治疗肿瘤药物、免疫调节保健品或免疫调节药物中的应用。
三、发明内容
本发明的目的在于开发免疫增强多糖类抗肿瘤药物、免疫调节保健品或免疫调节药物，提供一种细菌胞外多糖的制备技术及其应用方法。
本发明的技术方案是：
1、菌株的筛选、分离和鉴定：采用常规细菌分离技术，从江苏黄海沿岸潮间带土壤中分离获得一株产免疫调节胞外多糖的杆菌，根据菌落生长特点、形态、生理生化反应以及16S rDNA序列分析，鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
2、大量发酵及胞外多糖的提取、鉴定：采用牛肉膏蛋白胨培养基，于37℃、100rpm摇床发酵48h，发酵液离心除菌后减压浓缩至适当体积，然后加3倍体积95％的乙醇沉淀，沉淀物用不同极性的有机溶剂反复洗涤后加水溶解，并用Sevag法反复除去蛋白，然后冷冻干燥即得该菌的胞外多糖，最后经紫外与红外光谱检测鉴定。
3、体外免疫增强活性的测定：用中性红法检验多糖对巨噬细胞吞噬活性的增强作用。
4、体内抑瘤和免疫调节活性的测定：用不同浓度的胞外多糖给荷瘤(前肢皮下接种艾氏腹水瘤)昆明种小鼠灌胃，每日记录采食和饮水，第15天尾部采血计数白细胞总数，然后处死小鼠，检测腹腔巨噬细胞的数目和吞噬活性、脾淋巴细胞的增殖指数、脏器指数和肿瘤重等指标。
5、细胞毒性实验：采用MTT法测定不同浓度的胞外多糖对肿瘤细胞株Jurkat和K562的毒性。
6、急性毒性实验：一次性给小鼠灌胃相当于正常使用量80或160倍的胞外多糖，观察其对小鼠的急性毒性作用
本发明胞外多糖的生产者为枯草芽孢杆菌，该菌具有如下优点：(1)基因组序列清楚，易于通过基因操作，提高胞外多糖产量；(2)培养基成分简单，发酵条件易控制，可进行规模化生产；(3)胞外多糖产率较高，质控容易等。
本发明胞外多糖抑制肿瘤生长效果显著，其抑瘤机制是通过增强机体免疫功能而实现的，而非细胞毒所致，从而避免了使用化疗药物治疗肿瘤时所带来的对机体正常细胞损伤的副作用，可用于肿瘤药物、免疫调节保健品或免疫调节药物的开发。
四、附图说明：
图1、胞外多糖的紫外扫描图谱，在260nm和280nm处无可见吸收峰，表明无核酸和蛋白质成分。
图2、胞外多糖的红外扫描图谱，在3600-3200cm-1、3000-2800cm-1和1400-1000cm-1处有多糖特征吸收峰，表明胞外多糖的化学性质为多糖。
五、具体实施方式
下面用实施例来进一步详述本发明，但本发明的内容并不局限于此。
实施例一：枯草芽孢杆菌的发酵条件及发酵液制备方法
培养基组成：蛋白胨10g，牛肉膏5g，氯化钠10g，加水至1升，pH7.0。
种子液的制备：取-80℃冰箱保存的菌种少许于4ml液体培养基中，37℃，100rpm摇床培养过夜。
发酵液的制备：4ml种子液接种于含400ml培养基的1L三角瓶装中，37℃，100rpm摇床培养48h。
实施例二：胞外多糖的制备
枯草芽孢杆菌发酵液经4000rpm离心30min除菌后减压浓缩至适当体积，然后加3倍体积95％的乙醇沉淀，沉淀分别用丙酮和乙酸乙酯洗涤2次后溶于水中，用Sevag法反复除去蛋白质，最后用3倍体积95％的乙醇沉淀，60℃烘干得干物质为2.1克/升。红外光谱在3600-3200cm-1、3000-2800cm-1和1400-1000cm-1处有多糖特征吸收峰存在，表明该物质的化学性质为多糖；硫酸蒽酮法和硫酸苯酚法测定呈阳性，进一步验证该物质为多糖化合物；在260nm和280nm处无紫外吸收峰，表明该物质中没有核酸和蛋白质。
实施例三：胞外多糖体外对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活性的影响
提前一天给小鼠腹腔注入6％淀粉肉汤1ml诱导巨噬细胞的产生，实验当天采用常规方法收集腹腔巨噬细胞，用生理盐水调整至3×106个/ml；然后每孔200μl加入96孔板微量反应板中，37℃粘附2h；然后用生理盐水洗去未粘附细胞，每孔加0.1％中性红生理盐水液200μl，以及不同稀释度的多糖溶液20μl，使多糖终浓度为0、25、50、100μg/ml，37℃吞噬45min；之后，弃中性红并用生理盐水洗去胞外粘附的中性红，加盐酸异丙醇裂解细胞并溶解中性红，测定570nm的吸光值，用以反映巨噬细胞的吞噬活性。结果显示，该多糖在体外能显著提高巨噬细胞的吞噬活性，而且具有一定的量效关系(表1)。
表1.胞外多糖体外对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活性的影响
| 剂量(μg/ml) | 吞噬活性(OD570) | 增强率(％) |
| 02550100 | 0.297±0.014Aa0.342±0.006Ab0.416±0.007Bc0.479±0.005Cd | 15.040.061.3 |
注：A，B，C和a，b，c，d分别表示ANOVA统计分析在0.01和0.05水平上的显著性差异。
实施例四：胞外多糖体内对肿瘤生长和细胞免疫活性的影响
选用昆明种小鼠30只，雌雄各半，体重±22g，随机分成3组。每组前肢右腋皮下接种0.2ml浓度为5×106个/ml的艾氏腹水瘤细胞，按三个不同剂量：0，50和100mg/kg胞外多糖连续灌胃14天，每日记录采食、饮水和体重，试验结束即第15天尾部采血计数白细胞总数，然后处死小鼠，并进行如下几项检测：(1)剥离皮下肿瘤并称重，测定对艾氏腹水瘤生长的影响；(2)计数小鼠腹腔巨噬细胞数量，并采用中性红法检测小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬活性；(3)用MTT法测定小鼠脾脏淋巴细胞的增殖能力；(4)分离并称重胸腺、脾、肝和肾，计算脏器指数。试验结果如下：
1、对小鼠肿瘤生长的影响
与未使用胞外多糖组相比，50mg/kg和100mg/kg两个剂量组对肿瘤生长均有显著的抑制作用，抑制率分别为45.0％和65.6％，但两剂量组之间无显著差异(表2)。
表2.胞外多糖对小鼠肿瘤生长的影响
| 剂量(mg/kg) | 肿瘤重量(g) | 抑瘤率(％) |
| 050100 | 1.131±0.334a0.622±0.289b0.389±0.212b | 045.065.6 |
注：a，b表示ANOVA统计分析在0.05水平上的显著性差异。
2、对腹腔巨噬细胞数量与吞噬活性的影响
胞外多糖灌胃能够显著提高小鼠腹腔巨噬细胞的数量，但对巨噬细胞的吞噬活性没有显著影响(表3)，其中50mg/kg和100mg/kg两个剂量组处理之间无显著性差异。
表3.胞外多糖对小鼠腹腔巨噬细胞数量与活性的影响
| 剂量(mg/kg) | 数目(×106/ml) | 活性(OD570) |
| 050100 | 3.156±0.751Aa5.157±2.396Bb6.500±0.707Bb | 0.180±0.030a0.198±0.053a0.136±0.032a |
注：A，B和a，b分别表示ANOVA统计分析在0.01和0.05水平上的显著性差异。
3、对淋巴细胞增殖的影响
胞外多糖50mg/kg和100mg/kg剂量组灌胃14天对小鼠淋巴细胞的增殖有显著的促进作用，分别为27.3％和28.8％，但两个剂量组之间无显著性差异(表4)。
表4.胞外多糖对淋巴细胞增殖转化的影响
| 剂量(mg/kg) | OD570 | 增强率(％) |
| 050100 | 0.402±0.076a0.511±0.092b0.518±0.110b | 27.328.8 |
注：a，b表示ANOVA统计分析在0.05水平上的显著性差异。
4、对小鼠血液白细胞数量的影响
胞外多糖灌胃14天显著提高小鼠白细胞的数量，50mg/kg和100mg/kg剂量组的白细胞数分别提高了25.6％和38.9％，其中100mg/kg剂量组与未使用多糖组之间达显著差异(表5)。
表5.胞外多糖对小鼠白细胞数量的影响
| 剂量(mg/kg) | 数目(×106/ml) | 增加(％) |
| 050100 | 6.21±1.28a7.80±1.39ab8.62±1.06b | 25.638.9 |
注：a，b表示ANOVA统计分析在0.05水平上的显著性差异。
5、对小鼠脏器指数的影响
胞外多糖不同剂量灌胃14天后解剖各脏器并称重，结果显示胞外多糖对小鼠各脏器没有显著影响(表6)，即副作用不明显。
表6.胞外多糖对小鼠脏器的影响
| 剂量(mg/kg) | 体重(g) | 脾重(mg) | 肝重(g) | 肾重(mg) | 胸腺(mg) |
| 050100 | 24.4±3.8a20.9±3.7a20.1±2.0a | 152.9±47.0a181.7±81.2a122.5±16.3a | 1.418±0.277a1.302±0.321a0.999±0.018a | 309.3±44.4a278.9±42.9a274.0±21.2a | 57.1±15.1a35.4±17.4a50.5±27.6a |
注：a表示ANOVA统计分析在0.05水平上的显著性差异。
实施例五：对肿瘤细胞株Jurkat和K562的细胞毒性
采用MTT法测定了胞外多糖对肿瘤细胞株Jurkat和K562的毒性，结果表明50μg/ml或100μg/ml的胞外多糖处理对肿瘤细胞株Jurkat和K562无杀伤作用，与未加多糖处理无显著差异(表7)，同时也说明胞外多糖的抑瘤作用与细胞毒活性无关。
表7：胞外多糖对肿瘤细胞株的毒性测定(OD570)
| 剂量(μg/ml) | Jurkat | K562 |
| 050100 | 0.475±0.026a0.481±0.017a0.466±0.031a | 0.436±0.011a0.433±0.028a0.427±0.015a |
注：a表示ANOVA统计分析在0.05水平上的显著性差异。
实施例六：胞外多糖的急性毒性实验
选用昆明种小鼠10只，雌雄各半，体重约22g，实验前12-16小时只给水不给食，每只小鼠一次性灌胃0.2ml胞外多糖，相当于8000mg/kg，随即开始观察小鼠发生的毒性反应情况，持续观察一个月。结果未发现小鼠有任何中毒症状，表明本发明胞外多糖对小鼠无毒。
综上研究结果，本发明枯草芽孢杆菌产生的胞外多糖具有显著抑制肿瘤生长的效果，其抑瘤机制是通过提高机体巨噬细胞数量、白细胞数量和淋巴细胞转化活性等而实现的，而非细胞毒活性。此外，本发明胞外多糖发酵、生产工艺简单，无毒副作用，使用安全。
Claims (4)
1.一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)胞外多糖，其特征是红外光谱在3600-3200cm-1、3000-2800cm-1和1400-1000cm-1处有多糖特征吸收峰存在；硫酸蒽酮法和硫酸苯酚法显色呈阳性；紫外260nm和280nm处无可见吸收峰。
2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌胞外多糖的制备方法，其特征是从枯草芽孢杆菌发酵液中提取、纯化和鉴定胞外多糖，具体步骤为：发酵液经4000rpm离心30min去除菌体，并减压浓缩至适当体积，然后加3倍体积95％的乙醇沉淀，沉淀用丙酮和乙酸乙酯洗涤两次，然后溶于水，用Sevag法p反复除去蛋白质，最后用3倍体积95％的乙醇沉淀，60℃烘干得干物质，即为胞外多糖。
3.根据权利要求1所述的胞外多糖在制备治疗肿瘤药物中的应用。
4.根据权利要求1所述的胞外多糖在制备免疫调节保健品或免疫调节药物中的应用。
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