CN102399839B - 一种冷解糖芽孢杆菌胞外多糖的生产工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种冷解糖芽孢杆菌胞外多糖的生产工艺及其在肥料中应用。本发明冷解糖芽孢杆菌胞外多糖不仅对植物周边土壤、茎、叶具有良好的保水性，可以吸附重金属离子减少环境污染，而且还能抑制多种真菌病；将该胞外多糖作为一种新型功能性肥料添加剂，可广泛应用于叶面肥、滴灌肥、菌肥等肥料中，其应用前景广阔。本发明冷解糖芽孢杆菌胞外多糖的生产工艺为分离获得冷解糖芽孢杆菌HD-3菌株、制备种子培养液、发酵、提取、烘干即得多糖产品。由于本发明优化了培养基配方与生产工艺，此胞外多糖产量高、成本低，成品含多糖在90％以上。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种冷解糖芽孢杆菌胞外多糖的生产工艺及其应用。
背景技术
微生物胞外多糖是一些特殊微生物在生长代谢过程中分泌到细胞壁外、易与菌体分离、分泌到环境中的水溶性多糖，属于微生物的次级代谢产物。它与普通多糖相比，理化性质独特，结构和功能具优良特异性。目前对微生物胞外多糖生物活性的研究主要集中在医药、食品、化工领域，如抗肿瘤药物、增强免疫力的功能性食品、絮凝剂等化工产品；但对于胞外多糖在农业方面，尤其在肥料中的应用研究还较少。本发明旨在利用优良微生物菌株，通过优化培养基，改进生产工艺，降低产品成本，使其优良功能在肥料应用中得以发挥利用。
发明内容
针对全球变暖，水资源短缺，土壤沙化、重金属污染日益严重的现状及传统化学肥料和普通微生物肥料的不足，本发明旨在利用筛选到的一种冷解糖芽孢杆菌菌株通过微生物发酵制备胞外多糖，通过筛选优化培养基，改进生产工艺，得到高产、高纯度胞外多糖；该胞外多糖按照一定比例应用于叶面肥、滴灌肥、菌肥中，不仅可以保水改良作物生长环境，而且对重金属吸附能力、抗真菌病强，可改善产品品质，提高产品产量。
具体实施方式
为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：
该冷解糖芽孢杆菌HD-3菌株，其分类命名为冷解糖芽孢杆菌(Bacilluspsychrosaccharolyticus)，已于2010年12月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路，中国科学院微生物研究所，其保藏编号为CGMCC No.4519。
所述冷解糖芽孢杆菌HD-3菌株的菌落大小28-32mm，圆形，白色，边缘较整齐且呈隆起状，菌落表面有膜，膜下较湿润、呈粘稠状、透明，易挑取，显微镜下观察菌体呈杆状，芽孢中生，呈椭圆形。
本发明冷解糖芽孢杆菌胞外多糖(以下简称HD-3多糖)生产工艺步骤为：
1)分离获得高效生产菌株——冷解糖芽孢杆菌HD-3菌株可从黄豆酱中分离获得。
2)制备种子培养液：将菌株斜面接种于普通营养肉汤培养基，pH6.8～7.4，在温度30～35℃、170rpm转速、通风比1∶1培养18～24小时，获种子培养液。
3)发酵生产：种子培养液以3％～10％的接种量接种于多糖发酵培养基中，培养基组分按重量比，以g/L为单位，分别为：蔗糖5.0～25，淀粉3.0～10，豆粕5.0～30，蛋白胨1.0～10，碳酸钙2.0～8.0，磷酸氢二钾0.5～1.0，硫酸镁0.5～1.0，硫酸锰0.001～0.2，pH 7.0～8.5。发酵温度24～32℃、搅拌速度210rpm、通风比1∶0.3～0.8发酵3～5天。
4)提取：发酵液经高速离心去菌体，上清液真空浓缩至原液体积的三分之一，用2～3倍的95％乙醇沉淀，沉淀物采用sevag法去蛋白，经再次乙醇沉淀，沉淀物经等量的75％乙醇洗涤2～3次，在60～70℃烘干，粉碎后得胞外多糖产品。
用上述生产工艺发酵生产的HD-3胞外多糖一般含多糖90％以上，为酸性胞外多糖，其表面有丰富的羟基和羧酸基。本发明胞外多糖不仅对植物周边土壤、茎、叶具有良好的保水性，可以吸附重金属离子减少环境污染，而且还能抑制多种真菌病。将该胞外多糖作为一种新型功能性肥料添加剂，可广泛应用于叶面肥、滴灌肥、菌肥等肥料中，其应用前景广阔。
以下给出HD-3胞外多糖保水性、吸附重金属离子及抑制真菌活性实验。
1)HD-3胞外多糖保水性测定
采用计算土壤水分蒸发速率的方式测定HD-3胞外多糖保水性。以长宽高均为10厘米，体积为1立方分米的正方体为容器，土壤为普通黄土，经105℃，4小时烘干至恒重，填入容器压实，记下土壤质量(Ms)；以自来水为对照，使土壤充分吸水，记下所用自来水质量(Mw)；分别以十万分之一(A)、万分之一(B)浓度的HD-3胞外多糖溶液为实验对象，将与对照相同质量的土壤和胞外多糖溶液填入空置容器，分别将其在30℃恒温放置3～15天，测定水分蒸发情况。通过测量放置若干天后，单位容器内土壤的质量(M)，经过下面公式计算出水分蒸发率。
下表为土壤水分蒸发率结果：
结果表明，HD-3胞外多糖对土壤有一定的保水性，且随着胞外多糖浓度的升高，土壤持水量增大，土壤水分蒸发速率降低。
2)HD-3胞外多糖吸附重金属离子效果实验
分别配制20mg/L Pb2+、Cd2+、Cu2+溶液；准确称量0.02±0.0005g HD-3胞外多糖样品于10个50mL干燥离心管中；各加入30mL Pb2+、Cd2+、Cu2+溶液，如下进行2组实验：
①5个离心管于(28±1)℃恒温水浴中振荡，时间分别为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0h，离心，萃取，用原子吸收分光光度计测定Pb2+、Cd2+、Cu2+浓度。结果如下表：
由上表格可知，HD-3胞外多糖对Pb2+、Cd2+、Cu2+的吸附达到平衡的时间分别为1.0h、2.0h、2.0h，吸附量Pb2+＞Cu2+＞Cd2+。
②5个离心管分别调pH值依次为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0；于(28±1)℃恒温水浴中振荡2.0h，离心，萃取，用原子吸收分光光度计测定Pb2+、Cd2+、Cu2+浓度。结果如下表：
由上表格可知，HD-3胞外多糖对Pb2+、Cd2+、Cu2+的吸附在pH6～8范围内吸附量较大。在此范围内比较最大吸附量，仍是Pb2+＞Cu2+＞Cd2+。
结果表明，本发明的HD-3胞外多糖对上述重金属离子都有不同程度的吸附作用。
3)HD-3胞外多糖抑制真菌活性实验
采用平板对峙法测试HD-3胞外多糖对指示菌的抑菌活性，平板中央接种指示菌菌块，在距离指示菌菌块2.5cm处接种1.0‰含量的HD-3胞外多糖溶液，200微升，另一侧不接该胞外多糖，以供测量空白指示菌半径，10℃～40℃恒温培养1-10d，观察指示菌菌丝生长情况，测量抑菌结果。
抑菌宽度(mm)＝空白侧指示菌半径-接种HD-3胞外多糖侧指示菌半径抑菌结果如下表：
结果表明，本发明的HD-3胞外多糖对上述指示菌都有不同程度的抑菌作用；且抑菌率均在50％以上，效果良好。
本发明还提供所述冷解糖芽孢杆菌HD-3胞外多糖在肥料中的应用。
实施例1：HD-3胞外多糖在叶面肥中的应用实例
取HD-3胞外多糖1.0‰，其它原料如尿素、磷酸氢二钾、硫酸钾、硫酸亚铁、硼酸、硫酸铜、硫酸锌、钼酸铵、硫酸锰等按照一定比例制成氮磷钾含量分别为6％、1.5％、5％，微量元素总量大于2％的叶面肥。步骤是将1.0g胞外多糖溶于1kg自来水中，打开搅拌加热至60℃，使其全部溶解；然后加入其它所需原料，搅拌20min至全部溶解，过40目筛网后，灭菌灌装于100mL的塑料瓶中，密封，即为多糖叶面肥成品。
实施例2：HD-3胞外多糖在滴灌肥中的应用实例
取HD-3胞外多糖1.5‰，其它原料如尿素、磷酸氢二钾、硝酸钾、生化黄腐酸、硫酸亚铁、硼酸、硫酸铜、硫酸锌、钼酸铵、硫酸锰等按照一定比例制成氮磷钾含量分别为8％、7％、5％，微量元素总量大于2％，有机质含量大于30％的滴灌肥。步骤是将1.5g胞外多糖溶于1kg自来水中，打开搅拌加热至60℃，使其全部溶解；然后加入生化黄腐酸，搅拌20min至全部溶解，加入其它所需原料，继续搅拌至全部溶解，过40目筛网后，灭菌灌装于500mL的塑料瓶中，密封，即为多糖滴灌肥成品。
实施例3：HD-3胞外多糖在菌肥中的应用实例
1)粉状菌肥：取HD-3胞外多糖1.2‰，其它原料如腐植酸、凹凸棒、草木灰、浒苔粉、硅藻土、膨润土、菌液等，按照一定比例混合均匀，粉碎，过100目筛网，装袋即成含多糖粉状菌肥成品。
2)液体菌制剂：取HD-3胞外多糖1.0‰，其它原料如尿素、硫酸钾、磷酸氢二钾、海带原浆、生化黄腐酸、乳化剂、菌液等按照一定比例混合均匀，制成有效活菌数大于10亿/mL的液体菌制剂。步骤是将1.0‰的HD-3胞外多糖溶于海带原浆，加入生化黄腐酸，搅拌并40～60℃保温20min；然后加入尿素、硫酸钾、磷酸氢二钾等原料，搅拌至全部溶解；最后加入菌液和乳化剂，灌装于100或250mL塑料瓶中，密封，即成含多糖液体菌制剂成品。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
Claims (1)
1.一种冷解糖芽孢杆菌胞外多糖的生产工艺，其特征在于所涉及的微生物为冷解糖芽孢杆菌(Bacillus psychrosaccharolyticus)，指定名称HD-3，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.4519；其生产工艺为，分离获得高产生产菌株——冷解糖芽孢杆菌HD-3菌株；制备种子培养液；接种发酵罐生产；提取，烘干得胞外多糖；所述的接种发酵罐生产为，种子培养液以3％～10％的接种量接种于多糖发酵培养基中，培养基组分以g/L为单位，分别为：蔗糖5.0～25，淀粉3.0～10，豆粕5.0～30，蛋白胨1.0～10，碳酸钙2.0～8.0，磷酸氢二钾0.5～1.0，硫酸镁0.5～1.0，硫酸锰0.001～0.2，pH7.0～8.5；发酵温度24～32℃、搅拌速度210rpm、通风比1∶0.3～0.8发酵3～5天；所述的提取，烘干得胞外多糖为，发酵液经高速离心去菌体，上清液真空浓缩至原液体积的三分之一，用2～3倍的95％乙醇沉淀，沉淀物采用sevag法去蛋白，经再次乙醇沉淀，沉淀物经等量的75％乙醇洗涤2～3次，在60～70℃烘干，粉碎后得胞外多糖产品。
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Denomination of invention: Production process of extracellular polysaccharide from Bacillus subtilis Effective date of registration: 20210622 Granted publication date: 20141231 Pledgee: Qingdao high tech Industrial Development Zone sub branch of China Construction Bank Co.,Ltd. Pledgor: QINGDAO SEAWIN BIOTECH GROUP Co.,Ltd. Registration number: Y2021370010037 |
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Date of cancellation: 20220506 Granted publication date: 20141231 Pledgee: Qingdao high tech Industrial Development Zone sub branch of China Construction Bank Co.,Ltd. Pledgor: QINGDAO SEAWIN BIOTECH GROUP Co.,Ltd. Registration number: Y2021370010037 |
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