CN113491707A - 一种活性多糖在制备增强免疫力药物、药物组合物或保健食品中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种活性多糖在制备增强免疫力药物、药物组合物或保健食品中的应用。本发明以菲律宾蛤仔软体部分为原料，筛选出以纳豆菌为出发菌种的发酵法制备能够显著增强机体免疫力的活性多糖，并采用环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠模型，研究了活性多糖的免疫调节活性，并初步分析其作用机制，从免疫抑制的预防和治疗作用两个层面，验证了活性多糖对机体免疫力的增强作用。

Description

一种活性多糖在制备增强免疫力药物、药物组合物或保健食 品中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种活性多糖在制备增强免疫力药物、药物组合物或保健食品中的应用。
背景技术
菲律宾蛤仔作为“药食同源”的海之珍品，因其价格低廉、分布广泛、食用药用价值高及潜在价值高等优点，逐渐成为食品、医药和化妆品等领域开发的重要原材料。近年来，许多学者就菲律宾蛤仔中的活性物质进行研究，发现从中提取的氨基多糖、糖胺聚糖等物质具有抗肿瘤、抗氧化等作用。我国菲律宾蛤仔资源丰富，为多糖的利用开发提供了丰富的来源。多糖生物活性的实现与其化学组成和结构密切相关，而多糖的制备和提取方法对其空间结构影响较大。为了打破传统方法的局限性，利用微生物特别是益生菌(如乳酸菌和芽孢杆菌等)发酵，为活性胞外多糖的获得提供了一种新的思路和途径。
目前，据报道多种微生物如乳酸菌、酵母菌、纳豆菌和出芽短梗霉等均可产生活性多糖，并具有较好的功能活性，但是目前有关其免疫调节及抗肿瘤作用的研究较少，且其功能性研究也大多局限于体外实验。免疫力是维持人体健康的重要基础，目前有近80％的疾病直接或间接与人体免疫力的紊乱有关联。当前，随着人类健康、营养需求的提升以及海洋生物产业增长方式的转变，开发天然且无毒副作用的增强免疫的药物或新型功能性食品，具有巨大的经济价值与应用前景。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中存在的上述问题，提出了一种活性多糖在制备增强免疫力药物、药物组合物或保健食品中的应用，本发明以菲律宾蛤仔软体部分为原料，筛选出以纳豆菌为出发菌种的发酵法制备新型多糖，并采用环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠模型，研究了活性多糖的免疫调节活性，并初步分析其作用机制，验证了活性多糖对机体免疫力的增强作用。
本发明的技术方案是：
一种活性多糖在制备增强免疫力药物、药物组合物或保健食品中的应用。
进一步的，所述增强免疫力包括对免疫力低下的预防和治疗作用。
为了验证活性多糖可以增强机体的免疫力，本发明以环磷酰胺(Cyclophosphamide，CTX)致免疫抑制BALB/c小鼠为模型，分别从预防和治疗两个层面，通过体重、免疫脏器指数、血常规指标、结肠形态、免疫球蛋白含量、肠组织屏障以及sIgA基因表达量变化予以综合评价。
进一步的，所述药物、药物组合物或保健食品的活性成分包括活性多糖。
进一步的，所述活性多糖为利用枯草芽孢杆菌纳豆亚种发酵菲律宾蛤仔制备的活性多糖，所述枯草芽孢杆菌纳豆亚种的保藏编号为CCTCC NO:M 2018080。
发酵步骤包括：向制备的无菌种子培养基中接入保藏菌种，将其置于37℃，180r/min条件下恒温培养8h，制备一级种子液；以5％(v:v)的接种量接入无菌种子培养基，相同条件下培养2h，制备二级种子液；称取菲律宾蛤仔肉泥，以1:4.5(m:v)的料液比添加蒸馏水，经灭菌后配制成无菌发酵培养基，将二级种子液以9％(v:v)的接种量接入发酵培养基，置于37℃，180r/min条件发酵36h；发酵结束，按照醇沉、复溶(除蛋白)、再醇沉、冻干等操作获得多糖样品，将其命名为EPS。
进一步的，所述药物组合物包括药剂学上可接受的药物辅料和所述活性多糖。
进一步的，所述药物、药物组合物的剂型包括片剂、颗粒剂、胶囊剂、注射剂、冲剂、口服液体制剂、喷雾剂。
进一步的，所述保健食品包括保健食品中可接受的辅料和所述活性多糖，所述保健食品的剂型包括片剂、颗粒剂、胶囊剂、冲剂、口服液体制剂。
本发明的有益效果：
(1)本发明所提供的活性多糖能够显著增强机体免疫力，通过建立免疫抑制模型的方法检测并验证了活性多糖对于免疫抑制的预防和治疗作用。
(2)本发明所提供的活性多糖能够改善免疫抑制小鼠的精神状态，增强食欲、恢复体重正常增长，刺激免疫器官生长，CTX引起的脾脏和胸腺萎缩状况得以改善，白细胞数目有所回升，与模型组相比，中剂量多糖预防和高剂量多糖治疗的效果最为显著(P<0.05)。
(3)本发明所提供的活性多糖可刺激免疫细胞产生免疫球蛋白IgE，表明活性多糖通过体液免疫途径参与小鼠的免疫应答，起到免疫调节作用，多糖的预防效果更为明显，说明多糖可以增强小鼠的免疫力，提高抵御能力。
(4)本发明所提供的活性多糖可抑制巨噬细胞过度分泌促炎因子IL-6，表明多糖通过细胞免疫途径，起到消除机体炎症的作用。
(5)结肠组织的H&E染色结果显示，CTX造成肠粘膜的损伤，肠粘膜变得通透，机械屏障被破坏。活性多糖可修复结肠组织形态，提高肠组织连接蛋白的表达量，维护结肠的机械屏障；同时调节sIgA相关基因表达量促进其分泌，通过增强肠道免疫功能提高小鼠的免疫力。
附图说明
图1为活性多糖对小鼠体重的变化影响示意图；
图2为活性多糖对小鼠摄食量的变化影响示意图；
图3为活性多糖对小鼠脾脏的影响；
图4为活性多糖对小鼠胸腺的影响；
图5为活性多糖对小鼠血常规指标的影响，其中，a为白细胞数目，b为红细胞数目，c为血红蛋白含量，d为血小板总数；
图6为结肠形态(100倍)；其中，(A)空白组，(B)模型组，(C)低剂量组，(D)中剂量组，(E)高剂量组；
图7为活性多糖对小鼠肠粘膜蛋白表达的影响，其中，(a)为黏附连接蛋白E-cadherin的表达量，(b)为紧密连接蛋白Occludin的表达量，(c)为紧密连接蛋白OZ-1的表达量；
图8为活性多糖对免疫抑制小鼠肠道sIgA基因表达的影响；
图9为活性多糖对免疫治疗模型小鼠体重的变化影响示意图；
图10为活性多糖对免疫治疗模型小鼠摄食量的变化影响示意图；
图11为活性多糖对免疫治疗模型小鼠免疫器官的影响，其中，(1)活性多糖对小鼠脾脏形态的影响，(2)活性多糖对小鼠胸腺形态的影响，(3)活性多糖对小鼠脾脏指数的影响，(4)活性多糖对小鼠胸腺指数的影响；
图12为活性多糖对免疫治疗模型小鼠血常规指标的影响，其中，(11)白细胞数目；(12)红细胞细胞数目；(13)血红蛋白含量；(14)血小板总数；
图13为活性多糖对免疫治疗模型小鼠血清中IgE含量的影响；
图14为活性多糖对免疫治疗模型小鼠血清中IL-6含量的影响；
图15为活性多糖对免疫治疗模型小鼠结肠形态的影响(100倍)；其中，(A)空白组；(B)模型组；(C)低剂量组；(D)中剂量组；(E)高剂量组；(F)阳性药物LMS组；
图16为活性多糖对免疫治疗模型小鼠肠粘膜蛋白表达的影响；其中，(aa)黏附连接蛋白E-cadherin的表达量，(bb)紧密连接蛋白Occludin的表达量，(cc)紧密连接蛋白OZ-1的表达量；
图17为活性多糖对免疫治疗模型小鼠肠道sIgA基因表达的影响。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂及仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实验动物为SPF级BALB/c小鼠(雄性，5周龄，17～18g)66只，购于北京斯贝福生物科技有限公司，许可证号：SCXK(京)2019-0010，饲养于青岛大学医学院动物中心SPF级动物房，小鼠可自由饮水和摄食。
灌胃受试物多糖EPS的制备方法如下：
采用发明人实验室前期筛选得到的纳豆菌(菌种保藏编号：CCTCC NO:M 2018080)通过发酵法制备。步骤为：制备无菌种子培养基，在超净工作台内接入甘油管保藏菌种，置于37℃，180r/min条件下的恒温培养摇床中培养8h，制备一级种子液；以5％(v:v)的接种量接入无菌种子培养基，相同条件下培养2h，制备二级种子液。称取菲律宾蛤仔肉泥200.0g于5L锥形瓶内，以1:4.5(m:v)的料液比添加蒸馏水，经灭菌后配制成无菌发酵培养基，将二级种子液以9％(v:v)的接种量接入发酵培养基，置于37℃，180r/min条件的摇床发酵36h；发酵结束，按照醇沉、复溶(除蛋白)、再醇沉、冻干等操作获得多糖样品(Extracellularpolysaccharides)，将其命名为EPS。
(一)活性多糖对免疫抑制动物的预防和改善作用
1、动物分组及处理方案
选取30只SPF级BALB/c小鼠(雄性，5周龄，17～18g)，适应性饲养7天后，随机分为5组，即空白组、模型组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组6只。动物分组及灌胃方案如表1所示。对于3个各剂量活性多糖的试验组(即低剂量组、中剂量组和高剂量组)，灌胃周期为：前50天灌胃活性多糖EPS(预防50天)，之后连续3天注射80mg/(kg bw·d)环磷酰胺，建立免疫抑制小鼠模型(造模同时灌胃活性多糖)，第54～74天继续灌胃多糖EPS(治疗21天)。空白组不造模，灌胃等体积的生理盐水；模型组与试验组同步造模，同时灌胃等体积生理盐水。
表1动物分组及灌胃方案
组别 动物数/只 灌胃药物 灌胃天数/d
空白组 6 生理盐水 74
模型组 6 生理盐水 74
低剂量组 6 500mg/(kgbw·d)EPS 74
中剂量组 6 1000mg/(kgbw·d)EPS 74
高剂量组 6 2000mg/(kgbw·d)EPS 74
为了观察小鼠的日常状态，在实验过程中，观察动物的体重和摄食量进行记录，每隔3天记录一次体重，每隔7天记录一次摄食量。
小鼠的体重变化结果如图1所示，在造模之前，各组小鼠的体重平稳增加；第51天注射环磷酰胺药物后，模型组小鼠的体重明显下降，与空白组小鼠的体重具有显著性差异(P<0.05)，在造模后12天体重降至最低。与模型组相比，低、中、高剂量组的小鼠体重虽有所下降，但无显著性差异(P>0.05)，这说明前期活性多糖的干预起到一定的调节作用。造模成功后，继续给予活性多糖干预，在第57天活性多糖低、中、高剂量组的小鼠体重开始回升，但模型组小鼠的体重仍处于下降状态。由此可见，活性多糖具有改善环磷酰胺造成小鼠体重下降的效果。
每隔7天记录一次摄食量，数值代表每个组平均每只小鼠7天的总摄食量，小鼠的摄食量变化如图2所示。第0天表示实验开始前，7天适应性饲养期间每组小鼠的摄食量。空白组小鼠的摄食量随体重增加而增加，模型组和试验组小鼠注射环磷酰胺药物后，出现毛发竖立、脱毛、弓背、精神不振等不良反应，摄食量明显减少，因而体重下降严重。在经过活性多糖干预一段时间后，小鼠状态出现好转，食欲增强，摄食量增加。
2、动物取血和取材
末次灌胃后禁食12h、禁水1h，称重，眼球取血，其中100μL保存于抗凝管中，常温保存，用于血常规指标检测，剩余血样保存于促凝管中，静置30min后离心得血清，置4℃冰箱，用于生化指标检测。
采血后脱颈处死小鼠，取胸腺、脾脏、心脏、肺、肝脏及肾脏、结肠，去除表面脂肪，生理盐水清洗后置于滤纸上将水分吸干后称重，得到如下表2的数据；其中，脏器指数公式为：脏器指数(mg/g)＝脏器质量(mg)/小鼠体质量(g)。
取长约1cm结肠保存于4％中性甲醛固定液，剩余的包在锡箔纸里并立即放在液氮中，保存在-80℃超低温冰箱。
表2活性多糖对小鼠内脏指数的影响
Figure BDA0003222603730000051
注：*表示与空白组具有显著性差异，P<0.05。
由表2可以得知，免疫抑制小鼠的肝脏、肾脏、心脏指数与正常空白组无显著性差异(P>0.05)。虽然高剂量组的肺指数与正常空白组相比增大，但是从解剖情况看高剂量组小鼠的肺均无明显异常，表明活性多糖对小鼠无明显毒性。
为了分析活性多糖对免疫抑制小鼠免疫器官的保护效果，对小鼠的免疫器官胸腺和脾脏进行拍照，观察形态变化并计算器官指数计算。如图3和4所示，与空白组比较，模型组小鼠的脾脏和胸腺明显萎缩，脾脏指数、胸腺指数均低于空白组，表示免疫抑制动物模型复制成功。活性多糖低、中、高剂量组与模型组相比，免疫器官的萎缩症状有所改善，与空白组相比已无显著性差异(P>0.05)。结果表明活性多糖可有效提高免疫器官指数，对胸腺和脾脏有一定保护作用，尤其是对胸腺的保护效果显著(P<0.05)。其中，图中*P<0.05，表示与空白组相比，具有显著性差异；#P<0.05，表示与模型组相比，具有显著性差异。
在进行免疫抑制小鼠的血常规指标分析中，白细胞数目的变化如图5a所示，各种类白血胞数目及百分比的变化如表3和表4所示。采用环磷酰胺对小鼠造模后，小鼠白细胞数目、淋巴细胞数目、嗜碱性粒细胞数目和百分比显著降低(P<0.05)，单核细胞数目和百分比、淋巴细胞百分比有所降低，而中性粒细胞百分比则有所升高，对中性粒细胞数目，嗜酸性粒细胞数目、百分比均无显著影响(P>0.05)。给予活性多糖干预后，与模型组比较，低、中、高剂量组小鼠白细胞、淋巴细胞数量显著升高(P<0.01)，中性粒细胞数目和百分比以及嗜碱性粒细胞数目均有所提升，低、中剂量组单核细胞数目和低剂量组单核细胞百分比则显著提升(P<0.01)。
表3活性多糖对小鼠各白细胞种类数目的影响
Figure BDA0003222603730000061
注：ND1表示未检测到；
*P<0.05，与空白组相比，具有显著性差异；**P<0.01，与空白组相比，具有极显著性差异；
#P<0.05，与模型组相比，具有显著性差异；##P<0.01，与模型组相比，具有极显著性差异。
表4活性多糖对小鼠各白细胞种类百分比的影响
Figure BDA0003222603730000071
注：ND1表示未检测到；
*P<0.05，与空白组相比，具有显著性差异；**P<0.01，与空白组相比，具有极显著性差异；
#P<0.05，与模型组相比，具有显著性差异；##P<0.01，与模型组相比，具有极显著性差异。
红细胞数目如图5b所示，各组小鼠的红细胞总数之间无显著性差异，说明在实验过程中小鼠没有表现出贫血症状。血红蛋白含量如图5c所示，各组小鼠的血红蛋白无显著性差异，均在正常范围内，说明血红蛋白可维持红细胞发挥其正常功能。血小板数目如图5d所示，与正常组小鼠相比，免疫抑制小鼠的血小板数目偏高，这说明注射过量环磷酰胺会导致血小板增多，引发小鼠炎症。(图5中，*P<0.05，与空白组相比，具有显著性差异；**P<0.01，与空白组相比，具有极显著性差异；#P<0.05，与模型组相比，具有显著性差异；##P<0.01，与模型组相比，具有极显著性差异)。
3、血清中IgE指标检测
促凝管中的小鼠血样静置30min后，于4℃，4000r/min条件下离心10min，取上层血清，利用全自动生化分析仪检测其免疫球蛋白IgE的含量。
为了弄清活性多糖对小鼠免疫球蛋白的影响，检测血清中免疫球蛋白IgG、IgA、IgM和IgE的含量。结果如表5所示，在各类免疫球蛋白指标中，IgE的变化最为明显。与空白组相比，模型组的IgE含量明显降低，与空白组具有极显著性差异(P<0.01)。与模型组相比，活性多糖干预的各试验组小鼠的IgE含量均有极显著提高(P<0.01)，说明活性多糖可刺激小鼠免疫系统产生免疫球蛋白IgE，从而发挥免疫调节活性。
表5活性多糖对小鼠各免疫球蛋白含量的影响
Figure BDA0003222603730000072
Figure BDA0003222603730000081
注：*P<0.05，与空白组相比，具有显著性差异；**P<0.01，与空白组相比，具有极显著性差异；#P<0.05，与模型组相比，具有显著性差异；##P<0.01，与模型组相比，具有极显著性差异。
4、结肠H&E染色
小鼠结肠部位清理干净后，将其放入4％的多聚甲醛溶液中，固定24h，之后脱水，常规石蜡包埋，切片。采用H&E染料染色5min，脱水，中性树胶封片。
结肠形态如图6所示，空白组的结肠绒毛排列整齐、紧凑，杯状细胞清晰有序，而模型组的结肠绒毛明显发生破损，隐窝丢失，说明环磷酰胺破坏了肠黏膜，杯状细胞数目减少，肠壁变薄，导致小鼠肠道机械屏障损坏。小鼠灌胃活性多糖后，各剂量试验组的结肠绒毛完整无破损，杯状细胞清晰，肠壁增厚，尤其是中剂量组改善效果更为明显，表明活性多糖可以缓解环磷酰胺对肠组织的机械屏障损伤，起到免疫保护效果。
5、Western-blot法测定结肠组织中连接蛋白的表达量
取保存于4℃的组织裂解液，按每1mL添加10μL PMSF配制，使得PMSF的最终浓度为1mM，混匀备用。取约0.1g保存于-80℃的结肠组织于1.5mL离心管中，加入1mL组织裂解液及适量的陶瓷珠，用封口膜密封后放入预冷的组织匀浆机中，匀浆后放置于4℃孵育30min。开启低温冷冻离心机，12000r/min，4℃，离心10min，分离上清为蛋白质抽提物。
将各组匀浆上清液用BCA试剂盒测定其蛋白浓度，用缓冲液和PBS稀释蛋白样品，在沸水浴中煮沸5min，制成上样液，备用。组装好电泳装置，制备聚丙烯酰胺凝胶，上样进行SDS-PAGE。电泳结束后，将凝胶放至装有转印缓冲液的容器内，浸泡10min，放入转印槽内转印1.5h。
用5％(m:v)脱脂奶粉稀释抗体，制成抗体工作液，倒入杂交袋中，放入PVDF膜后封口，按照表6条件进行抗体孵育。将漂洗好的孵育一抗的PVDF膜放入盛有二抗工作液的杂交袋中，然后封口，按照表7条件进行抗体孵育。取出孵育二抗后的PVDF膜，均匀的洒上ECL发光液，静置反应5min，去除多余液体后转入暗盒中，在暗室进行曝光。
表6一抗孵育条件
Figure BDA0003222603730000082
Figure BDA0003222603730000091
表7二抗孵育条件
一抗名称 二抗名称 稀释比例 孵育条件
E-cadherin antibody 羊抗兔IgG-HRP 1:5000 37℃45min
Occludin antibody 羊抗兔IgG-HRP 1:5000 37℃45min
ZO-1 antibody 羊抗兔IgG-HRP 1:5000 37℃45min
β-actin antibody 羊抗兔IgG-HRP 1:5000 37℃45min
为探究活性多糖对肠道免疫的影响，利用Western-blot检测肠道上皮细胞黏附连接蛋白E-cadherin、紧密连接蛋白Occludin和紧密连接蛋白OZ-1的表达量。如图7(a)(b)(c)所示，与空白组相比，模型组的E-cadherin、Occludin和OZ-1蛋白表达量显著降低，表明注射环磷酰胺对小鼠的肠道黏膜造成损伤。经过活性多糖干预后，各剂量试验组小鼠的肠黏膜蛋白表达有不同程度的提高，尤其是中剂量组的效果明显；表明活性多糖能够通过保护和维持紧密连接蛋白和黏附连接蛋白的表达量，恢复肠道上皮细胞的屏障功能，改善环磷酰胺造成的肠道黏膜损伤。(注：图7中，*P<0.05，与空白组相比，具有显著性差异；**P<0.01，与空白组相比，具有极显著性差异；#P<0.05，与模型组相比，具有显著性差异；##P<0.01，与模型组相比，具有极显著性差异。)
6、Real Time-PCR法测定结肠组织中sIgA基因表达量
取约0.1g的结肠组织于灭菌离心管中，加入1mL TRIpure裂解液，放入预冷的组织匀浆机中，充分匀浆后在室温下静置5min，4℃，10000×g离心10min，取上清液并加入异丙醇，-20℃条件下过夜。离心取沉淀加入1mL 75％乙醇，混匀后离心，弃上清；晾干沉淀，加入30μLRNase-free ddH2O溶解沉淀，室温放置2min，充分混匀，待其沉淀完全溶解，所得到的即为结肠组织总RNA。各组样品中取少量进行RNA浓度测定以及纯度分析，其余放置于-80℃保存备用。随后，将RNA样本进行反转录以得到对应的cDNA。
按照表8反应体系进行Real time PCR反应。以β-actin基因mRNA表达量为内参，根据NCBI数据库检索目的基因的mRNA序列，设计跨内含子区的特异性引物，引物信息见表9。
表8 RT-PCR反应体系
试剂 体积(μL)
cDNA模板 1
上游引物(10μM) 0.5
下游引物(10μM) 0.5
SYBR GREEN mastermix 10
ddH<sub>2</sub>O 8
总体积 20
表9基因引物序列
名称 序列 引物长度 Tm
IgAα-chain F TCTTGTCATACGCCTGTTT 19 50.9
IgAα-chain R ATTAGGGTTCCTGCCATT 18 51.6
J-chain F GTAACAGGTGACGACGAA 18 48.3
J-chain R CTGGGTGGCAGTAACAAC 18 50.9
pIgR F ACGCTCTTGGTAACTGTCT 19 49.1
pIgR R TCTGCCTGAATACTCCTTG 19 50.4
β-actin F CTGTGCCCATCTACGAGGGCTAT 23 64.5
β-actin R TTTGATGTCACGCACGATTTCC 22 63.2
注：IgAα-chain为IgA重链恒定区基因，J-chain为IgA J链基因(Immunoglobulinjoining chain)，pIgR(polymeric immunoglobulin receptor)为多聚免疫球蛋白受体基因；引物由金斯瑞生物科技有限公司合成。
IgAα-chain、J-chain、pIgR的表达水平如图8所示，模型组小鼠肠黏膜的sIgA基因表达明显降低，与正常小鼠相比具有极显著性差异(P<0.01)，说明环磷酰胺不仅破坏了肠道黏膜的完整性，而且会降低黏膜分泌免疫活性分子sIgA。活性多糖干预后，控制sIgA合成分泌的基因IgAα-chain、J-chain、pIgR的表达水平上升，与模型组相比，中剂量组的IgAα-chain、J-chain表达量达极显著水平(P<0.01)。结果表明活性多糖能显著改善肠道损伤，保障肠道黏膜发挥正常功能，分泌免疫活性物质来抵御外来侵害。(注：图8中，*P<0.05，与空白组相比，具有显著性差异；**P<0.01，与空白组相比，具有极显著性差异；#P<0.05，与模型组相比，具有显著性差异；##P<0.01，与模型组相比，具有极显著性差异。)
(二)活性多糖对免疫抑制动物的治疗作用
1、动物分组及处理方案
取36只SPF级BALB/c小鼠(雄性，5周龄，17～18g)，适应性饲养7天后，随机分为6组，即空白组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组和阳性药物组，每组6只。动物分组及灌胃方案如表10所示，灌胃周期为：除空白组外，其它各组均在实验开始前3天注射80mg/(kg bw·d)环磷酰胺，建立免疫抑制小鼠模型；随后14天，低、中、高剂量组按照表10中方案对应剂量灌胃活性多糖，阳性药物组灌胃30mg/(kgbw·d)盐酸左旋咪唑(LMS，免疫调节剂)，空白组和模型组灌胃等体积的生理盐水。
在实验过程中，观察动物的体重及状态变化并做好记录，每隔3天记录一次体重，每隔3天记录一次摄食量。
表10动物分组及给药方案
Figure BDA0003222603730000101
Figure BDA0003222603730000111
活性多糖对免疫抑制小鼠体重和摄食量的影响如图9和图10所示。由图可见，空白组小鼠的体重平稳增长，而注射了环磷酰胺的小鼠在前3天体重急剧下降，食欲不振。活性多糖各剂量试验组和左旋咪唑阳性药物组在第4天体重开始有所上升，而模型组小鼠的体重仍然在继续下降，这说明活性多糖可以提高小鼠的食欲，从而改善因环磷酰胺导致的消瘦状态。
2、动物取血和取材
取血和取材操作同(一)2步骤操作。
活性多糖对小鼠各内脏指数的影响如表11所示，由表可得，内脏指数在各组之间无显著性差异(P>0.05)，说明活性多糖对小鼠无毒害作用。活性多糖对免疫器官脾脏和胸腺的影响如图11所示。与空白组相比，模型组脾脏和胸腺明显萎缩，而免疫抑制状态下通常表现为免疫脏器重量下降，这说明免疫抑制模型复制成功。与模型组相比，多糖试验组免疫器官指数明显升高但与空白组无显著性差异，说明活性多糖可以改善免疫器官的萎缩，起到提高免疫力的作用，且改善效果优于阳性药物盐酸左旋咪唑。
表11活性多糖对免疫治疗模型小鼠内脏指数的影响
Figure BDA0003222603730000112
多糖对小鼠血常规指标的影响如图12所示。由图可见，与空白组相比，模型组白细胞数目明显低于正常水平(P<0.01)，提示小鼠免疫抑制模型复制成功。经多糖干预后，活性多糖各剂量组小鼠的白细胞数目均升高至正常水平，与空白组无显著性差异(P>0.05)，而且多糖对免疫抑制小鼠的改善效果具有剂量依赖性，效果优于阳性药物LMS。结果表明多糖具有恢复外周血白细胞数目的功效。
与空白组相比，模型组的红细胞数目显著降低(P<0.01)，一方面说明注射环磷酰胺会引起小鼠出现贫血症状，这是化疗药物的副作用之一；另一方面可能是因为环磷酰胺对肠道黏膜造成了破坏，导致肠道对营养的吸收功能下降，进一步加重贫血。活性多糖中、高剂量组小鼠的红细胞数目与模型组具有显著性差异(P<0.05)，几乎可以恢复至正常组水平，而且高剂量组活性多糖的效果更好，优于阳性药物LMS组。表明活性多糖具有缓解化疗致贫血的效果。而血红蛋白含量表现出和红细胞数目相同的趋势，进一步说明了活性多糖具有缓解贫血的效果。
与空白组相比，免疫抑制小鼠的血小板数目明显偏高(P<0.05)，这说明注射环磷酰胺引发小鼠炎症。经过活性多糖干预后，血小板含量有所回落，低剂量多糖的效果较好。
各类白细胞数目及百分比的变化如表12和表13所示。注射环磷酰胺后，模型组小鼠的中性粒细胞数目和百分比，淋巴细胞数目，单核细胞数目显著升高(P<0.05)，而淋巴细胞百分比、单核细胞百分比以及嗜碱性粒细胞数目、百分比显著降低(P<0.05)；与模型组比较，给予活性多糖干预后，小鼠的中性粒细胞和淋巴细胞水平恢复正常水平。表明活性多糖具有抗炎活性，可以调节炎症机体的免疫功能。
表12活性多糖对免疫治疗模型小鼠各类白细胞数目的影响
Figure BDA0003222603730000121
表13活性多糖对免疫治疗模型小鼠各类白细胞百分比的影响
Figure BDA0003222603730000122
Figure BDA0003222603730000131
注：表12和13中，ND1表示未检测到；*P<0.05，与空白组相比，具有显著性差异；**P<0.01，与空白组相比，具有极显著性差异；#P<0.05，与模型组相比，具有显著性差异；##P<0.01，与模型组相比，具有极显著性差异。
3、血清中IL-6、IgE指标检测
促凝管中的小鼠血样静置30min后，4℃，4000r/min条件下离心10min，取上层血清，按照ELISA试剂盒说明书的步骤操作，采用双抗体夹心法测定血清中IL-6和IgE的含量。
活性多糖对免疫抑制小鼠血清中IgE含量的影响如图13所示，与空白组相比，模型组小鼠IgE的含量显著降低(P<0.01)。经过活性多糖治疗后，受试物组的IgE含量得以显著提升，且呈现剂量依赖性。中剂量活性多糖组效果与阳性药物组大致相同。结果表明活性多糖可以刺激肠道中的免疫细胞MCs分泌IgE，起到免疫调节作用，缓解肠道炎症。
活性多糖对免疫抑制小鼠血清IL-6的影响如图14所示，小鼠注射环磷酰胺药物后，与正常的空白组小鼠相比IL-6水平极显著升高(P<0.01)，说明动物体内有炎症反应。给予活性多糖干预治疗后，高剂量组和阳性药物组小鼠的IL-6水平显著降低，与模型组有显著性差异(P<0.05)，与空白组则无显著性差异(P>0.05)，说明活性多糖可改善免疫抑制小鼠的炎症，起到免疫调节的作用。
4、结肠H&E染色
步骤同(一)4操作。
结肠形态如图15所示，空白组的结肠绒毛排列整齐紧凑，杯状细胞清晰有序，而模型组的结肠绒毛明显发生破损，杯状细胞数目减少，出现大面积的炎性细胞，说明环磷酰胺破坏肠道机械屏障的同时引发了机体炎症。小鼠灌胃多糖后，绒毛排列整齐，杯状细胞清晰，隐窝明显，无炎症细胞浸润，肠黏膜得到修复，其中以高剂量组改善效果最为显著，而阳性药物组的绒毛长短不一，隐窝模糊。表明活性多糖可以直接修复肠黏膜，起到保护肠屏障的效果。
5、Western-blot法测定结肠组织中连接蛋白的表达量
按照(一)5实验步骤进行操作。
活性多糖对免疫抑制小鼠的结肠组织紧密连接蛋白和黏附连接蛋白表达量的结果如图16所示，与空白组相比，模型组小鼠的黏附连接蛋白E-cadherin、紧密连接蛋白Occludin和紧密连接蛋白OZ-1的表达量均明显下降(P<0.01)，说明CTX对小鼠的肠道造成了损伤，破坏了肠道的机械屏障。经过活性多糖的治疗，肠道黏膜有不同程度的修复，高剂量的活性多糖可显著提高黏附连接蛋白E-cadherin和紧密连接蛋白ZO-1的表达量(P<0.05)，而阳性药物LMS对肠道黏膜的修复无作用。表明活性多糖可以提高肠上皮细胞连接蛋白的表达，增强肠道机械屏障，以抵御外来病原的侵害。
6、Real Time-PCR法测定结肠组织中sIgA基因表达量
按照(一)6实验步骤进行操作。
实验分别对sIgA的三种组成部分IgAα-chain、I-chain和pIgR进行mRNA表达量的检测，结果如图17所示，与空白组相比，模型组小鼠的sIgA基因表达极显著降低(P<0.01)，表明环磷酰胺CTX可以对sIgA各组成成分的mRNA表达产生显著性影响，造成肠道获得性免疫功能低下。经过活性多糖的治疗，中剂量组和高剂量组可以显著地提高IgAα-chain的表达，表明活性多糖可以通过上调IgAα-chain基因表达促进sIgA的分泌，进而改善肠道免疫功能。
上述说明仅为本发明的优选实施例，并非是对本发明的限制，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改型等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种活性多糖在制备增强免疫力药物、药物组合物或保健食品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述增强免疫力包括对免疫力低下的预防和治疗作用。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物、药物组合物或保健食品的活性成分包括活性多糖。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述活性多糖为利用枯草芽孢杆菌纳豆亚种发酵菲律宾蛤仔制备的活性多糖EPS，所述枯草芽孢杆菌纳豆亚种的保藏编号为CCTCCNO:M 2018080。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物组合物包括药剂学上可接受的药物辅料和所述活性多糖。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物、药物组合物的剂型包括片剂、颗粒剂、胶囊剂、注射剂、冲剂、口服液体制剂、喷雾剂。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述保健食品包括保健食品中可接受的辅料和所述活性多糖。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述保健食品的剂型包括片剂、颗粒剂、胶囊剂、冲剂、口服液体制剂。
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