CN114767922A - 搭载益生菌的透明质酸水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种搭载益生菌的透明质酸水凝胶及其制备方法和应用,涉及生物医用材料技术领域,本发明提供的载益生菌的水凝胶搭载益生菌作为活性物质,能较长时间保持益生菌的活性,同时具有良好的可注射性、自愈合性和吸收伤口渗出液的性质,可以抑制耐药菌感染,促进上皮再化和胶原蛋白形成,加速超级细菌感染的伤口修复。本搭载益生菌的复合水凝胶有望发展为伤口敷料,具有良好的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域,尤其是涉及一种搭载益生菌的透明质酸水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
耐药细菌引起的伤口感染是一项临床治疗的巨大挑战。特别是铜绿假单胞菌感染在伤口部位导致严重的炎症反应而延长伤口愈合时间,甚至可能形成无法愈合的伤口导致患者的高死亡率。铜绿假单孢菌通过产生大量的毒力因子,浮游细胞产生、生物膜的产生等多种形式躲避免疫系统并产生耐药突变,且滥用抗生素更加速耐药菌的突变率。因此,急需设计一种可以即可以根除铜绿假单胞菌感染同时也促进伤口愈合生物活性伤口敷料。
研究证明,益生菌有较好的抗菌、免疫调节和调节病原体引起的微生物生态失调等作用,有益于伤口修复、组织修复。其中鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)通过释放有机酸、细菌素、酶等抗菌物质来有效防止致病细菌粘附和生物膜形成。此外,L.rhamnosus可以通过减少促炎因子(例如TNF-α,IL-1β和IL-8)的产生并诱导抗炎细胞因子(如IL-10)的表达来介导炎症反应。据报道,鼠李糖可以通过增加角质形成细胞迁移和增殖来增强上皮再化,加速伤口愈合过程。但在皮肤局部应用过程中受外界因素的影响,其在损伤部位的定植率和存活率较低。如何提高其定植效率和生存活性是亟待解决的问题。
水凝胶具有模拟细胞基质的结构且有包封效率高、孔隙率可控、药物释放持续、机械性能优异、结构稳定性好等有,可以搭载益生菌提高益生菌定植率和存活率,作为伤口敷料应用感染伤口的处理,具有重要临床应用价值。
有鉴于此,特提出本发明。
发明内容
针对现有技术中的缺陷,本发明提供一种搭载益生菌的透明质酸水凝胶及其制备方法和应用。
为了实现本发明的上述目的,特采用以下技术方案:
本发明提供了一种搭载益生菌的透明质酸水凝胶,所述透明质酸水凝胶主要由氨基化修饰的透明质酸或其衍生物,与与氧化多聚物,同时搭载岩藻多糖和益生菌,得到所述搭载益生菌的透明质酸水凝胶。
进一步地,所述氧化多聚物为PEG衍生物为醛基封端的星形多臂聚乙二醇和Pluronic F 127的一种或两种的混合物;
优选地,所述星形多臂聚乙二醇的臂数为2-8;
优选地,所述氧化多聚物为醛基封端的Pluronic F 127;
优选地,所述透明质酸的分子量为60-100万,所述Pluronic F 127的分子量不小于2000;
优选地,所述氨基化修饰的透明质酸包括己二酸二酰肼修饰的透明质酸。
进一步地,所述益生菌的搭载浓度为1×105~1×1010CFU/mL,优选为1×106~1×1010CFU/mL,更优选为1×107CFU/mL。
进一步地,所述益生菌包括乳杆菌、双歧杆菌、益生芽孢菌、酵母菌、丁酸梭菌或放线菌中的一种或多种。
本发明还提供了上述搭载益生菌的透明质酸水凝胶的制备方法,分别提供由氨基化修饰的透明质酸或其衍生物的溶液、PEG衍生物的溶液、岩藻多糖和益生菌,混合后得到所述搭载益生菌的透明质酸水凝胶。
进一步地,包括步骤:
S1、将透明质酸转化成己二酸二酰肼修饰的透明质酸衍生物HA-ADH;
S2、将Pluronic F127醛基化修饰,两末端加上CHO,得到PF127-CHO;
S3、分别将HA-ADH溶于PBS,得到预溶液;
S4、将益生菌用HA-ADH预溶液混悬得到预混溶液A;
S5、PF127-CHO与岩藻多糖溶于PBS得到预混合溶液B;
将步骤S4和S5中得到的两种预溶液混合得到所述搭载益生菌的透明质酸水凝胶;
优选地,所述HA-ADH溶液中HA-ADH重量百分含量为1%-5%;所述PF127-CHO溶液中PF127-CHO的重量百分含量为1%-20%;
优选地,所述PBS缓冲液的pH为7.4。
进一步地,所述HA-ADH的制备方法包括:
向透明质酸溶液中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑和己二酸二酰肼进行反应48-72h,然后将反应溶液分别在100mM NaCl水溶液、EtOH-H2O和纯水中透析55~65h、5~8h和5~8h,再将透析好的混合物离心,取上清得到所述HA-ADH;
所述透析的截留分子量为3500Da。
进一步地,所述PF127-CHO的制备方法包括:
惰性气体氛围下,向干燥的二氯甲烷溶剂中投入4-羧基苯甲醛、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、4-二甲氨基吡啶和Pluronic F127,在20-40℃下搅拌12-36h,过滤取固体,得到所述PF127-CHO;
优选地,所述Pluronic F127与所述4-羧基苯甲醛的摩尔比为1:(0.5-5);所述4-羧基苯甲醛、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和4-二甲氨基吡啶的摩尔比为2:2:1;
优选地,所述反应温度为37℃,反应时间为18-24h;
优选地,过滤后还包括洗涤固体的步骤,洗涤时,依次用1M HCl溶液、饱和NaHCO3溶液和饱和食盐水洗涤。
进一步地,步骤S4和S5中得到的预混溶液A和B按4:1的体积比混合得到搭载益生菌的透明质酸水凝胶。
此外,本发明还提供了上述的搭载益生菌的透明质酸水凝胶在制备感染皮肤伤口修复的产品中的应用。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
1、本发明提供的载益生菌的透明质酸水凝胶克服了单独水凝胶的生物惰性性质,给水凝胶体系赋予抗菌、抗炎、促进伤口修复,提供益生菌定植率和存活率等作用。
2、本发明提供的载益生菌的透明质酸水凝胶增强了原有透明质酸水凝胶的力学性能,具有良好的抗菌作用和促进伤口愈合作用。
3、本发明提供的负载益生菌的透明质酸水凝胶制备方法中,只需将益生菌、HA-ADH溶液与PF127-CHO溶液混合即可得到,该制备方法工艺简单、操作方便,适于大规模生产应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的搭载益生菌的透明质酸水凝胶成胶和红外光谱图;
图2为本发明实施例提供的搭载益生的菌透明质酸水凝胶电镜图;
图3、本发明实施例提供的搭载益生菌的透明质酸水凝胶溶胀比测试图和流变图;
图4为本发明实施例提供的搭载益生菌的益生菌释放特点;
图5为本发明实施例提供的搭载益生菌的透明质酸水凝胶自修复效果图;
图6为本发明实施例提供的搭载益生菌的透明质酸水凝胶的生物相容性实验结果图;
图7为本发明实施例提供的搭载益生菌的透明质酸水凝胶的抗菌作用结果图;
图8为本发明实施例提供的搭载益生菌的透明质酸水凝胶的铜绿假单胞菌感染的皮肤缺损模型中抗菌作用效果图;
图9为本发明实施例提供的搭载益生菌的透明质酸水凝胶的促进感染皮肤伤口修复效果图。
具体实施方式
除非本文另有定义,连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰,然而,在任何潜在不明确性的情况下,本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中,除非另有说明,“或”的使用意味着“和/或”。此外,术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。
一般地,连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明,本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知,且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行,所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
本发明通过乙酰化反应,用己二酸二酰肼修饰HA的羧酸基团,得到透明质酸-己二酰肼(HA-ADH)。HA-ADH和醛封端的Pluronic F127(PF127-CHO)在室或生理条件下通过醛基和胺基之间的希夫碱反应相互作用形成水凝胶(HP水凝胶)。该水凝胶有可注射性、自愈合性、优异的生物相容性等优点并可以搭载药物、细胞、益生菌和其他活性物质等适用于不同的应用。
本发明针对耐药菌感染的皮肤伤口缺损的治疗难的挑战,抗生素治疗有容易产生耐药性的问题。用透明质酸水凝胶搭载益生菌进行干预的方法,该搭载益生菌的水凝胶抑制耐药菌感染,促进上皮再化和胶原蛋白形成,加速耐药细菌感染的伤口修复。
根据本发明的一个方面,提供了一种搭载益生菌的透明质酸水凝胶,所述透明质酸水凝胶主要由氨基化修饰的透明质酸或其衍生物,与PEG衍生物共价交联并搭载岩藻多糖和益生菌得到;所述益生菌包括乳杆菌、双歧杆菌、益生芽孢菌、酵母菌、丁酸梭菌或放线菌中的一种或多种。
本发明提供的可注射型透明质酸水凝胶综合了各原料众多优良功能和生物活性,不仅不会导致自身的免疫排斥反应,而且作为细胞外基质分子网状结构的简单组成成分能够与结合蛋白、其他蛋白多糖以及生长因子等活性因子相互作用,促进创伤愈合及组织纤维化,调节炎症抑制瘢痕组织的形成。将上述透明质酸水凝胶搭载活性物质后,克服了单独水凝胶的生物惰性性质,提供水凝胶力学性能,同时给水凝胶保护和益生菌,提高益生菌的定植率和存活率,延长存活时间,复合水凝胶具有良好的抗菌、抗炎、促进伤口修复的作用。
在一些优选的实施方式中,所述氧化多聚物为PEG衍生物为醛基封端的星形多臂聚乙二醇和Pluronic F 127(PF127)中的一种或两种的混合物;
优选地,所述氧化多聚物为PF127-CHO,PF127-CHO的原料PF 127比其他多臂具乙二醇价格便宜,性质稳定。
优选地,所述透明质酸的分子量为60-100万,所述Pluronic F 127的分子量不小于2000。
在一些优选的实施方式中,所述氨基化修饰的透明质酸包括己二酸二酰肼修饰的透明质酸(HA-ADH);HA-ADH的合成原料便宜,合成方法简单。
在一些优选的实施方式中,所述益生菌的搭载浓度为1×105~1×1010CFU/mL,例如可以为,但不限于1×105CFU/mL、1×106CFU/mL、1×107CFU/mL、1×108CFU/mL、1×109CFU/mL或1×1010CFU/mL,优选为1×106~1×1010CFU/mL,更优选为1×107CFU/mL。
其中,所述益生菌可以选自乳杆菌、双歧杆菌、益生芽孢菌、酵母菌、丁酸梭菌或放线菌中的一种或多种,例如根据所需要的功能,选择其中的一种、两种或多种混合。
本发明提供的载益生菌的透明质酸水凝胶增强了原有透明质酸水凝胶的力学性能,具有良好的抗菌作用和促进伤口愈合作用。
根据本发明的第二个方面,还提供了上述可注射型透明质酸水凝胶的制备方法:分别提供由氨基化修饰的透明质酸或其衍生物的溶液、PEG衍生物的溶液、岩藻多糖和益生菌,混合后得到所述搭载益生菌的透明质酸水凝胶。该制备方法工艺简单、操作方便,适于大规模生产应用。
在一些具体的实施方式中,该制备方法可以包括如下步骤:
S1、将透明质酸转化成己二酸二酰肼修饰的透明质酸衍生物HA-ADH;
S2、将Pluronic F127醛基化修饰,两末端加上CHO,得到PF127-CHO;
S3、分别将HA-ADH溶于PBS,得到预溶液;
S4、将益生菌用HA-ADH预溶液混悬得到预混溶液A。
S5、PF127-CHO与岩藻多糖溶于PBS得到预混合溶液B。
将步骤S4和S5中得到的两种预溶液以一定比例混合得到所述搭载益生菌的透明质酸水凝胶;
需要说明的是,本实施方式中对S1和S2的顺序关系不做限定,即可以先做S1再做S2,或者先做S2再做S1,或者S1和S2同时进行。
其中,所述HA-ADH溶液中HA-ADH重量百分含量为1%-3%,例如可以为,但不限于1%、2%、3%、4%或5%,优选为1.5%-3%,更优选为2.5%。HA-ADH的浓度越高游离氨基越多,越有利于成胶,但是浓度越高粘稠度越高,操作不方便,2.5%的黏稠度适中,操作方便。
所述PF127-CHO溶液中PF127-CHO的重量百分含量为1%-20%,例如可以为,但不限于1%、3%、5%、8%、10%、12%、15%、18%或20%,优选为5%-15%,更优选为10%。PF127的浓度越高其游离醛基越多,越有利于成胶,但PF 127在溶液中可形成胶束,在特定温度下,达到临界胶束浓度后可发生相变,变成水凝胶。在常温下20%以内的PF127还未达到临界胶束浓度。选择10%的浓度是考虑到与上述2.5%的HA-ADH所形成的水凝胶理化性能和可注射性最佳。
作为优选,所述HA-ADH溶液与所述PF127-CHO体积比为9:1-1:9,例如可以为,但不限于9:0.5、9:1、6:1、3:1、1:1、1:3、1:6或1:9,优选为9:1-6:4。
当选择的溶剂为PBS时,所述PBS的pH为7.4。
本发明所用的氨基化透明质酸可以通过商业途径购买或合成得到。合成时,氨基化透明质酸的合成方法具体包括:
(1)HA溶于MES缓冲溶液(pH 5-7)中得到HA溶液,边搅拌边加1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)、1-羟基苯并三唑(HOBT)和己二酸二酰肼(ADH)进行反应48-72h。
(2)将反应液转移至透析袋(透析袋的截留分子量为3500Da)于100mM NaCl水溶液中透析60h,接着用EtOH-H2O(v/v 1:3)和纯水分别透析6h。最后将透析好的混合物离心,取上清液冻干得到HA-ADH。
本发明所用的醛基封端的星形多臂聚乙二醇可以通过商业途径购买或合成得到。合成时,Pluronic F 127醛基的合成方法具体包括:
(1)惰性气体氛围下,向干燥的溶剂中依次投入4-羧基苯甲醛、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和4-二甲氨基吡啶,然后加入0.5-5g Pluronic F 127,20-40℃下搅拌12-36h;
(2)过滤,洗涤固体,真空干燥得到类白色固体粉末,即得。
作为优选,所述Pluronic F127与所述4-羧基苯甲醛的摩尔比为1:(0.5-5),例如可以为,但不限于1:0.5、1:1、1:2、1:3、1:4或1:5;所述4-羧基苯甲醛、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和4-二甲氨基吡啶的摩尔比为2:2:1。
优选地,所述反应温度为37℃,反应时间为18-24h;
优选地,过滤后还包括洗涤固体的步骤,洗涤时,依次用1M HCl溶液、饱和NaHCO3溶液和饱和食盐水洗涤。
以PF-CHO的合成为例,其合成方法参照文献(Biomacromolecules,2011,12,2894–2901)。具体合成方法如下:在氮气保护下,将4-羧基苯甲醛1-乙基-3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶解于干燥的二氯甲烷中,然后加入PF-127。该体系在37℃下反应24h后,反应混合液依次用1M HCl、饱和NaHCO3和饱和食盐水洗涤,静置分离出的有机相后真空干燥得到类白色固体粉末。
氨基化修饰的透明质酸衍生物与醛基化的PF-127在生理温度下形成包含C=N双键的亚胺的水凝胶,该水凝胶具有可注射性,自修复性、良好的生物相容性,可载药物、细胞和益生菌等,特别是与透明质酸相比,大大提高其力学强度、体内外稳定性。PBS缓冲液为磷酸缓冲盐溶液。
在一些优选地实施方式中,所述活性物质为益生菌,所述制备方法包括将益生菌与HA-ADH溶液混合得到预混溶液A;将PF127-CHO与岩藻多糖溶于PBS中得到预混溶液B;预混溶液A和B溶液按4:1的体积比混合得到搭载益生菌的透明质酸水凝胶。
此外,基于本发明提供的搭载益生菌的透明质酸水凝胶的有益效果,本发明还提供了上述搭载益生菌的透明质酸水凝胶在感染皮肤伤口修复中的应用。
下面通过实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明,实施例中的材料为根据现有方法制备而得,或直接从市场上购得。
实施例1-3
本实施例提供了一种搭载活性物质的透明质酸水凝胶,通过如下方法制备得到:
S1、将透明质酸转化成己二酸二酰肼修饰的HA衍生物HA-ADH,将HA-ADH溶于PBS(pH 7.4)缓冲液中,配置得到2wt%的溶液。将L.rhamnosus分别按1×106,1×107,1×108CFU/mL浓度混悬于0.8毫升HA-ADH溶液混合。
S2、将Pluronic F127醛基化修饰,其两末端加上CHO,得到PF127-CHO。将100mgPF127-CHO与50mg岩藻多糖溶于1毫升PBS(pH 7.4)缓冲液中得到混合溶液。
S3、将步骤S1和步骤S2得到的溶液以4:1的体积混合得到含不同浓度益生菌的水凝胶。
其中,所述HA-ADH的制备方法包括:
(1)HA溶于MES缓冲溶液(pH 6)中得到HA溶液,边搅拌边加EDC、HOBT和ADH进行反应48-72h。
(2)将反应液转移至透析袋(透析袋的截留分子量为3500Da)于100mM NaCl水溶液中透析60h,接着用EtOH-H2O(v/v 1:3)和纯水分别透析6h。最后将透析好的混合物离心,取上清液冻干得到HA-ADH。
所述Pluronic F 127醛基的合成方法具体包括:
(1)氮气氛围下,向干燥的溶剂中依次投入4-羧基苯甲醛、EDCI和DMAP,然后加入2g Pluronic F 127,37℃下搅拌24h;所述Pluronic F127与所述4-羧基苯甲醛的摩尔比为1:2;所述4-羧基苯甲醛、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和4-二甲氨基吡啶的摩尔比为2:2:1;
(2)过滤,依次用1M HCl、饱和NaHCO3和饱和食盐水洗涤固体,真空干燥得到类白色固体粉末,即得。
(3)所述益生菌用MRS液体培养基扩增,8000rpm/min离心10分钟,并用PBS洗两次,得到益生菌。
实验例1益生菌水凝胶成胶性和红外鉴定
水凝胶成胶和可注射性如图1A/B所示。两种配制好的预溶液分别放入小玻璃瓶均有流动性,将两种溶液混合后,形成无流动性的水凝胶。采用FTIR(Thermo ScientificNicolet iN10)测得4000-400cm-1波数范围内的红外光谱进行鉴定,如图1C为PF127-CHO、HA-ADH和透明质酸基水凝胶(HP水凝胶)的红外图谱,发现当HA-ADH和PF127-CHO成胶后,PF-127-CHO在1720cm-1处的羰基伸缩振动峰消失,而在1643cm-1位置为出现了新的峰,这说明,二者混合生成了亚胺键,消耗了醛基,导致羰基峰消失。从图1D中,FD图谱中在1215–1159和828cm-1处显示硫酸盐S=O不对称拉伸和C-O-S拉伸出特征峰。载岩藻多糖的透明质酸基水凝胶(HPF水凝胶)的光谱包括HP水凝胶和FD的所有特征峰。本发明实施例2提供的载益生菌和盐藻多糖的水凝胶(HPF@L.rha水凝胶)的光谱与HPF水凝胶的光谱没有差异,这表明益生菌的添加不会影响水凝胶的化学特征。
实验例2益生菌水凝胶的表征鉴定
如图2A-E所示,两种样品均呈现相互连接的多孔结构,分布相对均匀,在高放大倍率视场下,在HPF样品上观察到光滑的形貌(图2B),而在HPF@L.rha水凝胶上观察到粗糙的表面。此外,益生菌均匀地分布在HPF水凝胶中。与正常培养条件下的益生菌相比(图2C),水凝胶搭载不影响益生菌的形态,菌表现出杆状形状(图2F)。
实验例3益生菌水凝胶的溶胀比测定
采用称重法测定水凝胶的溶胀比。水凝胶称重,作为初始重量。在室温条件下,将水凝胶样品浸入PBS(pH=7.4,0.01M)。在指定的时间间隔,用滤纸除去溶胀水凝胶中多余的液体,称重。溶胀百分比(SR%)用以下公式计算:SR%=(Ws-Wi)/Wi*100%,其中Wi和Ws分别代表初始重量和溶胀后重量。如图3A所示,所有组水凝胶均表现出快速的液体吸收,其体积在初始阶段迅速增长,并在24h时达到平衡膨胀并保持其完整性。HPF、实施例1-3提供的含不同浓度益生菌的水凝胶(HPF@L.rha1、HPF@L.rha2和HPF@L.rha3)的平衡膨胀比分别为99.6±8.91%,98.24±3.15%,99.70±4.76%和97.83±3.38%(图3B)。此结果表明,HPF@L.rha水凝胶敷料具有良好的溶胀性能,益生菌的包封不影响溶胀性能和水凝胶的溶胀性能。水凝胶的溶胀特性和体积生长速率对于吸收伤口渗出物加速伤口愈合、止血作用以及有利于组织整合至关重要。
实验例4益生菌水凝胶流变学分析
利用Anton Paar(MCR301)高速旋转流变仪检测本发明实施例制备得到的可注射型水凝胶的流变性能。在37℃条件下,直径为25mm平行板上原位成胶进行测定。(1)在1%的恒定应变和10rad/s的频率,通过时间扫描试验测量水凝胶的凝胶动力学特性。(2)在1%应变下,振幅扫描测定水凝胶的存储模量(G′)和损耗模量(G″)。HPF、HPF@L.rha2和HPF@L.rha3水凝胶的G′和G″曲线在两种前体混合后分别相交150、100和50s,表明益生菌的掺入显著加速了水凝胶的成胶时间。G′和G″的初始值在所有组中都非常低,并逐渐增加以获得稳定期。随着益生菌含量从0增加到1×108CFU/mL,G′的平衡值从268±22增加到742±31Pa,这表明益生菌的添加以剂量依赖性的方式增强水凝胶的弹性模量。此外,还进行了频率扫描测量研究水凝胶对外部菌株的响应行为。如图3D所示,当频率从0.1增加到100时,G′值仍然高于G″值,并且所有组中的G′和G″值都保持稳定,这表明益生菌水凝胶有非常稳定的机械性能。水凝胶的优良机械性能可以支持底物保持组织完整性,在运动过程中保护伤口,还可以将生物物理线索转化为生物化学反应,调节组织再生的细胞行为(Science,2009,326(5957):1216-1219;Chemical Reviews 2021,121:4561–4677).重要的是,具有适当力学性质的水凝胶可以刺激角质形成细胞增殖/迁移,血管生成和再上皮化,细胞外基质合成和重塑,从而促进伤口闭合(Journal of Materials Chemistry B,2017,5(17):3172-3185)。已报道的研究表明,小于1200Pa压缩应力的水凝胶敷料通过增强伤口闭合,加速肉芽组织形成,增加胶原沉积和改善新血管形成,表现出比4800Pa水凝胶敷料更好的伤口愈合效率(Journalof Materials Chemistry B,2019,7(10):1697-1707)。益生菌的加入提高了透明质酸水凝胶的稳定性,且益生菌水凝胶压缩应力(268至742Pa)仍处在文献报道的伤口辅料的合适机械性能范围内,说明本益生菌水凝胶有较好的作为伤口辅料的潜能。
实验例5益生菌的释放特点
将实施例2提供的透明质酸水凝胶浸入10mL PBS中,放37℃的摇床在预定的时间间隔内,取100μL周围培养基用酶标仪检测600nm处的光密度(OD)。根据释放介质中益生菌量占全部封装细菌量的百分比来计算益生菌的释放率。结果如图5所示,140小时之后30%的益生菌从水凝胶中释放出来并且释放的益生菌在MRS琼脂培养保持其良好的生长能力。此结果表明水凝胶搭载益生菌后能有效避免了益生菌从水凝胶中逸出,使益生菌集中在所应用部位并能较长时间保持益生菌的活性。
实验例6益生菌水凝胶的自修复性能
为了探究本发明水凝胶的自修复性能,本实验例将预溶液用A和B两种不同水溶性染料染色,制备厚度为5mm的两种不同颜色的R型水凝胶。用手术刀片将样品分别对称切成两半,将不同颜色的水凝胶切面拼在一起。结果发现,在不受外界刺激的情况下,10min后不同颜色的水凝胶能重新合成完整的R型,且修复后的水凝胶强度可以用镊子提起(图5A)。利用旋转流变仪在10rad/s的振幅下,震荡应力在1%和400%之间交替,扫描1000s,对水凝胶的自修复性能做了进一步研究。结果如(图5B),结果表明400%高应变力能够破坏水凝胶网络结构,而在1%低应变下,G′值迅速恢复初始值。经过多次破坏和自修复,该水凝胶扔能表现出原有的结构性能,说明水凝胶通过共价键再连接又恢复了正常结构。
实验例7可注射型水凝胶的生物相容性评价
本实验例使用细胞与水凝胶浸提液共培养的方法测定水凝胶的细胞相容性。水凝胶含10%FBS HG-DMEM培养基浸泡24h后浸提液过0.22μm的膜过滤除菌。L929细胞采用含10%FBS和1%青霉素链霉素的HG-DMEM完全培养基,在37℃、5%CO2条件下进行培养。细胞接种于密度为1×104个细胞/孔的24孔板中,培养24h后换水凝胶浸提液。培养24h后用罗丹明酚固定法观察水凝胶对细胞形态和细胞骨架的影响。共培养24h后,在室温下用4%多聚甲醛固定于PBS(Solarbio,China)中20min,然后用0.5%tritonx-100(Sigma-Aldrich)溶液渗透3min,在PBS溶液中加入5%BSA,阻断非特异性结合。最后,用DAPI和罗丹明-鬼笔环肽(Solarbio)对细胞进行染色。图像采用20倍放大的荧光显微镜(Nikon a1mp,日本)拍摄。(2)培养1,3天后CCK-8法检测细胞增殖活力。每孔加入400μL培养基和40μL CCK-8试剂。在37℃孵育1小时后,将每个孔中200μL的培养基转移到96孔板中,用(SynergyH1/H1M,中国生物科技公司)在450nm处测量光密度(OD)。图6A显示HPF组、HPF@L.rha1组、HPF@L.rha2组和HP@L.rha2组的细胞呈典型的纺锤形。与空白对照相比,HPF@L.rha1和HPF@L.rha2样品的细胞密度、扩展面积和延伸率没有显著差异。然而,HPF@L.rha3组的细胞呈现出相对圆形的形状。细胞扩张面积和伸长均小于其他各组,但细胞数量无明显减少。如图6B所示,细胞培养1d后,各组细胞存活率均大于99%。细胞培养3d后,HPF组、HPF@L.rha1组、HPF@L.rha2组、HP@L.rha2组细胞活力分别为99.2±6.6%、97.7±10.8%、109.96±3.5%、112.3±3.1%,显著高于HPF@L.rha3组(75.8±1.9%)。结果表明,含小于1×107CFU/mL益生菌的HPF@L.rha水凝胶具有良好的细胞相容性。
本实验例通过溶血实验测定水凝胶血液相容性。取小鼠外周血,用生理盐水稀释至0.17%(v/v)。将15mg冻干样品加入稀释的血液(1mL)中,在37℃下孵育1h。然后在2000rpm/min转速条件下离心5min,取200μL上清,用酶标仪(SynergyH1/H1M,Bio-Tek,China)测定545nm下的吸光度值。以蒸馏水处理组为阳性对照(100%溶血),未经处理的生理盐水稀释组为阴性对照。溶血率(HR,%)采用以下公式计算:HR(%)=(Ds-Dn)/(Ds-Dp)×100,其中Ds、Dn和Dp分别是样品、标准碱和蒸馏水的吸光度。结果如图7(A)三种胶HR(%)均小于2%,所有样品组均无发生溶血现象。
实验例8益生菌水凝胶抗菌性能
采用菌落形成单元(CFU)计数法测定水凝胶的抑菌活性。将P.aeruginosa在TSB液体培养基中37℃培养12h,将菌悬液稀释至1×106CFU/mL,然后将菌悬液与200μL水凝胶共培养2mL,37℃培养12h。每个培养管将菌液稀释1×104次,将20μL稀释后的菌悬液均匀涂于TSB琼脂培养基上。在37℃孵育24h后,计数CFU数量,计算抑制率:
抗菌率(%)="(Ic"-"Is)/Ic"×100%(2)
式中,Is为水凝胶样品的菌落数,Ic为对照菌的菌落总数。
如图7A/B所示,与对照组和HPF组相比,益生菌负载水凝胶组对铜绿假单胞菌表现出更好的抗菌活性。抗菌效果与益生菌的浓度密切相关。HPF@L.rha1组仍有菌落出现,而HPF@L.rha2组和HPF@L.rha3组培养皿中几乎没有菌落出现。结果表明,益生菌浓度大于1×107CFU/mL的水凝胶具有良好的抗菌性能。此外,在大鼠模型中使用铜绿假单胞菌感染的全层皮肤伤口进行体内抗菌作用,并使用CFU方法定量铜绿假单胞菌的数量。发现HPF组中铜绿假单胞菌菌落的数量比对照组少。与HPF组相比,L.rha组的菌落数量大大减少。重要的是,HPF@L.rha2组的抗菌率显著高于L.rha组和HPF组,与商用凝胶相当(图8A/B)。
实验例9可注射型水凝胶作为益生菌载体用于感染伤口的修复
将按4:1混合透明质酸水凝胶作为益生菌(Lactobacillus rhamnosu,简称L.rha)的载体,作为伤口敷料用于铜绿假单胞菌感染的皮肤缺损模型的治疗。如图9所示,在大鼠模型中,与未治疗组和单独水凝胶组相比,载益生菌的水凝胶组显著抑制了伤口感染和伤口炎症,并促进了伤口愈合速度,修复的组织有毛囊、血管的正常皮肤结构。
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.搭载益生菌的透明质酸水凝胶,其特征在于,所述透明质酸水凝胶主要由氨基化修饰的透明质酸或其衍生物,与氧化多聚物共价交联,同时搭载岩藻多糖和益生菌,得到所述搭载益生菌的透明质酸水凝胶。
2.据权利要求1所述的搭载益生菌的透明质酸水凝胶,其特征在于,所述氧化多聚物为PEG衍生物为醛基封端的星形多臂聚乙二醇和Pluronic F 127的一种或两种的混合物;
优选地,所述星形多臂聚乙二醇的臂数为2-8;
优选地,所述氧化多聚物为醛基封端的Pluronic F 127;
优选地,所述透明质酸的分子量为60-100万,所述Pluronic F 127的分子量不小于2000;
优选地,所述氨基化修饰的透明质酸包括己二酸二酰肼修饰的透明质酸。
3.据权利要求1所述的搭载益生菌的透明质酸水凝胶,其特征在于,所述益生菌的搭载浓度为1×105~1×1010CFU/mL,优选为1×106~1×1010CFU/mL,更优选为1×107CFU/mL。
4.据权利要求1所述的搭载益生菌的透明质酸水凝胶,其特征在于,所述益生菌包括乳杆菌、双歧杆菌、益生芽孢菌、酵母菌、丁酸梭菌或放线菌中的一种或多种。
5.根据权利要求1-4任一项所述的搭载益生菌的透明质酸水凝胶的制备方法,其特征在于,分别提供由氨基化修饰的透明质酸或其衍生物的溶液、氧化多聚物的溶液、岩藻多糖和益生菌,混合后得到所述搭载益生菌的透明质酸水凝胶。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,包括步骤:
S1、将透明质酸转化成己二酸二酰肼修饰的透明质酸衍生物HA-ADH;
S2、将Pluronic F127醛基化修饰,两末端加上CHO,得到PF127-CHO;
S3、分别将HA-ADH溶于PBS,得到预溶液;
S4、将益生菌用HA-ADH预溶液混悬得到预混溶液A;
S5、PF127-CHO与岩藻多糖溶于PBS得到预混合溶液B;
将步骤S4和S5中得到的两种预溶液混合得到所述搭载益生菌的透明质酸水凝胶;
优选地,所述HA-ADH溶液中HA-ADH重量百分含量为1%-5%;所述PF127-CHO溶液中PF127-CHO的重量百分含量为1%-20%;
优选地,所述PBS缓冲液的pH为7.4。
7.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,所述HA-ADH的制备方法包括:
向透明质酸溶液中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑和己二酸二酰肼进行反应48-72h,然后将反应溶液分别在100mM NaCl水溶液、EtOH-H2O和纯水中透析55~65h、5~8h和5~8h,再将透析好的混合物离心,取上清得到所述HA-ADH;
所述透析的截留分子量为3500Da。
8.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,所述PF127-CHO的制备方法包括:
惰性气体氛围下,向干燥的二氯甲烷溶剂中投入4-羧基苯甲醛、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、4-二甲氨基吡啶和Pluronic F127,在20-40℃下搅拌12-36h,过滤取固体,得到所述PF127-CHO;
优选地,所述Pluronic F127与所述4-羧基苯甲醛的摩尔比为1:(0.5-5);所述4-羧基苯甲醛、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和4-二甲氨基吡啶的摩尔比为2:2:1;
优选地,所述反应温度为37℃,反应时间为18-24h;
优选地,过滤后还包括洗涤固体的步骤,洗涤时,依次用1M HCl溶液、饱和NaHCO3溶液和饱和食盐水洗涤。
9.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,步骤S4和S5中得到的预混溶液A和B按4:1的体积比混合得到搭载益生菌的透明质酸水凝胶。
10.权利要求1-4任一项所述的搭载益生菌的透明质酸水凝胶在制备感染皮肤伤口修复的产品中的应用。
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