CN112494713A - 一种益生菌结合氧化白及多糖-壳聚糖复合水凝胶及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种益生菌结合氧化白及多糖‑壳聚糖复合水凝胶及其制备方法和用途，属于生物医用材料领域。该复合水凝胶是益生菌、氧化白及多糖溶液和壳聚糖溶液混合后经过交联反应而得；所述氧化白及多糖是白及多糖被氧化剂氧化后而得。该水凝胶具有良好的力学性能和生物相容性，对肝肾无毒副作用，其三维多孔网状结构，有利于吸收伤口多余渗液，防止伤口感染，并为创面愈合过程提供良好的湿润环境；同时，该水凝胶pH值呈弱酸性，更有利于伤口的保护和愈合；此外该水凝胶抗菌性能优异，对创面修复效果极佳。本发明复合植物乳杆菌的氧化白及多糖‑壳聚糖复合水凝胶在临床创面修复上具有良好的应用前景，有望发展成为一种有潜力的创面敷料。

Description

一种益生菌结合氧化白及多糖-壳聚糖复合水凝胶及其制备 方法和用途
技术领域
本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种益生菌结合氧化白及多糖- 壳聚糖复合水凝胶及其制备方法和用途。
背景技术
伤口感染一般会导致伤口愈合时间延长，并可能形成慢性、无法愈合的 伤口，使患者面临巨大的健康风险。目前，伤口护理敷料多强调将抗生素或 Ag+等抗菌化合物添加到伤口敷料中。遗憾的是，因其产生细菌耐药性，细 胞毒性等问题阻碍其发展。因此，不依赖于常用抗菌药物的替代疗法在创面 治疗中变得越来越重要。
益生菌是对宿主有正面效益的微生物，近年来益生菌和益生元在医疗上 的使用迅速增加，证实了其极好的安全性。目前研究表明，益生菌在伤口的 愈合过程起着积极作用。其中，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)通过 产生具有抗菌活性的乳酸和细菌素，抑制金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等 病原微生物的增殖，可能作为抗生素和Ag+类产品的替代治疗，有望为创面 抗菌寻找新的解决途径。然而，在使用过程中益生菌必须承受温度、湿度、 酶、pH等多种环境压力。水凝胶伤口敷料作为一种载体，能为益生菌细胞提 供物理屏障，提高益生菌的存活率。
因此，找到一种合适的水凝胶伤口敷料作为载体，载益生菌用于伤口愈 合具有重要的临床意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种益生菌结合氧化白及多糖-壳聚糖复合水凝胶 及其制备方法和用途。
本发明提供了一种益生菌结合氧化白及多糖-壳聚糖复合水凝胶，它是益 生菌、氧化白及多糖溶液和壳聚糖溶液混合后经过交联反应而得；
所述氧化白及多糖是白及多糖被氧化剂氧化后而得。
进一步地，所述益生菌为益生菌菌液；
优选地，所述益生菌菌液的浓度为1.0×1010～9.0×1010CFU/mL；
更优选地，所述益生菌为植物乳杆菌。
进一步地，所述氧化白及多糖溶液的浓度为1～5wt％；和/或，所述壳聚 糖溶液的浓度为1～5wt％；
优选地，所述氧化白及多糖溶液的浓度为2.0wt％；和/或，所述壳聚糖 溶液的浓度为1.5wt％；
更优选地，所述氧化白及多糖溶液为氧化白及多糖水溶液；和/或，所述 壳聚糖溶液为壳聚糖水溶液。
进一步地，所述氧化白及多糖溶液和壳聚糖溶液的质量比为(1～5)： (1～5)；
和/或，所述氧化白及多糖溶液和益生菌菌液的体积比为(5～10)：1；
优选地，所述氧化白及多糖溶液和壳聚糖溶液的质量比为1:1；
和/或，所述氧化白及多糖溶液和益生菌菌液的体积比为5:1。
进一步地，所述交联反应为30～50℃反应1～5h；
优选地，所述交联反应为45～48℃反应4h；
更优选地，所述交联反应在搅拌下进行，搅拌速度为100～200rpm。
进一步地，所述氧化剂和白及多糖结构单元摩尔比为0.23；
优选地，所述氧化剂为高碘酸钠。
进一步地，所述白及多糖被氧化剂氧化的条件为避光条件下室温搅拌反 应24～48h，反应后加入乙二醇终止反应；
优选地，所述氧化后的反应液透析、干燥，得到氧化白及多糖；
更优选地，所述透析为用截止分子量为3000～5000Da的透析袋在去离子 水中透析3天；和/或，所述干燥为冷冻干燥。
进一步地，所述白及多糖通过下述方法制备得到：
(1)取白及块茎，粉碎、过筛，用石油醚脱脂，再使用乙醇回流提取， 将提取液过滤，取滤饼，干燥，得预处理干粉；
(2)预处理干粉用水提取，提取后过滤，将提取液浓缩，脱去蛋白，收 集水层，浓缩水层，得浓缩液；
(3)将乙醇加入浓缩液中，以达到70％的体积分数，4℃过夜，沉淀多糖；
(4)将沉淀物干燥，得粗白及多糖；
(5)将粗白及多糖纯化，即得白及多糖；
优选地，
步骤(1)中，所述白及块茎为干燥白及块茎；
和/或，步骤(1)中，所述脱脂的温度为60-90℃；
和/或，步骤(1)中，所述乙醇为95％乙醇；
和/或，步骤(1)中，所述回流提取为70℃回流提取2～3次，每次1～3h；
和/或，步骤(1)中，所述白及和乙醇的质量体积比为1g：(10～50)mL；
和/或，步骤(2)中，所述预处理干粉和水按的固液比为1g：(40～100) mL；
和/或，步骤(2)中，所述提取次数为1～3次；
和/或，步骤(2)中，所述提取条件为70℃搅拌提取1～3h；
和/或，步骤(2)中，所述脱去蛋白为采用Sevage法脱去蛋白；
和/或，步骤(3)中，所述乙醇为95％乙醇；
和/或，步骤(4)中，所述干燥为45℃真空干燥；
和/或，步骤(5)中，所述纯化为将粗白及多糖过DEAE-cellulose-52柱；
更优选地，
和/或，步骤(1)中，所述回流提取为70℃回流提取2次，每次2h；
和/或，步骤(1)中，所述白及和乙醇的质量体积比为1g：10mL；
和/或，步骤(2)中，所述预处理干粉和水按的固液比为1g：40～100mL；
和/或，步骤(2)中，所述提取次数为3次；
和/或，步骤(2)中，所述提取条件为70℃搅拌提取2h。
本发明还提供了一种前述的复合水凝胶的制备方法，它包括如下步骤： 将益生菌、白及多糖溶液和壳聚糖溶液混合后交联，即得；
优选地，
所述益生菌为益生菌菌液；
和/或，所述氧化白及多糖溶液为氧化白及多糖水溶液；
和/或，所述壳聚糖溶液为壳聚糖水溶液；
和/或，所述交联反应为30～50℃反应1～5h；
更优选地，
所述益生菌菌液的浓度为1.0×1010～9.0×1010CFU/mL；
和/或，所述交联反应为48℃反应4h；
进一步优选地，所述益生菌为植物乳杆菌；
和/或，所述交联反应再搅拌下进行，搅拌速度为100～200rpm。
本发明还提供了前述的复合水凝胶在制备抗菌的材料中的用途；
优选地，所述材料为生物医用材料；和/或，所述抗菌材料为抑制革兰氏 阳性菌和/或革兰氏阴性菌的材料；
更优选地，所述材料为促进创面愈合的材料；和/或，所述革兰氏阳性菌 为金黄色葡萄球菌；和/或，所述革兰氏阴性菌为铜绿假单胞菌、大肠杆菌；
进一步优选地，所述材料为创面敷料。
本发明中室温为25±5℃；过夜为12±2h。
本发明白及多糖除使用本发明所述方法制备得到，还可以是市售白及多 糖，纯度为40％左右。
本发明益生菌结合氧化白及多糖-壳聚糖复合水凝胶具有如下有益效果：
(1)本发明复合植物乳杆菌的氧化白及多糖-壳聚糖复合水凝胶具有三维 多孔网状结构，有利于吸收多余渗液，防止伤口感染，并储存大量的水分， 为创面愈合过程提供良好的湿润环境；
(2)本发明复合植物乳杆菌的氧化白及多糖-壳聚糖复合水凝胶具有良好 的力学性能，韧性佳，更利于使用；
(3)本发明复合植物乳杆菌的氧化白及多糖-壳聚糖复合水凝胶pH值呈 弱酸性，更有利于伤口的有效保护和愈合；
(4)本发明复合植物乳杆菌的氧化白及多糖-壳聚糖复合水凝胶具有优异 的抗菌性能，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有显著抑制作用，效果显著 优于未复合植物乳杆菌的氧化白及多糖-壳聚糖复合水凝胶；同时，该水凝胶 对革兰氏阳性菌的抑菌作用强于革兰氏阴性菌；
(5)本发明复合植物乳杆菌的氧化白及多糖-壳聚糖复合水凝胶对细胞无 毒，具有良好的生物相容性；
(6)本发明复合植物乳杆菌的氧化白及多糖-壳聚糖复合水凝胶确实对伤 口愈合具有优异的效果，治疗3天后创面干燥，疤痕明显，治疗7天后创面 闭合率显著优于未复合植物乳杆菌的氧化白及多糖-壳聚糖复合水凝胶，治疗 14天后创面完全愈合；
(7)本发明复合植物乳杆菌的氧化白及多糖-壳聚糖复合水凝胶无肝肾毒 性。
总之，本发明复合植物乳杆菌的氧化白及多糖-壳聚糖复合水凝胶具有良 好的力学性能和良好的生物相容性，对肝肾无毒副作用，其三维多孔网状结 构，有利于吸收多余渗液，防止伤口感染，并储存大量的水分，为创面愈合 过程提供良好的湿润环境；同时，该复合水凝胶pH值呈弱酸性，与正常健 康皮肤的pH值相近，更有利于伤口的保护和愈合；此外该复合水凝胶抗菌 性能优异，对创面修复效果极佳，能在短时间内促进创面愈合，具体协同增 效作用。本发明复合植物乳杆菌的氧化白及多糖-壳聚糖复合水凝胶在临床创 面修复上具有良好的应用前景，有望发展成为一种有潜力的创面敷料。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段， 在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、 替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步 的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。 凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为红外光谱图和核磁共振氢谱图：A为BSP、OBSP和CS的红外光 谱图；B为OBSP-CS水凝胶和OBSP-CS-LP水凝胶的红外光谱图；C为BSP 和OBSP的核磁共振氢谱图。
图2为各组水凝胶的SEM显微照片：A为OBSP-CS水凝胶的SEM显 微照片；B为OBSP-CS-LP水凝胶的SEM显微照片。
图3为各组水凝胶的溶胀率结果，图中a为在PBS中OBSP-CS-LP水凝 胶的溶胀率，b为去离子水中OBSP-CS-LP水凝胶的溶胀率，c为PBS中 OBSP-CS水凝胶的溶胀率，d为去离子水中OBSP-CS水凝胶的溶胀率。
图4为PBS中OBSP-CS水凝胶和OBSP-CS-LP水凝胶的pH值。
图5为OBSP-CS水凝胶与OBSP-CS-LP水凝胶对各细菌的抑制率。
图6为OBSP-CS-LP水凝胶对L929小鼠成纤维细胞的存活率影响。
图7为创伤后1、3、7、14天小鼠背部创面图像：图中i为空白组；ii 为OBSP-CS水凝胶组；iii为OBSP-CS-LP水凝胶组。
图8为创伤后1、3、7、14天小鼠背部创面闭合率：图中i为空白组； ii为OBSP-CS水凝胶组；iii为OBSP-CS-LP水凝胶组。
图9为创伤后3、7、14天创面组织染色图像，图中i为空白组，ii为 OBSP-CS水凝胶组，iii为OBSP-CS-LP水凝胶组：a为H&E染色图；b为 Masson三色染色图。
图10为创伤后14天肝脏和肾脏的H&E染色图：图中i为空白组；ii为 OBSP-CS水凝胶组；iii为OBSP-CS-LP水凝胶组。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售 产品获得。
实施例1、本发明益生菌结合氧化白及多糖-壳聚糖复合水凝胶的制备 一、白及多糖的提取、分离和纯化
白及多糖(BSP)根据文献(Qu Y,等.Optimization of infrared-assistedextraction of Bletilla striata polysaccharides based on response surfacemethodology and their antioxidant activities.Carbohydrate Polymers,2016,148:345-353.)所述的方法制得。具体制备方法如下：
将干燥的白及块茎粉碎，过筛，用石油醚脱脂(温度为60-90℃)，再使 用乙醇(每克粉末使用10mL 95％乙醇)在70℃回流2次，每次2h，最后过 滤，将滤饼干燥，得到预处理干粉。将预处理后的干粉和水按固液比1:40 (g/mL)加入烧杯中，70℃搅拌提取2h后过滤，滤渣按照上述提取方法(70℃ 搅拌提取2h)提取两次，合并提取液后浓缩。采用Sevage法脱去蛋白，收 集水层，浓缩水层并挥发有机试剂，冷却，得浓缩液。然后将一定体积的乙 醇(95％)缓慢加入到浓缩液中，以达到70％的体积分数，沉淀多糖，4℃过 夜。收集沉淀物并于45℃真空干燥，得到粗BSP。取粗BSP溶解在蒸馏水 中，过DEAE-cellulose-52柱获得纯化后的BSP产物。
二、白及多糖的氧化
BSP氧化具体氧化方法如下：
将BSP完全溶解于去离子水中，得到浓度为4wt％的BSP溶液，在溶液 中加入氧化剂高碘酸钠(NaIO4与BSP结构单元摩尔比为0.23)，避光，室温 下搅拌24h，加入乙二醇终止反应，混合溶液用截止分子量为3000～5000Da 的透析袋在去离子水中透析3天，冷冻干燥，并通过碘量法估计氧化程度， 即得到氧化度40％的氧化白及多糖(OBSP)。
三、益生菌结合氧化白及多糖-壳聚糖复合水凝胶的制备
无菌操作条件下，将保存在冻干管中的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarumSICC 1.1077)接种至斜面培养基上复苏，37℃培养24h后转接1 次，挑单菌落接种至100mLMRS肉汤液体培养基，37℃、130rpm/min摇床 培养过夜，4℃下保存备用。取扩增后的菌液，3000rpm离心5min，沉淀用 无菌PBS洗涤，将洗过的细菌重悬于PBS中，备用，使菌液浓度约为1.0× 1010CFU/mL。
复合植物乳杆菌的氧化白及多糖-壳聚糖复合水凝胶的制备方法如下：
用超纯水分别配制OBSP溶液(浓度为2wt％)和壳聚糖(CS)溶液(浓 度为1.5wt％)，将所配制的溶液灭菌(121℃，15min)。待溶液冷却后，将 OBSP溶液、CS溶液和植物乳杆菌菌液混合(OBSP溶液和CS溶液的质量 比为1:1；植物乳杆菌菌液和OBSP溶液的体积比为1：5)，在45～48℃、200rpm 混合搅拌反应4h，即得复合植物乳杆菌的氧化白及多糖-壳聚糖复合水凝胶 (OBSP-CS-LP水凝胶)，密封放置在4℃冰箱中保存。
对比例1、氧化白及多糖-壳聚糖复合水凝胶的制备
用超纯水分别配制OBSP溶液(浓度为2wt％)和CS溶液(浓度为 1.5wt％)。灭菌后，OBSP溶液和CS溶液按质量比1:1，在45～48℃、200rpm 混合搅拌反应4h，即得氧化白及多糖-壳聚糖复合水凝胶(OBSP-CS水凝胶)， 密封放置在4℃冰箱中保存。
以下通过具体的试验例证明本发明的有益效果。
数据采用IBM SPSS Statistics(22.0)统计软件进行数据分析。结果均符 合正态分布，以平均值±标准差
Figure BDA0002693247420000061
表示，组间采用完全随机设计资料 单因素方差分析(ANOVA)，p<0.05为差异有统计学意义。
试验例1、理化性质的表征
一、红外光谱分析
1、试验方法
取原料壳聚糖(CS)、实施例1制备的原料白及多糖(BSP)、氧化白及 多糖(OBSP)、实施例1复合植物乳杆菌的氧化白及多糖-壳聚糖复合水凝胶 (OBSP-CS-LP水凝胶)、对比例1制备的氧化白及多糖-壳聚糖复合水凝胶 (OBSP-CS)，使用配备衰减全反射的傅里叶变换红外光谱仪(ATR-FTIR， Agilent cary-610)进行分析。CS、BSP、OBSP用压片法分析，OBSP-CS-LP、 OBSP-CS由衰减全反射红外光谱(ATR-FTIR)进行表征。
2、试验结果
图1A为CS、BSP和OBSP的红外光谱图。图1A显示BSP以及OBSP 均在波数400-4000cm-1处具有多糖类物质的特征吸收峰，波数3409.52cm-1处长而宽的吸收峰是多糖的羟基O-H伸缩振动峰，波数2923.82cm-1的弱吸 收峰是C-H的伸缩振动峰，波数1153.23cm-1、1078.08cm-1、和1029.82cm-1表明有吡喃糖的存在。此外，在879.38cm-1和810.02cm-1处的波峰也显示 出甘露糖的吸收。对于CS，位于1658.42cm-1和1602.25cm-1的两个特征峰归 因于-NH2基团的存在。与未修饰的BSP相比，OBSP于1727.35cm-1处出现 加强的羰基(C＝O)伸缩振动吸收峰，此峰表明BSP经氧化后其分子上的部 分羟基变为醛基。
图1B为OBSP-CS-LP和OBSP-CS的红外光谱图，图1B显示，1730.35cm-1处的醛对称振动带的消失和1628.37cm-1处出现的C＝N键，说明氧化白及多 糖的-CHO基团和壳聚糖的-NH2基团之间发生缩水聚合反应，即生成Schiff 碱，说明水凝胶交联反应成功。
二、核磁共振氢谱分析
1、试验方法
取实施例1制备的原料白及多糖(BSP)和氧化白及多糖(OBSP)，使 用核磁共振波谱仪(AVANCE III HD)进行分析。将干燥样品BSP、OBSP 与重水(D2O)进行3次冻干交换，在核磁管中溶解处理后的样品大约500μL， 然后用核磁共振波谱仪分别得到BSP、OBSP的1H-NMR核磁共振图谱。
2、试验结果
BSP和OBSP的1H-NMR图谱如图1C所示。大部分质子信号出现在 δ3.5-5.5ppm范围内，这是典型的多糖信号。在δ5.0ppm左右两边均有信号， 说明α、β两种构型的糖苷键同时存在。δ3.0-4.3是糖环的化学位移信号， δ2.1ppm附近的峰为乙酰基的甲基质子信号，表明多糖有部分被乙酰基取代。 比较BSP和OBSP的1H-NMR谱，OBSP在δ9.2ppm处出现了一个新的低强 度的峰，对应于OBSP中氧化得到的醛基，说明氧化成功。δ4.7ppm为溶剂 D2O峰。这些结果与红外光谱分析结果一致。
三、扫描电子显微镜分析
1、试验方法
采用扫描电子显微镜SEM(SEM,Hitachi SU3500,Japan)对样品横截面 进行形态学研究。将对比例1和实施例1制备的OBSP-CS、OBSP-CS-LP水 凝胶冷冻干燥，再经液氮冷冻破碎，断裂面喷金处理，转移到扫描电镜样品 台上观察拍摄。
2、试验结果
利用扫描电子显微镜(SEM)观察OBSP-CS和OBSP-CS-LP水凝胶样 品的微观结构。从图2中可以看出，各凝胶样品都具有三维多孔结构，这种 特殊的内部结构有利于吸收多余渗液，防止伤口感染并储存大量的水分，为 创面愈合过程提供良好的湿润环境。对比两种凝胶发现，OBSP-CS-LP水凝 胶较OBSP-CS水凝胶有更大的孔径。OBSP-CS-LP更加利于吸收多余渗液， 防止伤口感染，同时储存更多的水分，更有利于创面愈合。
试验例2、溶胀率测试
1、试验方法
溶胀程度可用水凝胶的吸水率来表示。将对比例1和实施例1制备的 OBSP-CS、OBSP-CS-LP水凝胶在真空烘箱中干燥至恒重，称重(Wd)后， 分别于室温放入去离子水以及37℃下放入PBS缓冲溶液中浸泡，规定时间 间隔后取出，用滤纸快速擦拭表面多余的液体，称定重量(Ws)。溶胀率 (Swelling Rate，SR)计算公式如下：
Figure BDA0002693247420000081
式中，Ws为膨胀试样在t时刻的重量；Wd为干燥试样的重量。试验一 式三次。
2、试验结果
本试验通过研究水凝胶的膨胀率来评价其吸水能力，结果如图3所示。 在图3中，可以清楚的观察到，各组膨胀曲线在初始阶段均呈陡增趋势，然 后逐渐趋于平缓，随着时间的推移，试样的膨胀率逐渐增大，大约4h后，水 凝胶达到平衡状态。与OBSP-CS水凝胶相比，OBSP-CS-LP水凝胶具有更高 的膨胀速率和平衡膨胀比。溶胀平衡后，OBSP-CS-LP水凝胶的吸水能力是 自身重量的30-40倍，OBSP-CS-LP水凝胶具更有利于伤口愈合。
试验例3、水凝胶微环境pH测试
1、试验方法
pH值是伤口敷料的重要参数。将1.0g实施例1制备的OBSP-CS-LP水 凝胶样品在4mL 25℃的PBS(pH 7.4)中浸泡48h。在特定的时间间隔，用 pH计(PHS-3C)测量浸泡溶液的pH值，以评估水凝胶形成的微环境pH值。 本试验一式三次。
2、试验结果
一种新的伤口治疗方法是诱导微环境促进伤口愈合。角质形成细胞的分 泌物自然地将健康皮肤的pH值维持在4.0-6.8之间，这种良好的外部微环境 使皮肤处于吸收营养的最佳状态。从图4可以看出，OBSP-CS水凝胶的pH 值在6.5-7.0之间，呈中性；OBSP-CS-LP水凝胶的pH值在5.2-5.6之间，呈 弱酸性，OBSP-CS-LP水凝胶pH值更有利于伤口的有效保护和愈合。
试验例4、各水凝胶成型效果研究
按照表1所述的材料组成以及浓度，采用实施例1和对比例1所述方法， 仅改变OBSP溶液和CS溶液质量比及菌液浓度，制备不同浓度的水凝胶。 并观察各水凝胶的成型效果，结果如表2所示。
表1.不同材料组成以及浓度的水凝胶
Figure BDA0002693247420000091
表2.不同材料组成以及浓度的水凝胶的成型效果
质量比与菌液浓度(CFU/mL) 水凝胶成型情况
OBSP：CS 5:1 透明，较脆易碎
OBSP：CS 1:1 透明，弹性好，有一定柔韧性
OBSP：CS 1:5 透明，弹性好，柔韧性较差
(OBSP：CS 1:1)+LP(1.0×10<sup>10</sup>CFU/mL) 透明，弹性好，有一定柔韧性
(OBSP：CS 1:1)+LP(5.0×10<sup>10</sup>CFU/mL) 较透明，弹性好，有一定柔韧性
(OBSP：CS 1:1)+LP(9.0×10<sup>10</sup>CFU/mL) 透明度差，弹性好，有一定柔韧性
上述试验结果表明，当OBSP溶液与CS溶液质量比为1:1，LP浓度为 1.0×1010CFU/mL时，所得OBSP-CS-LP水凝胶成型效果最优，韧性最佳。
试验例5、体外抗菌实验
1、试验方法
选用三种伤口感染常见的革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(S.aureus)、 革兰氏阴性菌铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)和大肠杆菌(E.coli)，通过平 板计数法对对比例1和实施例1制备的OBSP-CS、OBSP-CS-LP水凝胶抗菌 活性进行评价。抗菌实验之前，用麦氏比浊管调整菌液浓度约为 1.5×106CFU/mL，备用。OBSP-CS水凝胶在紫外灯照射下灭菌2h。
在洁净台中，将1.0g无菌的OBSP-CS水凝胶与OBSP-CS-LP水凝胶分 别加入12孔板内，铺平底部，每孔加入3mL新鲜LB液体培养基和10μL稀 释菌液(1.5×106CFU/mL)，置培养箱内37℃培养24h，取出12孔板，用 移液枪吸取10μL共培养液于LB平板培养基上，L型玻璃棒涂布均匀，置培 养箱内37℃培养24h后计数活菌。抑制率计算公式如下：
Figure BDA0002693247420000101
式中，N0为空白组平板上的菌落数，N1为试验组平板上的菌落数。本试 验一式三份。
2、试验结果
平板计数法图像如图5所示，与OBSP-CS水凝胶组相比，OBSP-CS-LP 水凝胶组对三种主要致病菌均有更好的抗菌活性。OBSP-CS水凝胶对三种致 病菌的抑制率均在90％以下，而OBSP-CS-LP水凝胶对三种致病菌的抑制率 均接近100％，OBSP-CS-LP水凝胶组板上几乎没有菌落。OBSP-CS-LP水凝 胶能有效预防细菌感染，具有良好的抗菌活性。
试验例6、细胞毒实验
1、试验方法
选取小鼠成纤维细胞(L929)，采用CCK-8法对OBSP-CS-LP水凝胶 的细胞毒性进行评价。无菌条件下，将OBSP-CS-LP水凝胶样品置于10mL EP 管中，加入含10％胎牛血清的DMEM培养液，置于37℃的培养箱中浸提24h， 获得不同浓度(0.625-10.000mg/mL)的水凝胶样品浸提液。
将处于对数期生长的L929单细胞悬液，接种于96孔培养板中(5×104细 胞/板)，以不接种细胞为空白对照，置于37℃、饱和湿度为5％CO2恒温培 养箱培养24h。待细胞贴壁生长后弃去原培养液，实验组每孔加入100μL不 同浓度的OBSP-CS-LP水凝胶浸提液，阴性对照组每孔加入100μL新鲜的 DMEM培养液，置于培养箱中继续培养。分别在培养24h、48h、72h时，取 出一块培养板，每孔加入CCK-8试剂10μL，避光，置于培养箱中培养2h， 使用酶标仪在450nm波长处测定并记录每孔的吸光度值(OD)。每个样本 平行6次，整个实验重复3次。细胞存活率(Cell Viability)计算公式如下：
Figure BDA0002693247420000102
式中，ODs为试验组吸光度值；ODc为阴性对照组吸光度值；ODb为空 白对照吸光度值。
2、试验结果
试验结果如图6所示，随着水凝胶提取物浓度的增加，细胞存活率略有 下降。这可能是由于提取液含量过高破坏了培养基的营养平衡。然而，所有 的水凝胶样品下的细胞存活率均高于75％。说明OBSP-CS-LP水凝胶对L929 细胞无毒，具有良好的生物相容性。
试验例7、伤口愈合试验
1、试验方法
(1)小鼠全层皮肤缺损模型造模及治疗
采用全层皮肤缺损模型评价水凝胶对伤口愈合能力的影响。所有雄性昆 明小鼠(体重18-22g)随机分为3组，每组18只，并在小鼠背部创建直径 为10mm的全程皮肤缺损伤口。实验伤口治疗分为三个小组：即空白组(涂 抹1mL 0.9％NaCl溶液)、OBSP-CS水凝胶组(0.5g对比例1制备的OBSP-CS 水凝胶)和OBSP-CS-LP水凝胶组(0.5g实施例1制备的OBSP-CS-LP水凝 胶)。所有小鼠每天给药，早晚各一次，直至实验结束。
(2)伤口愈合率
造模后，所有小鼠单笼饲养，分组局部治疗，分别于伤后1、3、7、14 天对小鼠背部创面拍照，通过Image J图像分析软件计算创面大小，分析创 面愈合情况，伤口愈合率(WCR)计算如下：
Figure BDA0002693247420000111
式中，A0为原始创面面积(cm2)，A1为实时创面面积(cm2)。
(3)伤口愈合的组织学分析
治疗后1、7、14天，每组小鼠随机选取6只处死，采集创面全层皮肤标 本，固定于4％多聚甲醛溶液中，经组织修块、蒸馏水冲洗、梯度酒精脱水、 透明、石蜡包埋并切片后进行H&E染色和Masson三色染，显微镜下观察组 织病理学变化，采用显微成像系统进行拍照，记录组织学损伤。
(4)肝肾毒性评价
14天实验结束后，处死小鼠，剖开腹腔，取下小鼠肝脏和肾脏，固定于 4％多聚甲醛溶液中，经组织修块、蒸馏水冲洗、梯度酒精脱水、透明、石蜡 包埋并切片后进行H&E染色，显微镜下观察组织病理学变化，采用显微成 像系统进行拍照，记录组织学损伤。
2、试验结果
(1)创伤愈合率
采用全层皮肤缺损模型评估创面愈合情况，结果如图7和图8所示。在 图7中，对小鼠伤口闭合情况进行观察，所有治疗后的伤口均有显著的缩小， 但空白组随着时间的延长，伤口闭合速度缓慢下降。3天后，实验组小鼠创 面干燥，疤痕明显。相反，空白组则出现伤口发红、肿胀、渗出，无明显闭 合。治疗7天后，OBSP-CS-LP水凝胶(76.36％)较OBSP-CS水凝胶(60.5％)、 空白组(37.9％)创面闭合率高，且痂皮自然脱落。用OBSP-CS-LP水凝胶 材料处理的创面在14天后几乎完全愈合。
(2)伤口愈合组织学分析
如图9a所示，7天后未处理的伤口创面(空白组)周围可见大量炎性细 胞，炎症反应严重。而OBSP-CS-LP水凝胶组出现较丰富的组织肉芽和创面 收缩。第14天，OBSP-CS-LP水凝胶组创面几乎完全闭合。此外，与OBSP-CS 水凝胶组相比，OBSP-CS-LP水凝胶组有更多的新生血管和皮肤附属器，如 毛囊、汗腺等。总而言之，对比以上三组，OBSP-CS-LP水凝胶能更好地修 复创面。
由图9b可见，创伤后第7天，空白组胶原纤维含量不多，比较稀疏，未 见明显沉积。对比之下，OBSP-CS-LP水凝胶组中有较多新生胶原纤维。到 第14天时，OBSP-CS-LP水凝胶组出现许多皮肤附属器，皮肤结构与正常皮 肤相似，且蓝色的深度和面积均高于其他两组。对比三组，可见OBSP-CS-LP 水凝胶在一定程度上大大加速了伤口的收缩。
(3)肝肾毒性评价
为了进一步研究水凝胶对器官的潜在损害，通过观察治疗14天后肝脏和 肾脏的形态学变化来评估其功能。图10显示，与空白组相比，肝脏和肾脏未 见病理异常，功能仍在正常范围内。
将植物乳杆菌菌液直接涂抹在伤口上，并不能抑菌，促进伤口愈合，反 而会导致伤口延迟愈合。因此，本发明复合水凝胶发挥了协同增效抑菌、修 复伤口的作用。
上述试验结果表明：
(1)本发明复合植物乳杆菌的氧化白及多糖-壳聚糖复合水凝胶具有三维 多孔网状结构，有利于吸收多余渗液，防止伤口感染，并储存大量的水分， 为创面愈合过程提供良好的湿润环境；
(2)本发明复合植物乳杆菌的氧化白及多糖-壳聚糖复合水凝胶具有良好 的力学性能，韧性佳，更利于使用；
(3)本发明复合植物乳杆菌的氧化白及多糖-壳聚糖复合水凝胶pH值呈 弱酸性，更有利于伤口的有效保护和愈合；
(4)本发明复合植物乳杆菌的氧化白及多糖-壳聚糖复合水凝胶具有优异 的抗菌性能，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有显著抑制作用，效果显著 优于未复合植物乳杆菌的氧化白及多糖-壳聚糖复合水凝胶；同时，该水凝胶 对革兰氏阳性菌的抑菌作用强于革兰氏阴性菌；
(5)本发明复合植物乳杆菌的氧化白及多糖-壳聚糖复合水凝胶对细胞无 毒，具有良好的生物相容性；
(6)本发明复合植物乳杆菌的氧化白及多糖-壳聚糖复合水凝胶确实对伤 口愈合具有优异的效果，治疗3天后创面干燥，疤痕明显，治疗7天后创面 闭合率显著优于未复合植物乳杆菌的氧化白及多糖-壳聚糖复合水凝胶，治疗 14天后创面完全愈合；
(7)本发明复合植物乳杆菌的氧化白及多糖-壳聚糖复合水凝胶无肝肾毒 性。
综上，本发明复合植物乳杆菌的氧化白及多糖-壳聚糖复合水凝胶具有良 好的力学性能和良好的生物相容性，对肝肾无毒副作用，其三维多孔网状结 构，有利于吸收多余渗液，防止伤口感染，并储存大量的水分，为创面愈合 过程提供良好的湿润环境；同时，该复合水凝胶pH值呈弱酸性，与正常健 康皮肤的pH值相近，更有利于伤口的保护和愈合；此外该复合水凝胶抗菌 性能优异，对创面修复效果极佳，能在短时间内促进创面愈合，具体协同增 效作用。本发明复合植物乳杆菌的氧化白及多糖-壳聚糖复合水凝胶在临床创 面修复上具有良好的应用前景，有望发展成为一种有潜力的创面敷料。

Claims (10)

1.一种益生菌结合氧化白及多糖-壳聚糖复合水凝胶，其特征在于：它是益生菌、氧化白及多糖溶液和壳聚糖溶液混合后经过交联反应而得；
所述氧化白及多糖是白及多糖被氧化剂氧化后而得。
2.根据权利要求1所述的复合水凝胶，其特征在于：所述益生菌为益生菌菌液；
优选地，所述益生菌菌液的浓度为1.0×1010～9.0×1010CFU/mL；
更优选地，所述益生菌为植物乳杆菌。
3.根据权利要求1所述的复合水凝胶，其特征在于：所述氧化白及多糖溶液的浓度为1～5wt％；和/或，所述壳聚糖溶液的浓度为1～5wt％；
优选地，所述氧化白及多糖溶液的浓度为2.0wt％；和/或，所述壳聚糖溶液的浓度为1.5wt％；
更优选地，所述氧化白及多糖溶液为氧化白及多糖水溶液；和/或，所述壳聚糖溶液为壳聚糖水溶液。
4.根据权利要求1～3任一项所述的复合水凝胶，其特征在于：所述氧化白及多糖溶液和壳聚糖溶液的质量比为(1～5)：(1～5)；
和/或，所述氧化白及多糖溶液和益生菌菌液的体积比为(5～10)：1；
优选地，所述氧化白及多糖溶液和壳聚糖溶液的质量比为1:1；
和/或，所述氧化白及多糖溶液和益生菌菌液的体积比为5:1。
5.根据权利要求1～3任一项所述的复合水凝胶，其特征在于：所述交联反应为30～50℃反应1～5h；
优选地，所述交联反应为45～48℃反应4h；
更优选地，所述交联反应在搅拌下进行，搅拌速度为100～200rpm。
6.根据权利要求1的复合水凝胶，其特征在于：所述氧化剂和白及多糖结构单元摩尔比为0.23；
优选地，所述氧化剂为高碘酸钠。
7.根据权利要求1所述的复合水凝胶，其特征在于：所述白及多糖被氧化剂氧化的条件为避光条件下室温搅拌反应24～48h，反应后加入乙二醇终止反应；
优选地，所述氧化后的反应液透析、干燥，得到氧化白及多糖；
更优选地，所述透析为用截止分子量为3000～5000Da的透析袋在去离子水中透析3天；和/或，所述干燥为冷冻干燥。
8.根据权利要求1所述的复合水凝胶，其特征在于：所述白及多糖通过下述方法制备得到：
(1)取白及块茎，粉碎、过筛，用石油醚脱脂，再使用乙醇回流提取，将提取液过滤，取滤饼，干燥，得预处理干粉；
(2)预处理干粉用水提取，提取后过滤，将提取液浓缩，脱去蛋白，收集水层，浓缩水层，得浓缩液；
(3)将乙醇加入浓缩液中，以达到70％的体积分数，4℃过夜，沉淀多糖；
(4)将沉淀物干燥，得粗白及多糖；
(5)将粗白及多糖纯化，即得白及多糖；
优选地，
步骤(1)中，所述白及块茎为干燥白及块茎；
和/或，步骤(1)中，所述脱脂的温度为60-90℃；
和/或，步骤(1)中，所述乙醇为95％乙醇；
和/或，步骤(1)中，所述回流提取为70℃回流提取2～3次，每次1～3h；
和/或，步骤(1)中，所述白及和乙醇的质量体积比为1g：(10～50)mL；
和/或，步骤(2)中，所述预处理干粉和水按的固液比为1g：(40～100)mL；
和/或，步骤(2)中，所述提取次数为1～3次；
和/或，步骤(2)中，所述提取条件为70℃搅拌提取1～3h；
和/或，步骤(2)中，所述脱去蛋白为采用Sevage法脱去蛋白；
和/或，步骤(3)中，所述乙醇为95％乙醇；
和/或，步骤(4)中，所述干燥为45℃真空干燥；
和/或，步骤(5)中，所述纯化为将粗白及多糖过DEAE-cellulose-52柱；
更优选地，
和/或，步骤(1)中，所述回流提取为70℃回流提取2次，每次2h；
和/或，步骤(1)中，所述白及和乙醇的质量体积比为1g：10mL；
和/或，步骤(2)中，所述预处理干粉和水按的固液比为1g：40～100mL；
和/或，步骤(2)中，所述提取次数为3次；
和/或，步骤(2)中，所述提取条件为70℃搅拌提取2h。
9.一种权利要求1～8任一项所述的复合水凝胶的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：将益生菌、白及多糖溶液和壳聚糖溶液混合后交联，即得；
优选地，
所述益生菌为益生菌菌液；
和/或，所述氧化白及多糖溶液为氧化白及多糖水溶液；
和/或，所述壳聚糖溶液为壳聚糖水溶液；
和/或，所述交联反应为30～50℃反应1～5h；
更优选地，
所述益生菌菌液的浓度为1.0×1010～9.0×1010CFU/mL；
和/或，所述交联反应为48℃反应4h；
进一步优选地，所述益生菌为植物乳杆菌；
和/或，所述交联反应再搅拌下进行，搅拌速度为100～200rpm。
10.权利要求1～8任一项所述的复合水凝胶在制备抗菌的材料中的用途；
优选地，所述材料为生物医用材料；和/或，所述抗菌材料为抑制革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌的材料；
更优选地，所述材料为促进创面愈合的材料；和/或，所述革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌；和/或，所述革兰氏阴性菌为铜绿假单胞菌、大肠杆菌；
进一步优选地，所述材料为创面敷料。
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