CN115414381B - 一种具有瘢痕抑制和/或促伤口愈合作用的组合物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及药物制剂领域，具体公开了一种具有瘢痕抑制和/或促伤口愈合作用的组合物及其制备方法和用途。组合物包括如下重量份的原料制成：积雪草苷复合物0.01~0.3份、白及多糖1份；所述积雪草苷复合物是积雪草苷溶解于2‑羟丙基‑β‑环糊精溶液中，再过滤干燥的固体；所述固体中积雪草苷与2‑羟丙基‑β‑环糊精的摩尔比为0.1~0.8：1。本发明通过将自身具备瘢痕抑制作用的积雪草苷与无抑制瘢痕作用的白及多糖有机结合制成的微针，使皮肤胶原蛋白沉积更广泛，排列更加有序，显著改善了皮肤细胞外基质的重建和组织重塑，在抑制瘢痕方面起到了协同增效的作用，同时加速伤口愈合，效果显著，具备临床推广应用价值。

Description

一种具有瘢痕抑制和/或促伤口愈合作用的组合物及其制备 方法和用途
技术领域
本发明涉及药物制剂领域，具体涉及一种具有瘢痕抑制和/或促伤口愈合作用的组合物及其制备方法和用途。
背景技术
日常生活当中，皮肤不可避免的会受到伤害，在伤口愈合的过程中，由于皮肤组织结构产生了变化会形成瘢痕，瘢痕本身并不具备正常的皮肤生理功能以及组织结构，多为不健全和异常的增生组织。瘢痕不仅对体表美会产生影响，同时也会对相应的器官与组织生理功能产生阻碍作用，甚至会造成畸形的产生。瘢痕体质人群皮肤受到伤害以后，在伤口愈合的进程中，表面瘢痕会持续增加，不仅对外观产生影响，同时也会产生局部的红痒、疼痛。瘢痕收缩也会对运动功能产生不利影响。
钟海蓉等，积雪草苷治疗瘢痕疙瘩后皮肤损伤39例[J],河南中医，217，37（4）公开了积雪草苷能治疗瘢痕疙瘩引起的疼痛，生理生化指标的改变。由于其仅起到辅助治疗的作用，需要与90锶敷贴相结合，在抑制瘢痕形成方面效果也不明确，故无法推广应用于瘢痕的预防或治疗。
白及多糖是从传统中药白及提取而得的由α-甘露糖、β-甘露糖和β-葡萄糖等多个单糖和糖苷键连接而成的聚合物。研究表明其具有抑菌、抗肿瘤、止血、抗溃疡、促进创伤愈合等作用，在医药领域开发价值较高，但还没有其抑制瘢痕的报道，更没有将其与积雪草苷联合用于预防和治疗瘢痕的报道。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种具有瘢痕抑制和/或促伤口愈合作用的组合物，它是包括如下重量份的原料制成：
积雪草苷0.01~0.3份、白及多糖1份。
进一步地，所述积雪草苷包括积雪草苷复合物；所述积雪草苷复合物是积雪草苷与2-羟丙基-β-环糊精相互结合组成的集合体。
更进一步地，所述积雪草苷复合物是积雪草苷溶解于2-羟丙基-β-环糊精溶液中，再过滤干燥的固体。
更进一步地，所述积雪草苷与2-羟丙基-β-环糊精的摩尔比为0.1~0.8：1；所述过滤的孔径为0.45 μm；所述干燥为冷冻干燥，温度-80±2℃，时间24 小时。
进一步地，它是包括如下重量份的原料制成：
积雪草苷复合物0.1~0.3份、白及多糖1份。
更进一步地，它是包括如下重量份的原料制成：
积雪草苷复合物0.12份、白及多糖1份。
进一步地，它是以积雪草苷复合物和白及多糖为活性成分，加上药物载体制备而成的外用敷料；所述外用敷料为乳剂、膏剂、粉剂或微针，优选微针。
更进一步地，所述微针是由如下重量份的原料制备而成：
积雪草苷复合物0.12份、白及多糖1份、壳聚糖1.2~1.5份。
更进一步地，所述微针是由如下重量份的原料制备而成：
积雪草苷复合物0.12份、白及多糖1份、壳聚糖1.2份。
本发明还提供了一种前述组合物的方法，它包括如下步骤：
1）按配比称取原料，取壳聚糖，加乙酸水溶液溶解，再加积雪草苷复合物溶解，倒入微针模具中，离心，干燥得壳聚糖载积雪草苷微针；
2）取白及多糖加水制成白及多糖溶液，倒入步骤1）所得壳聚糖载积雪草苷微针上，凝固后脱模得壳聚糖载积雪草苷-白及多糖双层微针。
进一步地，步骤1）所述壳聚糖与乙酸水溶液的质量体积比为6~8g：100ml，优选6g:100ml；所述乙酸水溶液中乙酸浓度为2%，v/v；所述离心的速度为4000rpm，时间为15分钟；干燥温度为20~30℃。
进一步地，步骤2）所述白及多糖溶液中白及多糖浓度为4%，w/v；凝固成凝胶状再脱模。
本发明还提供了一种前述组合物在制备治疗和/或预防瘢痕的药物中的用途。
本发明最后提供了一种前述组合物在制备促进伤口愈合的药物中的用途。
本发明具有瘢痕抑制作用的组合物，通过将自身具备瘢痕抑制作用的积雪草苷与无抑制瘢痕作用的白及多糖有机结合制成的微针，使皮肤胶原蛋白沉积更广泛，排列更加有序，显著改善了皮肤细胞外基质的重建和组织重塑，在抑制瘢痕方面起到了协同增效的作用，同时加速伤口愈合，效果显著，具备临床推广应用价值。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1微针制造工艺示意图；
图2 MNs的形态学研究和机械性能研究结果图（A：MNs的照片；B表面的扫描电镜图像；C横截面形态的扫描电镜图像；D：FITC（异硫氰酸荧光素）的CLSM图；E：RhB（罗丹明B）的CLSM图；F：CLSM的合并图；G：MNs的机械性能图，其中G（a）是CS MNs机械性能图，G（b）是CS-BSP MNs 机械性能图，G（c）是CS-AS MNs机械性能图，G（d）是 CS-AS-BSP MNs机械性能图；H：MNs处理后大鼠皮肤的H&E染色图，显示MNs产生的微孔；I：去除MNs贴片后皮肤恢复的照片）；
图3 CS-AS-BSP MNs的表征和释药结果图（A：FTIR光谱图；B：在加入药物前的XRD光谱图；C在加入药物后的XRD光谱图；D： CS-AS（粉末）-BSP MNs释放的 AS的累积量结果图； E： CS-AS-BSP MNs 释放的 AS的累积量结果图，n=3； F: CS-AS（粉末）-BSP MNs释放的 AS 的累积量与 CS-AS-BSP MNs 释放的 AS 的累积量对比图）；
图4微针的抗菌性能结果图（A：分别是所开发的MNs的抗菌活性，通过在37°C下将其培养基在LB琼脂平板上扩散，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌悬浮液的菌落形成单位的代表性图像；B：大肠杆菌的菌落数结果图；C：金黄色葡萄球菌的菌落数结果图；D：不同试验组对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌对比图，平均± SD，n=3，*p<0.05 &**p<0.01 &***p<0.005 &ns p>0.05 vs. 对照）；
图5不同浓度MNs的细胞活力结果图；
图6细胞划痕实验结果图（A：显示细胞向伤口间隙迁移的代表性光学图像；B：划痕伤口模型的示意图；C：划痕测定中恢复面积的百分比结果图，平均±SD，n = 3，*p<0.05&**p<0.01 &***p<0.005 &ns p>0.05 vs. 对照）；
图7微针伤口愈合治疗效果研究结果图（A：未处理创面、CS-BSP MNs、CS-AS MNs、CS-AS-BSP MNs 0、7、14、21 天图像；B: 21 天各组微针伤口愈合变化示意图；C：不同愈合时间创面恢复率值的结果图；D：21天后创面H&E染色图，1：对照组的皮肤表皮，2：对照组的表皮纤维细胞，3：对照组的表皮层纤维细胞，4：CS-BSP MNs组的皮肤表皮，5：CS-BSP MNs组表皮下炎症细胞，6：CS-BSP MNs组的表皮层皮下炎症细胞，7：CS-BSP MNs组的表皮层皮下纤维细胞；8：CS-AS MNs组真皮层及皮下层纤维细胞，9：CS-AS MNs组真皮层及皮下层炎症细胞，10：CS-AS-BSP MNs组的表皮皮下毛囊皮皮腺结构，11：CS-AS-BSP MNs组的表皮层皮下毛囊皮皮腺结构）；
图8微针药效学研究结果图（A：第21天后伤口的Masson染色图；B：21天后各组肉芽组织(TGF-β1、ColⅠ)免疫染色图；C 21天后创面胶原面积图；D：TGF-β1阳性表达率的结果图；E：ColⅠ阳性表达率的结果图。(平均值±SD, n=3)。(*p<0.05 &**p<0.01 &***p<0.005&ns p>0.05 vs. 对照)；
图9 细胞活力计算公式图 ；
图10 伤口愈合率计算公式图；
图11 伤口闭合度计算公式图。
具体实施方式
实施例1积雪草苷复合物的制备
取2-羟丙基-β-环糊精（HP-β-CD）溶解于蒸馏水中，然后加入积雪草苷（AS）溶解得溶液，其中溶液中HP-β-CD 和 AS的摩尔比为1:0.5；
将溶液在室温下搅拌24小时并通过尼龙过滤器（平均孔径= 0.45μm），然后在-80±2℃下冷冻干燥，得AS/HP-β-CD复合物。
实施例2、本发明瘢痕抑制微针制备
配方：实施例1制备的积雪草苷复合物0.12 g、白及多糖1g、壳聚糖1.2g。
制备方法：
1）按配比称取原料，取壳聚糖，加2%（ml/ml）乙酸水溶液溶解,制成浓度为6%的壳聚糖溶液，再加积雪草苷复合物溶解，倒入微针模具中，以4000rpm的速度离心15分钟，室温下自然干燥得壳聚糖载积雪草苷微针；
2）取白及多糖加水制成4%（w/v）的白及多糖溶液，倒入步骤1）所得壳聚糖载积雪草苷微针上，凝固成凝胶，脱模得壳聚糖载积雪草苷-白及多糖双层微针。
实施例3、本发明瘢痕抑制微针制备
配方：实施例1制备的积雪草苷复合物0.1g、白及多糖1g、壳聚糖1.2g。
制备方法：
1）按配比称取原料，取壳聚糖，加2%（ml/ml）乙酸水溶液溶解，制成浓度为6%的壳聚糖溶液，再加积雪草苷复合物溶解，倒入微针模具中，以4000rpm的速度离心15分钟，室温下自然干燥得壳聚糖载积雪草苷微针；
2）取白及多糖加水制成4%（w/v）的白及多糖溶液，倒入步骤1）所得壳聚糖载积雪草苷微针上，凝固成凝胶，脱模得壳聚糖载积雪草苷-白及多糖双层微针。
实施例4、本发明瘢痕抑制微针制备
配方：实施例1制备的积雪草苷复合物0.3g、白及多糖1g、壳聚糖1.5g。
制备方法：
1）按配比称取原料，取壳聚糖，加2%（ml/ml）乙酸水溶液溶解,制成浓度为6%的壳聚糖溶液，再加积雪草苷复合物溶解，倒入微针模具中，以4000rpm的速度离心15分钟，室温下自然干燥得壳聚糖载积雪草苷微针；
2）取白及多糖加水制成4%（w/v）的白及多糖溶液，倒入步骤1）所得壳聚糖载积雪草苷微针上，凝固成凝胶，脱模得壳聚糖载积雪草苷-白及多糖双层微针。
以下通过试验例来说明本发明的有益效果。
实验例1瘢痕抑制微针的研究
1、方法
1.1.材料
壳聚糖（CS，脱乙酰度≥90%）购自国药化学试剂有限公司；积雪草苷（AS，分子量959.12，纯度>95%）购自南京景竹生物科技有限公司；2-羟丙基-β-环糊精（HP-β-CD, 分子量1541.54，纯度>99%）购自成都化夏化学公司；中药白及产自云南；磷酸盐缓冲盐水(PBS)、高葡萄糖 (4.5 g/L) 达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)、胎牛血清 (FBS)、胰蛋白酶-EDTA (0.05%) 和青霉素-链霉素 (10,000U/ml) 购自 Gibco，聚二甲基硅氧烷(PDMS)模具来自泰州微芯片医疗科技有限公司；雄性SD大鼠，体重160～180g，由成都达硕实验动物有限公司(中国成都)采集，所有大鼠均严格按照《实验动物护理和使用指南》进行处理，所有涉及动物的实验都得到了西南民族大学实验动物福利与伦理委员会批准；大肠杆菌（ATCC8739）和金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）菌株购自上海鲁微科技有限公司；L929细胞是小鼠成纤维细胞，由成都中医药大学提供；HSF细胞是人皮肤成纤维细胞，由大坪医院皮肤科实验室提供。
1.2.白及多糖的提取
BSP的提取遵循之前的报道，将白及在真空干燥箱中45℃恒温干燥至恒重后，粉碎成粉，用3号筛筛出，然后依次用石油醚（5ml/g，60-90 ℃）和乙醇（5ml/g，95%）在 70 ℃下萃取 2 h，将溶液过滤干燥后，加入70℃纯水，固液比1:40（m/v），在70℃下以 150 r/min的速度搅拌2h。BSP用Sevag试剂（氯仿：丁醇，4:1 v/v）脱蛋白后，用乙醇沉淀，4℃冷藏12 h，最后，沉淀物依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，在真空干燥箱中30℃干燥至恒重，得到BSP。BSP也可通过市售购买获得。
1.3. 积雪草苷/2-羟丙基-β-环糊精复合物的制备
制备摩尔比为1:0.5的 HP-β-CD 和AS。首先，将HP-β-CD 溶解在蒸馏水中，然后将AS添加到溶液中，将溶液在室温下搅拌24小时并通过尼龙过滤器（平均孔径= 0.45μm），然后在 -80±2℃下冷冻干燥 24 小时，得到固体，以获得AS/HP-β-CD复合物，下述使用的AS即为AS/HP-β-CD复合物。
1.4 试验用微针的制备
1.4.1 溶液的制备
壳聚糖溶液：用2%，ml/ml的乙酸溶解壳聚糖，得到6%，g/ml的壳聚糖溶液作为针尖层溶液。
白及多糖溶液：用纯化水溶解白及多糖，得到4%，g/ml的白及多糖溶液作为背衬层溶液。
1.4.2 微针的制备
CS MNs：取800μl壳聚糖溶液倒在PDMS模具上，以4000rpm的速度离心15分钟以完全填充模具针尖且无气泡，室温下自然干燥24小时，即得。
CS-BSP MNs：取1ml白及多糖溶液倒在干燥的CS MNs上，室温下凝固成凝胶，脱模得到壳聚糖-白及多糖双层微针（CS-BSP MNs）。
CS-AS MNs：取800μl壳聚糖溶液，再加入0.0048g积雪草苷复合物溶解，倒在PDMS模具上，以4000rpm的速度离心15分钟以完全填充模具针尖且无气泡，室温下自然干燥24小时，即得。
CS-AS-BSP MNs：取1ml白及多糖溶液倒在干燥的CS-AS MNs上，室温下凝固成凝胶，脱模得到壳聚糖-白及多糖双层微针（CS-AS-BSP MNs）。
CS-AS（粉末）-BSP MNs：取800μl壳聚糖溶液，再加入0.0048g积雪草苷粉末，倒在PDMS模具上，以4000rpm的速度离心15分钟以完全填充模具针尖且无气泡，室温下自然干燥24小时，取1ml白及多糖溶液倒在干燥的CS-AS（粉末） MNs上，室温下凝固成凝胶，脱模得到壳聚糖-白及多糖双层微针（CS-AS（粉末）-BSP MNs）。
BSP MNs：取1ml白及多糖溶液倒在PDMS模具上，以4000rpm的速度离心15分钟以完全填充模具且无气泡，室温下自然干燥，脱模得白及多糖微针（BSP MNs）。
1.5.表征
使用扫描电子显微镜（SEM）和共聚焦显微镜（CLSM）表征微针的微观形态。用波数范围为400～4000 cm-1的FTIR确定药物的结构信息以及药物之间的相互作用。在EMPYREANXRD（PANalytical B.V.，荷兰）上进行30 mA和30 kV的XRD测量，配备了镍过滤铜Ka辐射，以4°/min的速度在4°～60°的范围内进行，扫描速度为0.2°/min。
使用万能试验机以0.02mm/s对微针机械性能进行测试。为了评估微针体外皮肤插入能力，将载药的 MNs贴片沿垂直方向压在 SD 大鼠背侧皮肤上 3 分钟。剥离MNs后，为观察组织切片，将插入的皮肤用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切成 5μm切片，然后用苏木精和伊红 (H&E) 染色。
1.6. CS-AS-BSP MNs以及CS-AS（粉末）-BSP MNs释放 AS 的研究
为了确定负载AS/HP-β-CD 复合物的微针中AS的实际量，在37°C温度下，将微针浸入PBS 中。AS的实际量以 1 ml/min 的流速分离，在流动相为乙腈/甲醇/蒸馏水 (26:24:50 v/v/v)，进样量为100μl，紫外检测器设置在 (λ max ) 204nm的条件下，通过高效液相色谱 (HPLC)获得的，然后根据AS的校准曲线得出结果。
AS释放特性由全浸入法确定。将每个支架浸入37°C的 30 ml PBS 中。在0到168小时（7天）之间的每个时间点，收集2 ml 样品溶液并用等量的新鲜培养基代替。通过 HPLC测定样品溶液中AS的量。获得的数据用于确定在每个浸泡时间点从支架中累积释放的AS量。
1.7. 抗菌活性测试
液体培养试验和菌落计数方法被用来评估微针的抗菌活性。样品对大肠杆菌（ATCC 8739）、金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）菌株进行的杀菌能力测试。首先，将微针BSPMNs、CS-BSP MNs、CS-AS MNs、CS-AS-BSP MNs在紫外线灯下照射半小时，以去除表面的细菌。将微针样品转移至48孔板中，加入100μl菌液使菌液完全浸没微针。将样品在37 ℃培养4 h，然后分别加入900μl培养基在二氧化碳培养箱中培养过夜，同时设置对照，以不加入微针组为对照。随后，在孵育24小时后，使用微量滴定板读数器（BioTek ELx800；BioTekInstruments Inc.，Winooski，VT，America）测量 600 nm 处的吸光度，最后，用新鲜的LB培养基稀释106倍，取100μl稀释后的溶液于细菌培养板中，然后在培养箱中继续培养12 h，观察菌落数。
1.8.细胞毒性
CS MNs、BSP MNs、CS-BSP MNs、CS-AS MNs、CS-AS-BSP MNs提取物对 L929细胞的细胞毒性在 96 孔板法中通过细胞计数 kit-8 测定 (CCK-8) 进行评估。具体方法为：
1）孔板中的细胞在含有10%胎牛血清（FBS）、90% DMEM培养基和1%青霉素/链霉素溶液的完全培养基中，以无菌环境、37℃和5% CO2为条件孵育；
2）根据国标GB/T 16886.5-2017，将所有样品微针分别浸入等量的血清培养基中，在37℃下培养24小时；
3）取步骤2）培养后的血清，作为样品的提取物，然后用新鲜血清培养基稀释提取物，收集一系列提取物稀释液（0.25、0.5、1、2.5、5 mg/ml）；
4）取等量的步骤3）的稀释液于孔板中，每孔再加入10μl CCK-8 溶液，孵育2 h，用酶联免疫吸附试验（光密度，OD）测量450 nm 处的吸光度。
用上述方法进行背景实验，含有细胞的对照组在没有样品的情况下培养，样品的细胞活力计算如图9：图中，OD样品——样品孔的光密度，OD对照——无样品对照的光密度，OD空白——空白孔的光密度。
1.9.体外伤口划痕
将HSF细胞以每孔 1.0 × 105个细胞的密度接种到6孔板中，加入2.0 ml 含有10% FBS的DMEM/F-12，并使其附着直至细胞达到80-90%，然后用无菌移液器吸头在培养物中间划出划痕，用PBS洗去划掉的细胞。药物溶液由 0.5% FBS的DMEM/F-12制备，使CS MNs、BSP MNs、CS-BSP MNs、CS-AS MNs、CS-AS-BSP MNs提取物浓度均为0.5mg/ml。每个孔，用2.0ml药物溶液替换旧培养基。同时设置对照，以不加入微针组为对照，在0h和24 h用倒置显微镜对细胞的迁移进行拍照。Image J分析划痕面积，伤口愈合率（WHR）根据以下图10的等式计算，在等式中，A0和At分别表示在0 h和t h处的划痕面积。
1.10.大鼠伤口愈合实验
所有动物实验均按照中国成都西南民族大学实验动物福利与伦理委员会的相关规定进行。在SD大鼠背部(160～180g)建立直径10 mm的全层皮肤缺损创面模型。将直径为10 mm的CS-AS-BSP MNs、CS-BSP MNs、CS-AS MNs、贴片贴在伤口位置，同时设置对照，以没有微针治疗为对照，并在第0、7、14和21天拍照，根据图11计算伤口闭合度。
1.11疗效评价和组织学分析
在21天时，每组随机抽取伤口样本进行组织学检查，同时用正常皮肤作为对照。将样品在4%多聚甲醛中固定24小时，包埋在石蜡中，并与组织一起横切，然后，分别进行H&E和Masson 染色以确定上皮再形成和胶原沉积程度。胶原蛋白I（col I）和TGF-β1染色用于免疫组织化分析。
2. 结果和讨论
2.1 微针的制备
双层MNs通过简单而温和的两步铸造工艺制备（图1）。双层MNs的尖端层由CS和AS复合体组成，背衬层由BSP组成。
2.2. 微针的形态学研究
在室温下干燥后，小心地将MNs阵列从模具上剥离，以获得在0.52 cm2方形支撑底座上以10×10配置布置的图案化的CS-AS-BSP MNs。在扫描电子显微镜（SEM）图像中，制备的CS-AS-BSP MNs是圆柱形的，高度约为600μm，底部直径约为300μm（图2A-B）。从样品的横截面上看，CS层厚度致密，冻干后BSP层明显呈现均匀的三维骨架结构和大量微孔（图2C）。SEM截面的结果可以证明微针的双层结构。共聚焦显微镜还清楚地显示了由CS尖端（图2D）和基于BSP的根（图2E）组成的均匀制造的微针双层结构（图2F）。其他微针CS MNs、CS-BSPMNs、CS-AS MNs、CS-AS（粉末）-BSP MNs相应部分的微观形态相似。
2.3 微针的机械性能和体外插入能力
机械强度是评估MNs皮肤组织穿透性的关键参数。通过使MNs贴片抵抗不锈钢板的压力进行压缩试验，得到力曲线[图2G(a)、图2G(b)、图2G(c)、2G(d)]，从力曲线可见：CS-AS-BSP MNs抗压力最强。H&E染色表明，CS-AS-BSP MNs可以毫无困难地穿透大鼠皮肤（图2H）。为了证明微针穿透的安全性，将CS-AS-BSP MNs按压在正常皮肤上30秒后，皮肤可以在13分钟内恢复原型（图2I），可见CS-AS-BSP MNs不会损伤皮肤。
2.4微针的表征
采用FTIR光谱分析以研究BSP、CS、AS和CS-BSP MNs、CS-AS MNs、 CS-AS-BSP MNs之间的交联机制和分子相互作用（图3A）。傅立叶红外光谱在400 - 4000cm -1 处为典型的多糖主导信号。对于BSP，3407.37 cm -1处显示一个宽而强的峰，与 O-H 的伸缩振动相对应，是多糖的羟基吸收峰；在1162.86cm -1、1081.87 cm -1和1031.73 cm -1处的峰与呋喃糖环的C-H环的伸缩振动有关。此外，881 cm -1 和809.95 cm -1 处的峰代表甘露糖。对于CS，3000～3700cm-1 的宽吸收带为O-H的伸缩振动，3367cm-1处强烈而宽的吸收峰可能与氢键结合和羟基拉伸振动密切相关；在2927.41cm-1和2888.29cm-1处获得的特征带对应于C-H拉伸；1637.27cm -1为氨基振动吸收峰；1031.73cm -1处的峰是酰胺中C-N伸缩振动的体现。对于AS，在3414.03cm -1附近有一个宽峰，代表-OH伸缩振动；2938cm -1处的峰对应于-CH2反对称伸缩振动；1051.01cm-1处的峰归属于-CO伸缩振动。对于CS-BSP MNs的 FT-IR光谱表明，各聚合物的物理和化学性质不仅保留了，而且在 1000cm-1 附近的吸收部分峰变宽并略微向较低的波数移动，可能在接触上形成复合物表面和氢键的存在，这提高了MNs的性能。对于CS-AS MNs 、CS-AS-BSP MNs，没有发现新峰的出现，表明AS复合物的加入没有引起化学反应，是通过物理固定加载到微针中。
从XRD图谱可以看出，CS MNs在2θ=11.28°和2θ=18.21°有2个不同的峰，表明较好的结晶度取向性。从图谱中可以看出BSP具有弱的结晶性，主要是晶态与非晶态共存、亚晶态与非晶态共存的多晶体。AS的粉末具有明显的衍射峰，表明其结晶性好。对于AS/HP-β-CD复合物，没有明显的散射峰，表明材料具有无定形性质。这些结果证实了AS包含在HP-β-CD的空腔中，而且，它们仅表现出壳聚糖的特征峰。结果表明AS复合物基本溶解在CS中（图3B-C）。
2.5 微针的释药结果研究了在PBS中浸泡7天的CS-AS-BSP MNs的AS释放特性。CS-AS（粉末）-BSP MNs中AS释放结果（图3D）显示，其在7 天内只能达到约20%。CS-AS-BSP MNs释放的AS量最初稳步上升，在6小时内达到接近80%，浸泡7天后，AS仍可累积释放，7天内AS的释放量可以超过85%（图3E）。根据研究结果，在CS-AS-BSP MNs中AS释放量大大超过AS粉末制备的微针（图3F）。因此，HP-β-CD可以提高AS在水性介质中的溶解度，且通过CS达到中长期释放的效果。
2.6 抗菌试验
由于伤口容易从环境中感染，因此，抗菌活性很重要。由细菌菌落数可见，BSP MNs对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌没有抗菌作用（图4A），CS可以增强抗菌性能。带正电的CS和带负电的细菌细胞壁之间的相互作用导致细菌活性的破坏，细菌的细胞内成分泄漏导致细菌细胞死亡，因此，CS被用作抗菌剂。以前的研究表明，CS可以抑制多种细菌的生长，其对革兰氏阳性细菌的抑制作用优于革兰氏阴性细菌，加入AS，抗菌性能得到提高（图4B-D）。CS-AS-BSP MNs的抗菌性能表明，其抗菌效果令人满意。
2.7细胞毒性
CCK-8测定显示任何测试的MNs稀释剂中超过80%的L929细胞具有活力和增殖性，可见MNs均无毒性，这些结果表明MNs对L929细胞提供了良好的细胞活力，是安全的（图5）。因此，这些双层MNs作为伤口敷料具有良好的生物相容性，并有可能用作伤口敷料。特别是，BSP为L929细胞的生长，增殖和分化提供了良好的表面，这些L929细胞在结缔组织中分泌细胞外基质，能够维持和支持组织。此外，CS的正电荷促进L929细胞对蛋白质的吸收，从而加速体内平衡。BSP MNs具有促L929细胞生长的作用。这些生物活性事实表明MNs作为生物膜具有增殖作用和良好的生物相容性。
2.8. 体外伤口划痕
成纤维细胞有效的迁移对伤口愈合起着重要作用，可以产生细胞牵引力和收缩力，但成纤维细胞的过度增殖和迁移也可能导致瘢痕，采用划痕试验评价不同MNs培养基提取物培养的HSF细胞迁移能力，体外伤口划痕试验评估对成纤维细胞迁移作用的影响。
从图6A~B可见：随着愈合时间的推移，所有组伤口边缘的HSF细胞都是向中间迁移到无细胞区域，但CS-AS MNs组和CS-AS-BSP MNs组明显迁移的HSF细胞较少，间隙面积较大。考虑到成纤维细胞的过度增殖和迁移可能导致瘢痕，抑制HSF维细胞过度迁移很重要。图6C的结果表明，CS MNs和BSP MNs处理相对对照不具有统计学差异，CS-BSP MNs处理相对对照具有统计学差异，但划痕在24h后基本恢复，可见，CS MNs、BSP MNs和CS-BSP MNs并不能有效抑制HSF细胞过度迁移。虽然CS-AS MNs在24h后，能有效的控制划伤区域HSF细胞的过度迁移，相较对照有统计学差异（P < 0.05），但将没有抑制过度迁移效果的BSP加入CS-AS MNs，制成的CS-AS-BSP MNs在24h，大约仅5%的划伤区域被恢复，相较对照具有极显著的差异（P<0.001），这些结果表明，CS-AS-BSP MNs有促进HSF细胞迁移使伤口愈合的作用，同时也避免了HSF细胞过度迁移，达到了抑制瘢痕组织形成，起到了协同增效的作用。
2.9 大鼠伤口愈合实验及组织学分析
在有皮肤伤口的大鼠中，进一步评估了 CS-AS-BSP MNs 的体内伤口愈合效果。通过在大鼠背部创建一个 10 mm 的圆形伤口，成功建立了大鼠创伤模型。为了评估不同组的治疗效果，分别在治疗后 0、7、14 和 21 天拍照进行详细分析（图7A）。随着愈合时间的推移，所有组的伤口面积都呈减少的趋势并向中心收缩，照片显示，对照组呈现缓慢的自愈合趋势，且有较大的缺损和瘢痕；CS-BSP MNs组较对照组较好，但仍有瘢痕形成；CS-AS MNs组前期愈合缓慢，后期伤口愈合情况良好，且未见明显瘢痕；CS-AS-BSP MNs组伤口愈合速度快，治疗21天后伤口表面平整光滑，几乎完全愈合（图7B）。数量方面，根据特定时间的伤口缩小面积计算愈合百分比，对照组创面面积为85%，CS-BSP MNs组为88%，CS-AS MNs组为91%，CS-AS-BSP MNs为96% (图7C)。
综合图7结果可见，从第7天的CS-BSP MNs组与CS-AS MNs组的比较，BSP的抗炎作用可以促进伤口愈合；从第21天的CS-BSP MNs组与CS-AS-BSP MNs组的比较来看，AS的长效释放可以降低成纤维细胞的过度增值，抑制胶原蛋白的过度积累，从而达到抗疤痕的效果；CS-AS-BSP MNs组治疗21 天后创面面积明显小于其他三组。这些结果表明，CS-AS-BSP MNs表现出有效的伤口愈合能力，可能的原因如下：在CS-AS-BSP MNs组中，CS可以抑制创面细菌的生长，防止创面感染或慢性创面形成， BSP的抗炎作用可以促进伤口愈合，AS的长效释放，可以达到抗疤痕的效果。简而言之，CS-AS-BSP MNs是抗炎、抗菌、伤口愈合和抗疤痕协同作用的结果，因此再生上皮更加光滑平整。
H&E染色用于研究伤口床收缩，肉芽和上皮形成的过程（图7D）。结果显示：对照组的皮肤表皮1覆盖伤口表面，纤维细胞2较多，表皮层的皮肤覆盖了伤口，有许多纤维细胞3；在CS-BSP MNs组中，表皮4覆盖伤口，并且在皮下毛囊周围观察到一些炎症细胞5，表皮层覆盖伤口表面，皮下毛囊周围有少数炎症细胞6和更多的纤维细胞7；在CS-AS MNs组中，表皮被完全覆盖，在真皮和皮下观察到大量的炎性细胞和纤维细胞，皮肤的表皮层被完全覆盖，真皮层和皮下层有许多炎症细胞9，许多纤维细胞8；CS-AS-BSP MNs组皮肤表皮完全覆盖，皮下毛囊皮皮腺结构10较正常，纤维细胞罕见，皮肤的表皮层被完全覆盖，皮下毛囊的皮脂腺结构11更正常，纤维细胞很少。相比于对照组、CS-BSP MNs组和CS-AS MNs组，CS-AS-BSPMNs组治疗后的表皮和真皮的厚度较薄和平坦，细胞间隙分明，呈线性平行排列，杂乱结构少，炎症细胞浸润和成纤维细胞变少，形态接近于正常组织。结果表明：BSP具有显著的抗炎和伤口愈合作用，AS对瘢痕成纤维细胞有较强的抑制作用，BSP和AS的协同处理使伤口愈合迅速，治疗效果令人满意，21 天基本恢复正常无疤痕皮肤。
此外，Masson染色显示胶原蛋白沉积（图8A）。胶原蛋白是分布在细胞外基质中的结构蛋白，具有多种支撑、保护和营养等功能，染色后，胶原纤维呈蓝色，胞浆、肌肉组织等呈红色。Masson染色表明，CS-AS-BSP MNs组比CS-BSP MNs组或CS-AS MNs组的胶原沉积较为轻微但更广泛，胶原蛋白的排列更加有规律有序，与正常皮肤较为接近。表明CS-AS-BSPMNs组治疗显著改善了细胞外基质的重建和组织重塑，对创面的干预作用和对瘢痕的抑制作用较为明显。
采用免疫组化法进一步分析了CS-AS-BSP MNs对瘢痕组织中胶原蛋白的影响。TGF-β1在疤痕皮肤中的过表达也与疤痕的形成密切相关。减少疤痕形成的一个重要因素也可能是通过抑制TGF-β1在伤口部位的过度沉积。三组MNs处理可以抑制TGF-β1的沉积。然而，在比较结果时，CS-AS-BSP MNs具有最强的抑制作用（图8B-E），因此形成瘢痕的程度最弱。另外，瘢痕形成的明显特征是Ⅲ型胶原蛋白（Col Ⅲ）会向I型胶原蛋白（Col I）转换，因此Col I的过表达是疤痕形成的核心环节。通过免疫组化方法进一步分析了CS-AS-BSP MNs对瘢痕组织中胶原蛋白的影响。CS-BSP MNs组Col I的含量略高于对照组。CS-BSP MNs组沉积了大量Col I，BSP对Col I的抑制作用不明显。Col I在CS-AS-BSP MNs组中受到下调，有一定的抑制瘢痕的效果。上述结果表明，CS-AS-BSP MNs具有优越的治疗效果。

Claims (6)

1.一种具有瘢痕抑制和/或促伤口愈合作用的组合物，其特征在于：它是以积雪草苷复合物和白及多糖为活性成分，加上药物载体制备而成的微针；
所述微针是由如下原料制备而成：
积雪草苷复合物0.12份、白及多糖1份、壳聚糖1.2~1.5份；
所述微针的制备方法包括如下步骤：
a)按配比称取原料，取壳聚糖，加乙酸水溶液溶解，再加积雪草苷复合物溶解，倒入微针模具中，离心，干燥得壳聚糖载积雪草苷微针；
b)取白及多糖加水制成白及多糖溶液，倒入a)所得壳聚糖载积雪草苷微针上，凝固后脱模得壳聚糖载积雪草苷-白及多糖双层微针；
所述积雪草苷复合物是积雪草苷溶解于2-羟丙基-β-环糊精溶液中，再过滤干燥的固体；所述固体中积雪草苷与2-羟丙基-β-环糊精的摩尔比为0.1~0.8：1。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述过滤干燥时过滤的孔径为0.45 μm，干燥为冷冻干燥，温度-80±2°C，时间24小时。
3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述微针是由如下原料制备而成：
积雪草苷复合物0.12份、白及多糖1份、壳聚糖1.2份。
4.一种制备权利要求1~3任一项所述组合物的方法，其特征在于：它包括如下步骤：
1）按配比称取原料，取壳聚糖，加乙酸水溶液溶解，再加积雪草苷复合物溶解，倒入微针模具中，离心，干燥得壳聚糖载积雪草苷微针；
2）取白及多糖加水制成白及多糖溶液，倒入步骤1）所得壳聚糖载积雪草苷微针上，凝固后脱模得壳聚糖载积雪草苷-白及多糖双层微针。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤1）所述壳聚糖与乙酸水溶液的质量体积比为6~8g：100ml；所述乙酸水溶液中乙酸浓度为2%，v/v；所述离心的速度为4000rpm，时间为15分钟；所述干燥温度为20~30℃；步骤2）所述白及多糖溶液中白及多糖浓度为4%，w/v；凝固成凝胶状再脱模。
6.权利要求1~3任一项所述组合物在制备药物中的用途，其特征在于：所述药物是防治瘢痕和/或促进伤口愈合的药物。
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