CN114129506A - 载积雪草苷微针及其在促进创面愈合中的应用 - Google Patents

Abstract

一种载积雪草苷微针，包括支撑层和微针，包括MXenes、AS和γ‑PGA共混物，实现AS在真皮中的控制和长期释放。本发明提供的微针贴片具有促进细胞迁移和血管生成的能力，实现高效的伤口愈合能力，有效促进糖尿病患者的创面愈合。

Description

载积雪草苷微针及其在促进创面愈合中的应用

技术领域

本发明涉及一种由生物材料制造的医疗器械，尤其涉及一种具有微针的贴片，其上还载有积雪草苷，用于促进伤口，尤其是糖尿病患者伤口的愈合。

背景技术

慢性不愈合伤口是全球健康和经济的主要威胁之一。约15％至25％的糖尿病患者在其一生中会出现糖尿病足溃疡(DFU)。DFU多由神经血管反应减退和多重耐药细菌感染引起，常伴有高发病率和死亡率，患者通常面临截肢和住院的风险。全球DFU的年发病率在910万至2610万之间。目前，科学对复杂伤口愈合过程的了解仍然有限，对慢性不愈合DFU病的有效治疗仍然难以捉摸。因此，迫切需要开发新的促进伤口愈合的有效策略。

积雪草苷(AS)具有促进上皮化、诱导成骨分化和破骨细胞生成、促进成纤维细胞增殖和血管生成的作用。AS已证明为一种非常有趣的双相作用药物，它不仅在炎症期促进血管生成，还会在重塑期削弱血管生成，从而达到动态调控伤口闭合。由于这种对创面的特殊作用，AS在促进慢性创面愈合方面非常实用。

目前尚没有一个有效的经皮给药系统，由各种原因导致皮肤疾病的患者，往往不能达到令人满意的一期愈合。比如：对于治疗糖尿病性皮肤病，目前最常见的给药方式是涂片，包括应用脱细胞真皮基质(ADM)、静电纺丝纳米纤维等等，但这些方法都无法做到穿透角质层并高效、快速地给药。因此，寻找更好的给药方法是促进糖尿病足患者的皮肤再生中一项不可避免的工作。

有研究证明，微针(MN)是一种有效的给药的系统，其由于优点诸多而广泛应用于多个医疗领域，如提供避孕药、胰岛素、胰高血糖素和干细胞治疗。MN作为一种透皮给药系统，其特点是能穿透角质层，从而达到理想的给药深度和更快的给药速度，并且它还具有良好的生物降解性。当MN的针尖长度在1mm以内时，只会产生极小的疼痛，甚至是无痛。同时，通过负载不同的材料，MN可以用于各种方面。因此，快速溶解且基于水凝胶的微针越来越受欢迎。

传统上，人们多采用以高分子化合物为基础水凝胶，如聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)。而PLGA的生物降解性较低，需要近2周才能完全溶解。但是，包括细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的组成成分透明质酸(hyaluronic acid)在内的生物聚合物，则具有更好的生物相容性和生物降解性，因此也更适合应用于微针。我们在之前的研究中，成功证明了γ-PGA水凝胶和基于γ-PGA水凝胶的MN(MN-PGA)在促进糖尿病创面愈合中的效果。由于其生物降解性、生物相容性、可食性和良好的机械性能，亲水聚合物聚谷氨酸(γ-谷氨酸)(γ-PGA)在总体上是优于透明质酸的。同时，与PLGA相比，γ-PGA具有更好的生物可降解性，其可在20min内降解。此外，γ-PGA不仅可为伤口愈合提供湿润的微环境，还可以模拟糖胺聚糖的生物功能，包括生物活性因子和蛋白的传递、代谢产物的排出等。

然而，微针的给药效果受其溶解时间和机械强度限制，机械强度差的MN极有可能无法穿透角质层。基于γ-PGA的MN通常具有一定的机械强度，但仍然不能如预期的那样完全穿透角质层。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种微针贴片，利于刺破角质层，用于伤口，促进愈合。

本发明的另一个目的在于提供一种微针贴片，其上载有积雪草苷，用于伤口，促进愈合。

本发明的再一个目的在于提供一种微针贴片，实现积雪草苷的缓释给药，利于创面的愈合。

本发明的又一个目的在于提供一种微针贴片，其上载有积雪草苷，用于糖尿病足溃疡，促进愈合。

MXenes材料是一类具有二维层状结构的金属碳化物和金属氮化物材料，作为新一代的能源材料，被誉为最具发展前景的下一代储能材料。其中较为常见的是碳化钛MXenes(Ti₂C₃ MXenes)纳米片。MXenes具有良好的生物相容性，对正常细胞系无任何细胞毒性。在生物领域，MXenes主要用于协同化疗的抗癌治疗，生物成像和超灵敏检测。MXenes不仅具有优异的机械陶瓷性质，表现出优异的力学性能，而且具有显著的载药能力，有实验证明其载药率可超过200％。

因此，本发明将基于γ-PGA的MN与Ti₂C₃ MXenes结合形成由两种材料复合的微针贴片(MN-MXenes)，再以MXenes载药，制得载积雪草苷的微针贴片(MN-MXenes-AS)。

一方面，MXenes为厚度控制在2nm之内的单层纳米片层结构，其在作为载药系统的同时，可使得基于γ-PGA的MN的机械强度进一步提高，保证MN能穿透角质层，并且实现皮下给药和更长时间的释放AS。

另一方面，基于MXenes的MN用于AS的缓释(MN-MXenes-AS)，AS用作促进细胞增殖和调控血管生成的主要治疗药物，以达到加速慢性伤口愈合。

一种微针贴片，包括支撑层和微针，包括MXenes、AS和γ-PGA共混物，以实现AS在真皮中的控制和长期释放。

MXenes与γ-PGA重量比值为0.117～0.170以利于AS的释放。

另一种微针贴片，包括MXenes、AS和γ-PGA，AS负载于MXenes上，MXenes与γ-PGA共混。

将MXenes-AS混入γ-PGA水凝胶(γ-PGA与溶液比例为0.583wt％，MXenes-AS：ddH₂O＝10％)中以得到MXenes-AS水凝胶，其颜色比γ-PGA水凝胶的颜色深。然后将MXenes-AS水凝胶注入微针模具中，烘干(如：40℃，40min)，其在脱模后即可成为具有理想机械强度的微针。

制得的MXenes-AS水凝胶中，MXenes浓度为0.04mg/ml～0.06mg/ml；γ-PGA浓度为0.570wt％～0.590wt％。

AS的用量根据所需加入，比如：0.02mg/ml、0.05mg/ml、0.08mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml、5.0mg/ml10.0mg/ml和12.0mg/ml等

实验证明，MXenes-AS均匀分布在γ-PGA水凝胶中，并且MN-MXenes-AS可在20min内由体液降解并释放AS。

该微针能够实现AS的长期(15日以上)缓释，并能促进毛细血管生成，提高伤口愈合能力，尤其是促进糖尿病患者伤口愈合。以其为医疗器械，为药物提供了有效的经皮给药系统，使得皮肤疾病的患者得到持续的医治。

附图说明

图1为MN-MXenes-AS微针贴片不同角度的SEM图；

图2为MN-MXenes-AS微针贴片的降解状态SEM图；

图3为MN-PGA和MN-MXenes-AS强度比较结果图；

图4为AS、MXenes和MXenes-AS的吸收光谱图；

图5为载有AS各种介质于溶液中的释放情况图；

图6为MN贴片插入深度的荧光实验结果图；

图7为MN-MXenes-AS的体外细胞活力、迁移和细胞毒性试验结果图；

图8为采用不同方案对糖尿病创面实施治疗的结果图；

图9为治疗后组织再生情况表征结果图；

图10为采用不同方案对糖尿病创面实施治疗14天后的anti-CD31和anti-ki67荧光染色图；

图11为采用不同方案对糖尿病创面实施治疗14天后anti-ki67荧光染色表明的细胞增殖统计图(n＝3，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001)；

图12为为采用不同方案对糖尿病创面实施治疗14天后anti-CD31荧光染色表明的毛细血管密度统计图(n＝3，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001)。

具体实施方式

以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

本发明以下实施例所用的各项试验方法具体说明如下：

1)化学试剂与材料

γ-PGA(Mw＝1000-15000)购自赛泰思生物科技有限公司(中国)。

积雪草苷(AS)购自阿拉丁(中国)。

吲哚菁绿(ICG)购自澳洲生物科技(杭州，中国)。

微针贴片模具由购于Micropoint Technologies Pte.Ltd.(Singapore)的聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成。每个模具有10×10阵列，尺寸为200μm×200μm×500μm(W×L×H)。

DMEM细胞培养液和胎牛血清(FBS)购自英国Gibco公司。

CCK-8试剂购自Dojindo分子技术公司(Rockville，MD，USA)。

2)MN贴片的表征

在显微镜下(尼康ECLIPSE E 100，尼康公司，日本)观察并比较其形态特征。

3)细胞分离提取与培养

从10日龄的小鼠背部皮肤中分离成纤维细胞。首先，通过过量注射4％水合氯醛，处死小鼠。其次，在小鼠浸泡于75％乙醇中达10秒并用碘消毒背部皮肤5次后，取其背部皮肤组织并轻轻切碎，而后将切碎的组织放入50ml I型胶原酶(浓度占细胞培养基的0.2％)中在37℃下消化2小时。最后在1500rpm的离心机中离心5min(37℃)得到成纤维细胞沉淀。细胞混合适量高糖DMEM和10％胎牛血清在37℃，5％CO₂的培养箱中培养。HUVEC(血管内皮细胞系，购于中国科学院细胞库/干细胞库)培养于同样条件下。

4)CCK-8检测

CCK-8试剂用于检测MXenes-AS的细胞毒性。将成纤维细胞以每孔1000个细胞的密度置于96孔板中，并分为5组。然后各组细胞或与100μl细胞培养液共培养，或与混合了10μlMN-PGA浸提液、MN-MXenes浸提液或MN-MXenes-AS浸提液的90μl细胞培养基共培养。于共培养的第三天，向每孔加入10μl cck-8溶液以及90ul细胞培养液，置于培养箱中(37℃，5％CO₂)孵育2h。最后，用酶标仪(SpectraMAX iD3，MolecularDevices)测量96孔板的OD值并使用GraphPad对结果进行统计分析，以检测细胞活力。检测AS最佳浓度的实验方法基本一致，除成纤维细胞与不同浓度的AS溶液共培养(0、5、15、30、45、60和80μg/ml)外，其余步骤相同。

5)活/死细胞双染色

将HUVEC以40×10⁴个细胞/皿的密度种于共聚焦皿中，并分为5组，各组细胞分别与MN-PGA、MN-MXenes、MN-AS和MN-MXenes-AS共培养24h或72h。Calcein-AM/PI试剂(Yeasen，Shanghai)根据制造商的说明制备。共培养达指定时间后，除去上清液，于每个共聚焦培养皿中加入300μl染色剂，放入培养箱(37℃，5％CO₂)中孵育15min。随后，用共聚焦显微镜(Leica SP5，Leica Camera AG，Germany)对细胞荧光进行拍照和记录。

6)MN-MXenes-AS中AS的释放曲线

将不同浓度的AS溶解在PBS中，测定其OD值，得到标准曲线。然后将AS，MN-AS和MN-MXenes-AS分别放入透析袋，浸泡在PBS达12天，每天从透析袋外面取其透析液。各组分别检测其OD值并进行分析。

7)体外迁移实验

将成纤维细胞分为3组种于6孔板中。在成纤维细胞完全铺满每一个孔后，在孔的中间位置划痕。各组细胞分别用含有500ul AS溶液(15μg/ml)或500ulMN-MXenes-AS浸提液的培养基，或着纯培养基培养。在共培养的0h、6h、12h和24h，用显微镜拍摄成纤维细胞的迁移形态。

8)小鼠模型的建立及MN体内促进创面愈合的效果检测

采用糖尿病(db/db)小鼠(南京大学-南京生物医学研究所，中国)制作糖尿病创面模型。在小鼠麻醉、剃毛后，于每只小鼠的背部皮肤剪出一个直径为6mm的圆形伤口。将20只小鼠随机分为5组(对照组、MN-PGA组、MN-MXenes组、MN-AS组和MN-MXenes-AS组)进行不同的治疗。对照组无治疗措施，其他各组小鼠用相应的MN贴片治疗，在微针针尖完全溶解后取下MN垫层(约20min)。分别于术后0、3、5、7、10、12和14天对小鼠的创面进行拍照记录。

9)组织学及免疫组织化学染色

在治疗后第14天，用过量的4％水合氯醛处死小鼠。取伤口及其周围皮肤组织，用4％多聚甲醛浸泡24h，包埋蜡块并切成5μm厚切片进行组织学染色。采用苏木精和伊红(H&E)染色和马松(Masson)染色观察创面愈合过程中肉芽组织和胶原的形成。免疫组化的操作步骤为，在样本中加入兔单克隆抗cd31和抗ki67抗体(ab182981；Abcam，1∶300)，4℃孵育过夜。免疫荧光染色的操作步骤为，样本置于10％的正常血清阻断液(3％牛血清白蛋白和0.1％Triton X-100和0.05％Tween-20)中，在25℃下阻断2小时。清洗后的样品与anti-CD31和anto-ki67在4℃孵育过夜。

实施例1 MXenes-AS水凝胶的制备

第一步，将AS负载于MXenes上。将1ml分散于ddH₂O中的MXenes溶液(1mg/ml)混入1ml AS(2mg/ml)溶液中。为了得到更好的混合液，首先将混合物超声处理10分钟，然后搅拌24h。

第二，制备MXenes-AS均分散于其中的水凝胶，将350mgγ-PGA溶解在600μlddH₂O中，其中10％为上述混合物(60μl MXenes-AS)。然后将混合水凝胶在4℃下超声混匀30分钟(SK 1200BT，KUDOS，Shanghai，China)。

这些实施例中使用的MXenes为单层纳米片层结构。期间，利用TEM和AFM对MXenes进行表征，表明其厚度控制在2nm之内。

微针模具为10×10阵列。针的形状为四棱锥，其大小为200μm×200μm×500μm(W×L×H)。

实施例2MN贴片的制备

在微针模具中加入约40μl MXenes-AS水凝胶，抽真空5min使其完全填充到微针针尖上(YB-FD-1，Shanghai，China)。用枪头擦拭模具边缘因抽真空而溢出的水凝胶，然后在垫层中加入适量的MXenes-AS水凝胶，使微针具有理想的厚度。随后，将填满水凝胶的微针模具放入烘干烘箱中(40℃)至少40min，直至微针达到一定硬度。干燥的微针置于微型泵中，以便更好的保存和进一步干燥、硬化。最后将MN脱模即得，如图1所示。

AS水凝胶(MN-AS)、MXenes水凝胶(MN-MXenes)和γ-PGA水凝胶(MN-PGA)制成的微针的遵循相同的工艺流程。

图3所示，负载于该微针中的MXenes，在实现载药的同时提高了机械强度。因此，我们将MN-PGA和MN-MXenes-AS的微观形貌和机械强度分别用SEM和机械测试仪器进行了比较。显而易见，MN-MXenes-AS脱模后的有更好的形态且更容易保存，机械强度也高于MN-PGA。MN-PGA和MN-MXenes-AS在不同湿度和温度下的形貌也利用SEM进行了检测与比较。应用于临床医学的MN不仅要有足够的机械强度，而且还要具有良好的生物降解性。这就需要对MN降解所需的时间进行测试。如图2所示，实验证明，MN能够在20min(75％湿度，25℃)内降解，满足其在临床治疗方面应用的需求。

除了上述的形态表征，性能测量也很重要。为了判断AS是否与MXenes充分结合，检测了AS、MXenes和MXenes-AS的吸收峰，如图4所示，其差异表明AS和MXenes已结合在一起。测试了AS浸泡在不同材料中12天的释放情况，如图5所示。结果表明，MN-MXenes-AS有效延长了AS的释放时间，实现了AS的缓释。

实施例3MN插入深度的荧光实验

添加了MXenes的MN比不添加MXenes的MN具有更好的形貌和机械强度。然而，这并不能保证MN-MXenes-AS能穿透角质层。因为猪的皮肤和人的皮肤有相似的密度和角质层厚度，因此我们使用成年猪背部的一块皮肤组织来测试MN-MXenes-AS的机械强度。为了使结果更直观，我们将有荧光作用的吲哚菁绿(ICG)加入MN，随后将其插入猪皮。在MN的尖端溶解、去除MN的垫层后，使用高清荧光内窥镜系统(OptoMedic 2100系列)在与水平方向呈0°、45°和90°角度拍摄图像，分别参见图6D、图6E和图6F。皮下组织有荧光出现证实了MN-MXenes-AS可穿透角质层给药。该实验充分证明了MN-MXenes-AS具有足够的机械强度，能够穿透一定厚度的角质层。

实施例4 MN-MXenes-AS的体外细胞活力、迁移和细胞毒性

生物支架材料通常要求具有一定的促生长性能，且不具有明显的细胞毒性。因此，我们运用了HUVEC和成纤维细胞进行细胞毒性检测。HUVEC分为5组，分别与MN-PGA、MN-AS、MN-MXenes和MN-MXenes-AS浸提液共培养1天或3天。利用活/死细胞双染色试剂对细胞进行染色后，采用共聚焦拍照记录，如图7A。结果表明，与不同类型MN共培养时，HUVEC均能正常生长，因此MN-MXenes-AS贴片中的各种成分对HUVEC几乎没有细胞毒性。成纤维细胞则运用于CCK-8实验中，如图7B和图7C所示，数据统计也反映了这三种组成MN的材料对成纤维细胞没有明显的细胞毒性，而AS在促进细胞生长方面与对照组有统计学差异。

为检测何种浓度的AS溶液促进细胞生长最有效，将成纤维细胞与不同浓度的AS溶液(0，5，15，30，45，60，80μg/ml)共培养。结果表明，AS浓度高达80μg/ml时也没有明显的细胞毒性。同时，与浓度为5-30μg/ml的AS溶液共培养的细胞，其细胞活力与对照组的相比有统计学差异。我们利用体外细胞迁移实验，探讨了AS促生长的机制。将成纤维细胞接种于6孔板，并分为3组。于每孔中间划痕后，成纤维细胞与AS溶液(15μg/ml)、MN-MXenes-AS浸提液或无材料(对照组)共培养。于共培养0h、6h、12h、24h后，用显微镜拍摄了各组的代表性图像，如图7D所示。事实证明，AS溶液和MN-MXenes-AS浸提液确实可以提高成纤维细胞的迁移能力。

实施例5糖尿病小鼠体内创面愈合评价

以10日龄的糖尿病小鼠为实验对象，检测了MN-MXenes-AS在体内治疗糖尿病创面的效果。麻醉以及剃毛后，在每只老鼠的背部皮肤组织上剪出一个直径为6mm的创口。将手术后的糖尿病小鼠随机分为5组，分别给予不同MN治疗(MN-PGA、MN-AS、MN-MXenes和MN-MXenes-AS)或不给予治疗。待微针针尖完全溶解(约20min)后，去除垫层。术后0、3、5、7、10、12以及14天进行拍照，以观察创面变化情况。结果表明，相较于采用MN-PGA治疗或不进行任何治疗的小鼠，采用了MN-AS和MN-MXenes-AS治疗的糖尿病小鼠获得了更好的创面闭合。因此，MN-MXenes-AS是一种有效的治疗方法。

实施例6治疗后组织再生和血管生成的研究

H&E染色反映了创面处肉芽和上皮形成过程，Masson染色显示胶原沉积和血管生成过程。如图9所示，通过各组比较可见，MN-AS和MN-MXenes-AS治疗组的创面胶原形成更好，从而实现了更好的创面闭合。此外，组织切片染色显示MN-MXenes-AS的插入深度约为400μm。

如图9和图10所示，采用免疫组织化学和免疫荧光CD31、ki67染色检测各组新生毛细血管密度和细胞增殖情况。利用抗CD31和抗ki67免疫荧光染色的切片图，对细胞增殖率和毛细血管密度进行定量分析与统计，以更明确的表现出组间差异，结果如图11和图12所示。统计数据表明，相比于利用MN-PGA治疗或不治疗的小鼠，使用MN-MXenes-AS治疗的小鼠在细胞增殖和毛细血管增生方面均存在着有统计学差异的提高。

Claims (10)

1.一种微针贴片，包括支撑层和微针，其特征在于包括MXenes、AS和γ-PGA共混物，实现AS在真皮中的控制和长期释放。

2.根据权利要求1所述的微针贴片，其特征在于所述微针的针尖含有MXenes、AS和γ-PGA。

3.根据权利要求1所述的微针贴片，其特征在于所述MXenes与γ-PGA重量比值为0.117～0.170。

4.根据权利要求1所述的微针贴片，其特征在于先制得MXenes与AS的共混溶液。

5.根据权利要求1所述的微针贴片，其特征在于先制得MXenes与AS的共混溶液后，再与γ-PGA溶液共混，制得水凝胶；其中MXenes浓度为0.04mg/ml～0.06mg/ml，。

6.根据权利要求5所述的微针贴片，其特征在于γ-PGA浓度为0.570wt％～0.590wt％。

7.根据权利要求1所述的微针贴片在制造用于促进血管生成的产品中的应用。

8.根据权利要求1所述的微针贴片在制造用于提高伤口愈合能力的产品中的应用。

9.根据权利要求1所述的微针贴片在制造用于促进糖尿病患者伤口愈合医疗器械中的应用。

10.一种医疗器械，包括权利要求1～6之一所述的微针贴片。

Images