CN109731129A - 一种白及复合止血海绵及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种白及复合止血海绵及其制备方法，通过氧化石墨烯和白及多糖制备，工艺简单，操作方便，原料来源广泛且成本低，制得的石墨烯/白及多糖复合止血海绵止血性能优异，止血速度快，具有良好的细胞相容性和生物安全性，可直接用于医疗止血，也可以用于其它止血材料的生产。

Description

一种白及复合止血海绵及其制备方法

技术领域

本发明涉及材料领域，特别是涉及止血材料。

背景技术

在战争、车祸和自然灾害发生及外科手术时，人体创伤止血时间是拯救生命的关键。在日常生活中，意外损伤的伤口出血，小型的人体可以自行止血，如果伤口较深或较大，则需要去医院进行处理，这个过程中及时使用快速止血材料，也是保护的重要措施。

合适的止血材料能明显缩短手术时间，对创伤或术后恢复至关重要。止血海绵因其使用的方便性已被广泛使用，但现在的产品仍然存在价格较贵、止血所需时间较长等缺点。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种白及复合止血海绵，能够快速止血，安全性好。

为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：

一种材料，包括以下重量份的组分：石墨烯1～5份，植物多糖1～250份；其中，所述植物为兰科白及属植物。

本发明中所述兰科白及属植物主要包括以下几种：

(1)小白及Bletillaformosana(Hayata)Schltr.

(2)黄花白及Bletillaochracea Schltr.

(3)华白及Bletillasinensis(Rolfe)Schltr.

(4)白及Bletillastriata(Thunb.ex A.Murray)Rchb.f.。

进一步地，包括以下重量份的组分：石墨烯1～5份，植物多糖1～50份。

进一步地，包括以下重量份的组分：石墨烯1份，植物多糖1～15份。

进一步地，包括以下重量份的组分：石墨烯1份，植物多糖1～10份。

进一步地，包括以下重量份的组分：石墨烯1份，植物多糖1～5份。进一步地，所述石墨烯为氧化石墨烯。

进一步地，所述植物多糖中，多糖含量在30％以上。其中的白及多糖可以通过购买市售产品获得，也可以通过现有技术制备得到，多糖纯度可为30～40％、40～50％、50～60％、60～70％、70～80％、80％～90％、90％～95％等。

本发明一个具体实施方式中，进一步选自30～80％；更进一步选自34～70％。

将本发明材料进行检测，得到如下结果：

其中，所述材料在3428.04～3419.17cm^-1、1739.48～1731.78cm^-1、1631.48～1644.98cm^-1、1406.54～1395.33cm^-1、1235.51～1249.53cm^-1、1106.54～1056.07cm^-1处有红外吸收峰。

其中，所述材料的拉曼光谱在1588～1592cm^-1、1341cm^-1处分别出峰。

其中，所述1341cm^-1处的峰强度与1588～1592cm^-1处的峰强度比值为1.00～1.03。

其中，所述材料的电势为-27.3±0.9mV。

其中，所述材料的孔隙率为大于90％。

本发明还提供一种上述材料的制备方法，包括以下步骤：取植物多糖和石墨烯按所需重量比混合即得。

具体操作为：将植物多糖、石墨烯在溶液中混合，经过冷冻干燥或真空干燥制备得到所述材料。

石墨烯和植物多糖可以是物理混合，也可以通过化学反应键合。

进一步地，所述溶液混合冷冻干燥方法包括下列内容：将植物多糖溶液与石墨烯溶液混合后经冷冻干燥即得。

进一步地，将植物多糖溶液与石墨烯溶液混合后，搅拌3～5h后冷冻10～20h，再进行冷冻干燥。

进一步地，所述冷冻的条件为-70℃～-90℃的温度范围内冷冻10～20h。

进一步地，所述冷冻的条件为-80℃的温度范围内冷冻12h。

进一步地，所述冷冻干燥的时间为40～50h。

进一步地，所述冷冻干燥的时间为48h。

本发明还提供一种上述材料在制备止血材料中的用途。

实际应用中，该材料可直接用作止血材料，也可在该材料的基础上加入一些其它的止血用品，包括但不限于用于止血的化学药物、止血中药、止血纱布等其他止血材料，即可生产出多种止血产品。

本发明还提供了一种降低石墨烯生物毒性的方法：将石墨烯与植物多糖混合。

进一步地，所述植物为兰科白及属植物。

本发明的有益效果是：

(1)本发明白及复合止血海绵组分简单，成本低廉，止血效果好，生物相容性好，安全性高。

(2)本发明白及复合止血海绵的制备工艺简单，可大规模生产。

附图说明

图1是本发明BGCS海绵的形态示意图；(a)BGCS实物图(直径3cm，厚2cm)，(b)BGCS横截面，(c)BGCS内部多孔结构的SEM图像，(d)多孔结构的光滑细胞壁；

图2是本发明相关表征谱图；(a)Bsp、GO和BGCS的FT-IR光谱，(b)GO和BGCS海绵的RAMAN谱图，(c)GO和BGCS海绵的XRD谱图，(d)GO和BGCS海绵的Zeta电位测试；

图3是GO和BGCS-N海绵的孔隙率(a)和吸水率(b)；

图4是(a)GO、BGCS-N的体外动态全血凝固评价(n＝3)；(b)在30秒时间点相应的各实验组血红蛋白水溶液实物图；

图5是(a)大鼠断尾模型，(b)对照组纱布海绵止血10分钟时的状态，(c)BGCS按压在鼠尾创面进行止血，(d)BGCS止血效果图，(e)GO和BGCS海绵的止血时间和失血量数据统计，数据值对应于平均值±标准差(n＝6)，*表示与GO海绵相比，P＜0.05；

图6是血细胞与BGCS相互作用的扫描电镜图像；血细胞(a)和血小板(b)选择性地粘附在BGCS表面，(c)一滴全血直接滴到BGCS上，血细胞被迫粘附在BGCS上；图中白色箭头表示形成的纤维蛋白；

图7是BGCS、GO和Bsp的溶血试验图；(+)和(-)符号分别代表阳性和阴性对照组，数据值对应于平均值±标准差(n＝3)；

图8是L-929小鼠成纤维细胞在不同浓度(15.63-250gg/mL)的GO、BGCS和Bsp孵育24小时后，CCK-8测定其细胞存活率；数据代表平均值±标准差，*P＜0.05表示与BGCS相比存在显着差异。

具体实施方式

本发明中使用的白及多糖和氧化石墨烯，可以通过购买市售产品获得，也可以通过现有技术制备得到，例如本发明实施例1～3的方法。

当然，本发明实施例中制备植物多糖和氧化石墨烯的方法，仅仅是现有技术中多种制备方法中的一种。只要能够成功制备出满足本发明要求的植物多糖和氧化石墨烯的方法，均可用于本发明的制备，不限于本发明中实施例所述方法。

下述实施例的技术方案不应当被理解为是对本发明保护范围的限制，其仅是对本发明的举例说明。

实施例1白及多糖(Bletilla striata polysaccharide，Bsp)的制备

从白及中提取白及多糖，其提取过程如下：

(1)脱脂

取粉碎的白及药材，95％乙醇浸泡，60℃回流提取，其后过滤、挥干，再用石油醚回流提取，其后过滤，挥干，得到脱脂粉；

(2)水提

脱脂粉在水中70℃搅拌提取，过滤后合并滤液，将滤液浓缩至1/3得到水提液；

(3)脱蛋白

采用Sevage法脱蛋白。

(4)醇沉

将脱蛋白液继续浓缩，待冷却后加入95％乙醇，慢加快搅，进行醇沉多糖，其后于4℃下冷藏12h，再过滤，将沉淀物用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，即得到精制白及多糖。

所得白及多糖的纯度范围为34～70％。

实施例2氧化石墨烯(graphene oxide，GO)的制备

(1)石墨预氧化

称取3g石墨粉，过硫酸钾2.5g，五氧化二磷2.5g加入到12mL浓硫酸中，在水浴80℃下反应4.5h，然后冷却至室温并用500mL去离子水稀释，过夜，抽滤，并用去离子水洗涤3次，以除去残留的酸，产物放入真空干燥箱中干燥。

(2)氧化石墨的制备

将预处理后的石墨加入到120mL浓硫酸中，在不断搅拌下慢慢加入高锰酸钾15g，混合物在水浴35℃下反应2h，随后加入250mL去离子水并搅拌2h，再加入500mL去离子水和20mL 30％的过氧化氢。分散液呈亮黄色，并伴随产生大量气泡，抽滤，用1∶10的稀盐酸溶液洗涤三次，除去大部分金属离子。

(3)氧化石墨烯的制备

将氧化石墨用二次水透析7天，除去残留的金属离子，将透析后的氧化石墨配制成10mg/ml浓度的水溶液，并在超声清洗器中进行超声处理30min，(频率40KHz，功率50w)，得到黄褐色的均一分散的单层GO溶液。

实施例3氧化石墨烯(graphene oxide，GO)的制备

石墨预氧化：石墨粉6g，五氧化二磷5g，过硫酸钾5g加入装有24mL的烧杯中，水浴80℃下反应4.5h后冷却至室温，然后将反应体系加入到1000mL水中进行稀释、抽滤。产物放入真空干燥箱中干燥。

氧化石墨制备：将预处理的石墨加入到240mL浓硫酸中，搅拌下加入高锰酸钾30g，水浴35℃反应2h后加入到500mL纯水，搅拌2h后加入到1000mL纯水中，滴加40mL过氧化氢(30％)。将混合物进行抽滤，用10％稀盐酸进行洗涤，除去大部分金属离子。

GO制备：将上述所得氧化石墨用超纯水透析一个星期，除去残留金属离子，在超声清洗器中进行超声处理2h，得到浓度为8mg/mL均一分散的单层GO溶液。

实施例4石墨烯/白及多糖复合海绵的制备

将氧化石墨烯和白及多糖按质量比为1∶50比例混合，制备石墨烯/白及多糖复合海绵，具体操作是：

取白及多糖溶液和GO溶液，在常温搅拌条件下，混合均匀，经过冷冻干燥或者真空干燥，得到复合海绵。

实施例5石墨烯/白及多糖复合海绵(Bsp-GO海绵)的制备及表征

(1)Bsp-GO海绵的制备

通过简单的溶液混合冷冻干燥方法制备Bsp-GO复合海绵(Bsp-GO海绵)：将Bsp溶解在去离子水中并使用磁力搅拌器搅拌12小时制备浓度为16mg/mL溶液，将Bsp溶液加入25mL烧杯中。然后，将GO溶液(8mg/mL)在搅拌条件下缓慢加入到Bsp溶液中，混合溶液的最终体积为15mL，将溶液搅拌1小时以上。将样品在-80℃条件下冷冻12h。将冷冻的样品，冷冻干燥48h，通过水的升华导致多孔结构的形成本发明Bsp-GO海绵。

通过改变Bsp与GO的质量比从1∶1、5∶1、10∶1到15∶1，分别制备得到BGCS、BGCS-5、BGCS-10和BGCS-15的溶液，在通过上述冷冻干燥的方法得到本发明对应型号的Bsp-GO海绵。

(2)材料表征

①使用扫描电子显微镜(SEM，Navo NanoSEM450)观察Bsp-GO海绵的内部形态，观察结果如图1所示。

从图1可以看出，图1a显示了通过Bsp修饰的GO制备的BGCS止血海绵，测量所得材料直径约为3cm，厚度约为2cm。切开海绵可以看出所制备的材料形成均匀，蓬松的多孔腔结构(图1b)，为其液体吸附能力奠定了良好的基础。其扫面电镜图如图1c和1d所示，BGCS表现出具有大量空腔的异质多孔结构，其孔径尺寸从数十至数百微米，形成的多孔网络在各层之间保持强烈的互连，海绵表面粗糙，具有大量皱纹纹理(图1d中用箭头标记)，表明Bsp可能粘附在GO上，它们被氢键交织在一起。

②使用红外光谱仪(IR，Magna-IR 750，Nicolet)，拉曼光谱(RAMAN，HoribaLabram HR Evolution)和X射线衍射(XRD，SmartLab(3))来研究Bsp-GO海绵的化学组成和结构特征，结果如图2所示。

GO中含有丰富的含氧基团，GO表面的亲水氧化官能团在改善GO与聚合物之间的相容性方面起关键作用。如图2a所示，3428.04cm^-1、1739.48cm^-1、1631.48cm^-1、1406.54cm^-1、1235.51em^-1、1106.54cm^-1处的信号是GO的特征峰。在3428.04cm^-1处对应的是-OH/-COOH基团的伸缩振动峰，在1739.48cm^-1处的吸收峰表明存在C＝O，在1631.48cm^-1处检测到典型的C＝C信号，C-O键通过在1406.54cm^-1(羧基C-O)，1235.51em^-1(环氧C-O)，1106.54cm^-1(环氧基或烷氧基C-O)等位置的峰表示。此外，对Bsp的FTIR谱图进行分析，3430.74cm^-1处的强宽峰对应于-OH的伸缩振动吸收峰，2937.93cm^-1处的峰表明C-H的不对称伸缩振动，1648.84cm^-1处的峰表明存在C＝O不对称伸缩振动吸收峰，在1743.47cm^-1处的峰表明Bsp中存在糖醛酸。呋喃糖苷的特征吸收带为1078.86cm^-1。811.06cm^-1和883.77cm^-1的信号代表甘露糖残基。当将Bsp加入GO中时，峰值在3428.04-3419.17cm^-1(OH伸缩振动)，1739.48-1731.78cm^-1(羧酸C＝O)，1631.48-1644.98cm^-1(芳香族C＝C)，1406.54-1395.33em^-1(羧基C-O)，1235.51-1249.53em^-1(环氧C-O)，1106.54-1056.07cm^-1(环氧或烷氧基C-O)并且变得更为尖锐，表明Bsp通过分子间氢键与GO相互作用，Bsp和GO具有良好的混溶性。

GO和BGCS的拉曼光谱如图2b所示，其显示出类似的峰结构，如双方G带(sp2碳原子的E2g模式)均约为1588cm^-1，D带约为1341cm^-1(对称A1g模式)。但BGCS的ID与IG的比率为1.01，高于GO的值(0.98)，表明Bsp和GO的组合增加了GO的无序性。与GO相比，由于BGCS中sp2碳原子含量较高，BGCS的G带呈现从1588cm^-1到1592cm^-1的蓝移，而这些sp2碳原子是通过部分还原GO的含氧基团产生的。此外，通过XRD进一步研究了BGCS的结构(图2c)。当GO通过与Bsp交联时，GO的特征衍射角(2θ)从10.4°降低到5.43°，这表明层间距从0.85nm增加到1.62nm，并且Bsp成功地插入到GO中，形成了一个特殊的夹层结构。

③通过Zeta电位(zetasizernano ZS)检测BGCS与GO的表面负电势。

Zeta电位测量表明了GO和BGCS的表面电荷密度。如图2d所示，GO的电势为-40.9±1.7mV，BGCS的电势为-27.3±0.9mV，略低于GO。由此表明，材料电势变化会降低GO的血栓形成毒性。同样，BGCS中的强电势可以激活血小板中的血液凝固因子，并加速血液凝固。

④孔隙率：采用乙醇置换法确定材料的孔隙率。

首先，将海绵干燥放入烘箱中干燥至恒重(W_s)。然后，将乙醇完全装满空瓶中，将总重量记为W₁，再将样品浸入乙醇中，进行超声波脱气直至孔隙被乙醇饱和，再次使用乙醇填充瓶子并称重(W₂)。用镊子将样品从乙醇中快速取出，然后测量瓶子重量和剩余乙醇(W₃)。所有样品均重复三次，孔隙率使用以下公式计算：

较高的孔隙率有利于止血材料吸收伤口表面的渗出物和进行气体交换。如图3a所示，GO海绵的孔隙率为96.5±1.11％，BGCS为95.3±0.49％。此外，随着Bsp的量进一步增加，复合海绵的孔隙率反而降低。但所有海绵的孔隙率均超过90％，海绵的孔隙率是决定其流体吸收能力的关键因素，孔隙率越高，越有利于液体吸收。

⑤吸水性测试：将海绵干燥放入烘箱中干燥至恒重，称量此时的重量为W₀，然后，将复合海绵充分浸入去离子水中，3分钟后将样品倾斜至60°直至没有水滴落下，用滤纸除去多余的液体，记录此时的重量(W₁)。对相同的样品进行三次测试，并使用以下等式计算吸水率：

众所周知，医用止血材料应当具备良好的液体吸收能力，止血材料可以通过快速吸收伤口表面的渗出物和血浆，从而加速血液凝固，促进止血。图3b显示GO海绵的吸水率为7972.81±451.01％。本发明Bsp-GO海绵的吸收能力与Bsp呈剂量依赖性，增加Bsp的剂量(Bsp/GO的比例从1∶1到15∶1，m/m)会削弱材料的吸收能力，与孔隙率结果分析相一致。因此，海绵的吸水性受孔隙度的影响，其多孔结构也是影响吸水能力的重要因素，此外，Bsp与GO混合后，使GO的分子链更为紧密，表面负电势减弱，从而降低了材料海绵的吸水能力。因此，BGCS(1∶1，m/m)的吸水率为5239.86±129.65％，具有最佳的吸附能力。

注：通过在GO中加入与BGCS中Bsp溶液相同量的水，来制备GO海绵。

实施例5止血性能评估

(1)体外动态凝血实验

为了评价BGCS的凝血能力，使用SD大鼠全血用于体外动态凝血试验。具体如下：将50μL的新鲜血液直接滴加到空白培养皿(阴性对照)，Ca²⁺(4μl CaCl₂溶液，0.2mol/L，阳性对照)，商业纱布海绵(1×1×0.25cm³)，GO海绵和BGCS-N(BGCS、BGCS-5、BGCS-10、BGCS-15)8个测试组中，使用相同尺寸(1×1×0.25cm³)的样品。每组分别反应30、60、120和240s。每次结束后，缓慢加入10mL蒸馏水以停止凝固过程并溶解未凝固红细胞中的血红蛋白。通过UV-可见分光光度计(UV 2400，SDPTOP)在542nm处测量每组上清液中的血红蛋白含量，并通过以下等式计算血红蛋白的含量：

血红蛋白含量＝I_s/I_r×100％

其中I_s是样品的吸光度，I_r是对照组的吸光度。测量50μL新鲜血液在10mL蒸馏水中的血红蛋白吸收作为对照组。该实验在相同条件下重复三次，结果见图4。

如图4a所示，在全血凝固试验期间，GO海绵和BGCS-N显示出比对照组(血液，纱布和血液+Ca²⁺)更低的吸光度值，表明本发明Bsp-GO海绵可以更加有效地促进血液凝固。在与全血接触的前30s中，GO海绵和BGCS-N的吸光度值远低于对照组，上清液中血红蛋白浓度的差异十分明显，溶液呈现出白色(图4b)。对比所有对照组，血液在约60秒后才开始凝固。而GO海绵和BGCS-N中的血液在30s时几乎完全凝固，从图4a中清晰看出，随着Bsp量的增加，血红蛋白吸光度随之增加，其中BGCS(1-5)的凝血效果与GO相当，BGCS-15血红蛋白含量略高，但仍远低于对照组。实验结果表明，当血液凝固剂尚未起作用时，本发明Bsp-GO海绵可加速血液凝固，具有优异的促凝血能力。此外，从实验结果可以看出，本发明的Bsp-GO海绵吸收血浆后是通过内源性凝血系统的激活和材料的表面电荷实现快速血液凝固。

(2)大鼠断尾实验：

通过构建大鼠尾截肢模型来检测所制备海绵的止血效果。健康的雄性SD大鼠(250±20g，7周龄)严格按照国家研究委员会关于实验动物护理和使用的指南进行治疗和护理3天，确保大鼠正常的生理状态。在手术前对大鼠进行称重，使用10％水合氯醛(0.5mL/100g)进行腹腔注射麻醉。使用手术剪切下6cm长的尾部，总长约为16cm，将GO、BGCS轻微按压在伤口部分。记录止血时间(s)和失血量(g)，使用商业纱布海绵作为对照组，在相同条件下进行实验操作，记录止血相关数据，测试六个平行组获得平均值。结果见图5。

将医用纱布海绵(图5b)用作对照组直接按压在鼠尾创面，纱布不会促进血液凝固，即使10分钟后，血液也只能通过按压来防止流出。然而，当BGCS轻微按压于鼠尾创面时(图5c)，BGCS可以快速吸收血液并在界面处迅速形成凝块进行止血(图5d)。如图5e所示，在6组平行出血实验中，BGCS的平均止血时间为45.9±4.6s，GO海绵的止血时间为35.6±5.6s，尽管BGCS的止血时间较GO海绵略长，BGCS仍然在止血方面发挥出色的作用。此外，使用BGCS时的平均失血量为0.063±0.016g，虽然略高于使用GO海绵的平均失血量(0.050±0.028g)，但其失血量仍属于有效止血的范围内。同时，本实验也研究了其他BGCS-N的止血性能。BGCS-5和BGCS-10的止血时间延长至54.8±11.6s和113.8±20.8s。随着Bsp的增加，材料的止血时间延长。实验结果表明，BGCS-N的止血时间增加与其孔隙率和表面电荷有关，因此确保BGCS的液体吸收能力和更高的电荷密度对于快速止血至关重要。

(3)止血机理研究

GO不能直接与血液相接触，但本发明经Bsp修饰的GO复合止血海绵材料可与血液直接接触并发挥出色的止血特性。为了阐明其止血机制，根据现有的常规方法对BGCS上的血细胞和血小板进行形态学研究。

①血细胞与血小板选择性粘附

将小块BGCS(1×1cm²，厚0.25cm)浸入10mL磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH 7.2-7.4)中并在37℃下浸泡2小时。加入0.5mL ACD抗凝全血或PRP，在37℃下孵育1小时。使用PBS冲洗样品三次，除去未粘附的血细胞和血小板，用2.5％的戊二醛溶液在4℃下固定2h。将样品用体积浓度为50％、60％、70％、80％、90％和100％乙醇梯度洗脱10min，使细胞脱水。在SEM观察之前完成冷冻干燥和金属喷涂过程。

②细胞形态学研究

对于血细胞形态学观察，将50μLACD抗凝全血滴加到BGCS(直径3cm，厚度2cm)表面上，将该材料在37℃下温育3分钟。使用PBS缓慢冲洗样品三次，除去未凝固的血浆，用2.5％的戊二醛溶液在4℃下固定2小时。将样品用体积浓度为50％、60％、70％、80％、90％和100％乙醇梯度洗脱10分钟，使细胞脱水。在SEM观察之前完成冷冻干燥和金属喷涂过程。

结果表明，当BGCS与PBS中的全血一起孵育时，BGCS不影响血细胞的形态，因为没有血细胞在BGCS的表面上变形或聚集(图6a)，该结果与溶血测定一致。相反，当BGCS与PBS中的PRP一起温育时，清楚地观察到血小板聚集在BGCS的表面上并改变它们的规则形状(图6b)。此外，当一滴全血直接滴在BGCS表面时，血浆迅速被BGCS吸收，大量血细胞积聚在表面形成微米级凝血块，如图6c所示，可以观察到的RBCs被形成的纤维蛋白覆盖并交联(白色箭头)。凝块形成期间RBCs的存在增加了凝块对纤维蛋白溶解的抗性，增加了纤维蛋白网络的异质性，并增强了血凝块的稳定性。

实施例5安全性评估

1.溶血实验

将新鲜抗凝血液(5ml)加入到10ml PBS中并以500g离心力离心10min，从血清中收集血红细胞(RBCs)，该纯化步骤重复4次，然后将获得的RBCs在磷酸盐缓冲溶液中稀释至50mL。为了测试BGCS、GO、Bsp的溶血活性，将0.2mL稀释的RBCs加入0.8mL不同浓度(7.8-500μg·mL-1)的PBS样品悬浮液中，溶液的浓度范围为7.8-500μg/mL。通过将样品粉末(通过玛瑙研钵粉碎)加入PBS并超声处理2h来制备样品的悬浮溶液。使用去离子水(+RBCs)和PBS(+RBCs)分别作为阳性对照组和阴性对照组。所有样品都在摇床上37℃孵育3h。温育后，将样品以10016g离心5min。用紫外分光光度计在540nm/655nm处测量血红蛋白吸光度。

根据下列公式计算溶血百分比：

其中abs_s540nm，abs_n540nm和abs_p540nm分别为样品、阴性对照和阳性对照的血红蛋白吸光度。

并将实验结果绘制成图表，见图7。将GO直接暴露于RBCs溶液中，可以看出GO会诱导血红细胞破裂，且溶血率与GO的剂量呈现出依赖性(图7)，250μg/mL剂量的GO会引发红细胞显现出60.9±4.0％溶血。该结果证实GO具有生物毒性并可能引起血栓形成。因此，即使在止血性能评估实验中氧化石墨烯的止血时间很短，仍然不能单独作为止血材料使用。

相反，用相同剂量的BGCS处理的RBCs没有显示溶血。即使当BGCS的剂量高达500μg/mL时，最大溶血率仍不超过2％。此外，现已知确认GO材料的光吸收对溶血测定的影响不大，因此BGCS材料的溶血率远低于GO的溶血率，证明Bsp修饰GO可明显提高其血液相容性。

2.细胞毒性评估

通过CCK-8评估BGCS对L-929小鼠成纤维细胞的细胞毒性。在完全培养基(CM)中将L-929细胞调整至1×10⁵个细胞/mL，完全培养基由90％DEME培养基，10％胎牛血清(FBS)和1％抗生素(100单位mL-¹青霉素和100单位mL^-1链霉素)组成。将细胞悬浮液加入到96孔板(每孔100μL)中，并在37℃，5％CO₂的条件下孵育24小时。然后，用PBS洗涤细胞两次，并将不同浓度的BGCS，GO或Bsp悬浮液(15.63-250μg/mL)加入板中以替换原始CM，阴性对照组细胞未接受任何材料处理。用上述方法进行背景实验。孵育24小时后，向每个孔中加入10μLCCK-8溶液孵育4小时，使用移液枪将80μL上清液转移到另一个96孔板中。使用iMark酶标仪在450nm/655nm处测量混合物溶液的光密度(OD)。细胞活力表示为百分比，如下式所示：

其中，OD_test为样品孔的光密度，OD_blank与OD_{negative control}分别代表阴性对照孔和背景孔的光密度值。

如图8所示，将L929细胞用不同浓度的GO、BGCS和Bsp孵育24小时，其中GO浓度从15.63增加至250μg/mL，L929细胞活力呈现剂量依赖性从92.19±2.33％降低至57.96±3.03％，在BGCS的浓度从15.63增至250μg/mL，BGCS处理的细胞的细胞活力从98.86±1.96％降至78.41±4.04％，也呈现出剂量依赖性，但BGCS处理细胞的细胞存活率同GO处理的细胞相比显着增加(P＜0.05)。因此，使用Bsp修饰GO可明显降低其细胞毒性。

综上所述，本发明石墨烯/白及多糖复合止血海绵止血迅速，具有良好的细胞相容性，不具有生物毒性，安全有效，使用方便。本发明石墨烯/白及多糖复合止血海绵的制备工艺简单，原材料来源广泛且成本低，可大规模生产，产品可直接用于止血，还可应用于各种止血材料的制备，具有广阔的市场应用前景。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (11)

1.一种材料，其特征在于，包括以下重量份的组分：石墨烯1～5份，植物多糖1～250份；进一步地，所述植物为兰科自及属植物；更进一步地，所述兰科白及属植物选自小白及、黄花白及、华白及、白及中的一种或几种。

2.根据权利要求1所述的材料，其特征在于，包括以下重量份的组分：石墨烯1～5份，植物多糖1～50份；进一步选自石墨烯1份，植物多糖1～15份；更进一步选白石墨烯1份，植物多糖1～5份。

3.根据权利要求1或2所述的材料，其特征在于，所述石墨烯为氧化石墨烯。

4.根据权利要求1或2所述的材料，其特征在于，所述植物多糖中，多糖含量在30％以上；进一步选自30～80％；更进一步选自34～70％。

5.根据权利要求1～4任一项所述的材料，其特征在于，所述材料分别在3428.04～3419.17cm^-1、1739.48～1731.78cm^-1、1631.48～1644.98cm^-1、1406.54～1395.33cm^-1、1235.51～1249.53cm^-1、1106.54～1056.07cm^-1处有红外吸收峰。

6.根据权利要求1～4任一项所述的材料，其特征在于，所述材料的拉曼光谱在1588～1592cm^-1、1341cm^-1处分别出峰；进一步地，所述1341cm^-1处的峰强度与1588～1592cm^-1处的峰强度比值为1.00～1.03。

7.根据权利要求1～4任一项所述的材料，其特征在于，所述材料的电势为-27.3±0.9mV；进一步地，所述材料的孔隙率大于90％。

8.一种如权利要求1～7任一项所述的材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：取植物多糖和石墨烯按所需重量比混合即得。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，具体操作为：将植物多糖、石墨烯在溶液中混合，经过冷冻干燥或真空干燥制备得到所述材料。

10.权利要求1～7任一项所述材料在制备止血材料中的用途。

11.一种降低氧化石墨烯生物毒性的方法，其特征在于，将氧化石墨烯与植物多糖混合；进一步地，所述植物为兰科白及属植物。