CN107349457A - 一种胶原止血纤维的制备方法 - Google Patents

一种胶原止血纤维的制备方法 Download PDF

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CN107349457A CN201710483851.XA CN201710483851A CN107349457A CN 107349457 A CN107349457 A CN 107349457A CN 201710483851 A CN201710483851 A CN 201710483851A CN 107349457 A CN107349457 A CN 107349457A
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Abstract

本发明公开了一种胶原止血纤维的制备方法，包括以下步骤：S1：将小牛皮整理成细碎的皮片；S2：脱脂处理；S3：乙醇梯度脱水S4：粉碎S5：筛分S6：干燥交联。所得的胶原止血纤维，经过辐照灭菌后，成为非水溶性的局部止血剂。本发明所得的胶原止血纤维具有良好的生物相容性和低免疫原性；良好的力学强度，不会被水或者酸溶解，也不会溶胀呈凝胶，创面粘附性好，尤其针对不规则创面的止血，成品成短纤维、团状棉絮样，使用时不易散落，方便操作；同时具有很强的亲水性，吸液量高达16倍，能快速吸收血液或渗液，能封闭创面，促进血小板粘附形成血栓，从而达到快速长效止血的效果。

Description

一种胶原止血纤维的制备方法
技术领域
本发明涉及一种胶原止血纤维及其制备方法。所制得的胶原止血纤维，具有很强的亲水性，能迅速吸收血液或者渗液后，粘附于创面，加压不易脱落，能促进血小板的粘附形成血栓，进而快速长效止血。
背景技术
生物医学材料是近30年来发展起来的一类高技术新材料，其中的可吸收止血材料随着交通意外、重大灾害等事故的增多逐渐引起医学界的关注。随着现代科学技术的高速发展，各种止血材料的研究取得了非常快的进展，各种新型生物止血材料不断出现，性能也越来越优良。目前常用的止血材料有可吸收纤维蛋白胶、壳聚糖、可吸收性明胶海绵、-氰基丙烯酸酯、氧化纤维素和氧化再生纤维素等。止血效果确切、生物相容性好、能控制降解速率的生物医用止血材料成为人们研究和关注的主要对象。
胶原蛋白是生物体内含量最高的蛋白质，是细胞外基质的主要成份，它具有抗原性低、生物相容性好、可降解等优良性能。胶原蛋白是强烈的血小板聚集激动剂，通常认为，血管受损后暴露出内皮细胞下胶原，血小板粘附到胶原上是止血和血栓形成的关键步骤。胶原通过促进血小板粘附聚集和参与内源性凝血途径发挥止血功能。胶原已成为目前临床医学实践中主流的可吸收止血材料的主要成分。Ⅰ型胶原分子长度约300nm，直径约1.5nm，呈棒状，由两条α1链，一条α2链三条肽链以左手螺旋形式组成3螺旋结构。血小板表面的胶原受体通过识别胶原三螺旋结构中特异的氨基酸序列Gly-Pro-Hyp(GPO)，粘附到胶原上从而启动止血过程，三螺旋结构的保留程度对发挥此类材料的止血作用至关重要。
目前，关于胶原类或胶原复合类止血材料的研究和报道已越来越多。有研究报道(专利号CN1406628A)利用胶原纤维为原料，用醛类交联将其改性后，真空干燥粉碎成止血粉剂；年华等(专利号CN103721247A)以三七素、胶原、壳聚糖为原料，交联改性制成复合材料，冷冻干燥后粉碎成胶原基复合止血粉。使用醛类交联剂虽然能提高材料的力学和抗降解性能，但是醛类物质有一定的细胞毒性，又很难彻底清除，在使用过程中会引起机体的细胞毒性和免疫反应。朱楚红等(专利号102258802A)将胶原与一些具有消炎镇痛的中药(大黄中)复合制成新型敷料，具有止血、消炎镇痛多功能性，但是因其膜片结构，创面粘附性差，且不能很好地应用于不规则的创面。
综上所述，现有技术存在以下不足：
1、材料交联改性时使用醛类交联剂，交联剂的残留易引起细胞毒性和免疫反应；
2、材料力学性能不足，粘附性差，会给手术操作造成不必要的麻烦；
3、止血材料止血时间长、止血效果差，有的还具有一定的免疫原性；
4、针对不规则的创面，膜片状或者海绵状材料不易贴合，粉状材料使用过程中易散落。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有的止血材料与创面贴合度不高，止血时间长、止血效果差的缺陷，提供一种胶原止血纤维的制备方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
一种胶原止血纤维的制备方法，包括以下步骤：
S1：取整张小牛皮的背部，去除毛发和脂肪层，切成1～2cm的小段，冷冻后切成细碎的皮片；优选的，在-50℃冷冻后切成厚度为0.1～0.5mm，大小为0.5～2cm的皮片；
进一步的，脱毛时可以手工脱毛也可以使用Na2SO4、Na2S、CaCl2复合脱毛剂脱毛或者使用过氧化氢溶液脱毛；优选的，选用质量比为Na2SO4:Na2S:CaCl2＝1～2:40～50:10～20的溶液脱毛或者使用质量分数为5～10％的过氧化氢溶液；
S2：脱脂处理：将皮片浸泡在氯化钠溶液中，置于磁力搅拌器上缓慢搅拌24h，每5～7h更换一次氯化钠溶液；再将皮片浸泡在碳酸钠溶液中，置于磁力搅拌器上缓慢搅拌24h，5～7h更换一次碳酸钠溶液；然后将皮片转移至脂肪酶解液中，置于磁力搅拌器上缓慢搅拌24h，5～7h后更换一次脂肪酶酶解液，酶解结束后离心除去水分，再将牛皮纤维放入注射水中缓慢搅拌10～20分钟，倒出、去除水份，反复清洗三遍；优选的，氯化钠溶液的质量浓度为1％～10％，碳酸钠溶液的质量浓度为1％～5％，脂肪酶的用量为皮片重量的1％～3％，酶解反应的pH为9～13；
S3：乙醇梯度脱水：将脂肪酶处理后的牛皮纤维，浸泡在不同浓度的乙醇溶液中梯度脱水，然后自然干燥；乙醇梯度脱水时使用浓度为30％～100％乙醇浓度脱水3～8h。
S4：粉碎：将牛皮纤维撕成小块放入高分子粉碎机内粉碎，取出纤维，用镊子挑除块状硬物；优选的，粉碎的频率为10～30Hz，粉碎时间为5～15s，粉碎次数为1～3次。
S5：筛分：将粉碎后的胶原纤维经筛网筛分，优选的，筛网的大小为26～35目，去除纤维碎末，收集筛网中的胶原纤维；
S6：干燥交联：放入真空干燥交联箱内，对箱内抽真空至-90Kpa以上，并保持1h以上，在一定温度下，干燥交联。优选的，干燥交联的温度为80～110℃，时间为8～24h。
所得的胶原止血纤维，经过辐照灭菌后，成为非水溶性的局部止血剂。电镜观察，它是一种长1～5mm，直径5～20μm的微纤维结构。肉眼观察是一种带微黄色、柔软的短纤维棉花状物质。
本发明的胶原止血纤维性能符合以下要求：
(1)吸液量不少于自身重量的10倍；
(2)pH值为5.5-7.5；
(3)干燥失重≤15％；
(4)硫酸盐灰分≤2.0％
(5)重金属含量≤10mg/kg
(6)蛋白含量≥80％
(7)羟脯氨酸含量≥总蛋白含量的9％(m/m)
(8)细胞毒性反应不大于1级
与现有技术相比，本发明制备得到的速胶原止血纤维有以下优点和利用价值：
一、本发明制备得到的胶原止血纤维由小牛真皮采集精制而成的高纯度胶原纤维制备而成，具有良好的生物相容性和低免疫原性，未使用交联剂改性，细胞毒性反应不大于1级；
二、本发明制备得到的胶原止血纤维为原组织胶原束状纤维结构，具有良好的力学强度，不会被水或者酸溶解，也不会溶胀呈凝胶，创面粘附性好，尤其针对不规则创面的止血，成品成短纤维、团状棉絮样，使用时不易散落，方便操作；
三、本发明制备得到的胶原止血纤维，具有很强的亲水性，吸液量高达16倍，能快速吸收血液或渗液，能封闭创面，促进血小板粘附形成血栓，从而达到快速长效止血的效果。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是本发明所得的胶原止血纤维的扫描电镜(SEM)照片。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种胶原止血纤维的制备方法如下：
S1：取整张小牛皮的背部，用剃毛机将取好的牛皮背部的毛剔除，再用刀片刮去牛皮上的脂肪层和绒毛层，切成1～2cm左右的小段，置于-50℃冷冻，再将冷冻的牛皮片段用切片机切成厚度约0.2mm，大小1cm的皮片；
S2：脱脂处理：将皮片浸泡在2％氯化钠溶液中，置于磁力搅拌器上缓慢搅拌24h，5～7h后更换一次浸泡液；再将皮片浸泡在1％碳酸钠溶液中，置于磁力搅拌器上缓慢搅拌24h，5～7h后更换一次浸泡液；最后皮片转移至皮片重量1％的脂肪酶解液中，置于磁力搅拌器上缓慢搅拌24h，反应pH为9，5～7h后更换一次脂肪酶酶解液，酶解结束后离心(5000rmp，8min)除去水分，再将牛皮纤维放入注射水中缓慢搅拌10～20分钟，倒出、去除水份。反复清洗三遍。
S3：乙醇梯度脱水：将脂肪酶处理后的牛皮纤维，浸泡在30％、60％、100％的乙醇溶液中，梯度脱水，间隔4h换一次乙醇溶液，然后自然干燥。
S4：粉碎：将牛皮纤维撕成小块放入高分子粉碎机内，关闭仪器装置，以10Hz
转频粉碎5s，粉碎1次。取出纤维，用镊子挑除块状硬物，待干燥。
S5：筛分：将粉碎后的胶原纤维经26目筛网筛分，去除纤维碎末，收集筛网中的胶原纤维。
S6：干燥交联：将粉碎的胶原纤维放入真空干燥交联箱内，对箱内抽真空至-90Kpa以上，并保持1h以上，设置温度为80℃，干燥交联时间为8h。
实施例2
一种胶原止血纤维的制备方法如下：
S1：取整张小牛皮的背部，用剃毛机将取好的牛皮背部的毛剔除，再用刀片刮去牛皮上的脂肪层和绒毛层，切成1～2cm左右的小段，置于-50℃冷冻，再将冷冻的牛皮片段用切片机切成厚度约0.3mm，大小0.5cm的皮片；
S2：脱脂处理：将皮片浸泡在5％氯化钠溶液中，置于磁力搅拌器上缓慢搅拌24h，5～7h后更换一次浸泡液；再将皮片浸泡在2％碳酸钠溶液中，置于磁力搅拌器上缓慢搅拌24h，5～7h后更换一次浸泡液；最后皮片转移至皮片重量2％的脂肪酶解液中，置于磁力搅拌器上缓慢搅拌24h，反应pH为10，5～7h后更换一次脂肪酶酶解液，酶解结束后离心(5000rmp，8min)除去水分，再将牛皮纤维放入注射水中缓慢搅拌10～20分钟，倒出、去除水份。反复清洗三遍。
S3：乙醇梯度脱水：将脂肪酶处理后的牛皮纤维，浸泡在50％、75％、100％的乙醇溶液中，梯度脱水，间隔6h换一次乙醇溶液，然后自然干燥。
S4：粉碎：将牛皮纤维撕成小块放入高分子粉碎机内，关闭仪器装置，以15Hz转频粉碎8s，粉碎2次。取出纤维，用镊子挑除块状硬物，待干燥。
S5：筛分：将粉碎后的胶原纤维经30目筛网筛分，去除纤维碎末，收集筛网中的胶原纤维。
S6：干燥交联：将粉碎的胶原纤维放入真空干燥交联箱内，对箱内抽真空至-90Kpa以上，并保持1h以上，设置温度为90℃，干燥交联时间为12h。
实施例3
一种胶原止血纤维的制备方法如下：
S1：取整张小牛皮的背部，用剃毛机将取好的牛皮背部的长毛剔除，再用刀片刮去牛皮上的脂肪层，再用Na2SO4:Na2S:CaCl2＝1:50:20配比的脱毛剂脱毛15min，清洗后切成1～2cm左右的小段，置于-50℃冷冻，再将冷冻的牛皮片段用切片机切成厚度约0.4mm，大小2cm的皮片；
S2：脱脂处理：将皮片浸泡在8％氯化钠溶液中，置于磁力搅拌器上缓慢搅拌24h，5～7h后更换一次浸泡液；再将皮片浸泡在3％碳酸钠溶液中，置于磁力搅拌器上缓慢搅拌24h，5～7h后更换一次浸泡液；最后皮片转移至皮片重量3％的脂肪酶解液中，置于磁力搅拌器上缓慢搅拌24h，反应pH为11，5～7h后更换一次脂肪酶酶解液，酶解结束后离心(5000rmp，8min)除去水分，再将牛皮纤维放入注射水中缓慢搅拌10～20分钟，倒出、去除水份。反复清洗三遍。
S3：乙醇梯度脱水：将脂肪酶处理后的牛皮纤维，浸泡在40％、80％、100％的乙醇溶液中，梯度脱水，间隔8h换一次乙醇溶液，然后自然干燥。
S4：粉碎：将牛皮纤维撕成小块放入高分子粉碎机内，关闭仪器装置，以18Hz转频粉碎10s，粉碎2次。取出纤维，用镊子挑除块状硬物，待干燥。
S5：筛分：将粉碎后的胶原纤维经35目筛网筛分，去除纤维碎末，收集筛网中的胶原纤维。
S6：干燥交联：将粉碎的胶原纤维放入真空干燥交联箱内，对箱内抽真空至-90Kpa以上，并保持1h以上，设置温度为100℃，干燥交联时间为16h。
实施例4
一种胶原止血纤维的制备方法如下：
S1：取整张小牛皮的背部，用剃毛机将取好的牛皮背部的长毛剔除，再用刀片刮去牛皮上的脂肪层，再用Na2SO4:Na2S:CaCl2＝2:40:10配比的脱毛剂脱毛15min，清洗后切成1～2cm左右的小段，置于-50℃冷冻，再将冷冻的牛皮片段用切片机切成厚度约0.1mm，大小2cm的皮片；
S2：脱脂处理：将皮片浸泡在10％氯化钠溶液中，置于磁力搅拌器上缓慢搅拌24h，5～7h后更换一次浸泡液；再将皮片浸泡在3％碳酸钠溶液中，置于磁力搅拌器上缓慢搅拌24h，5～7h后更换一次浸泡液；最后皮片转移至皮片重量2％的脂肪酶解液中，置于磁力搅拌器上缓慢搅拌24h，反应pH为12，5～7h后更换一次脂肪酶酶解液，酶解结束后离心(5000rmp，8min)除去水分，再将牛皮纤维放入注射水中缓慢搅拌10～20分钟，倒出、去除水份。反复清洗三遍。
S3：乙醇梯度脱水：将脂肪酶处理后的牛皮纤维，浸泡在30％、70％、100％的乙醇溶液中，梯度脱水，间隔10h换一次乙醇溶液，然后自然干燥。
S4：粉碎：将牛皮纤维撕成小块放入高分子粉碎机内，关闭仪器装置，以20Hz转频粉碎8s，粉碎3次。取出纤维，用镊子挑除块状硬物，待干燥。
S5：筛分：将粉碎后的胶原纤维经32目筛网筛分，去除纤维碎末，收集筛网中的胶原纤维。
S6：干燥交联：将粉碎的胶原纤维放入真空干燥交联箱内，对箱内抽真空至-90Kpa以上，并保持1h以上，设置温度为105℃，干燥交联时间为24h。
实施例5
一种胶原止血纤维的制备方法如下：
S1：取整张小牛皮的背部，用剃毛机将取好的牛皮背部的长毛剔除，再用刀片刮去牛皮上的脂肪层，再用5％过氧化氢脱毛3-4h，清洗后切成1～2cm左右的小段，置于-50℃冷冻，再将冷冻的牛皮片段用切片机切成厚度约0.2mm，大小1cm的皮片；
S2：脱脂处理：将皮片浸泡在8％氯化钠溶液中，置于磁力搅拌器上缓慢搅拌24h，5～7h后更换一次浸泡液；再将皮片浸泡在2％碳酸钠溶液中，置于磁力搅拌器上缓慢搅拌24h，5～7h后更换一次浸泡液；最后皮片转移至皮片重量1％的脂肪酶解液中，置于磁力搅拌器上缓慢搅拌24h，反应pH为13，5～7h后更换一次脂肪酶酶解液，酶解结束后离心(5000rmp，8min)除去水分，再将牛皮纤维放入注射水中缓慢搅拌10～20分钟，倒出、去除水份。反复清洗三遍。
S3：乙醇梯度脱水：将脂肪酶处理后的牛皮纤维，浸泡在50％、75％、100％的乙醇溶液中，梯度脱水，间隔12h换一次乙醇溶液，然后自然干燥。
S4：粉碎：将牛皮纤维撕成小块放入高分子粉碎机内，关闭仪器装置，以15Hz转频粉碎10s，粉碎2次。取出纤维，用镊子挑除块状硬物，待干燥。
S5：筛分：将粉碎后的胶原纤维经28目筛网筛分，去除纤维碎末，收集筛网中的胶原纤维。
S6：干燥交联：将粉碎的胶原纤维放入真空干燥交联箱内，对箱内抽真空至-90Kpa以上，并保持1h以上，设置温度为85℃，干燥交联时间为18h。
实施例6
一种胶原止血纤维的制备方法如下：
S1：取整张小牛皮的背部，用剃毛机将取好的牛皮背部的长毛剔除，再用刀片刮去牛皮上的脂肪层，再用10％过氧化氢脱毛3-4h，清洗后切成1～2cm左右的小段，置于-50℃冷冻，再将冷冻的牛皮片段用切片机切成厚度约0.1mm，大小1cm的皮片；
S2：脱脂处理：将皮片浸泡在10％氯化钠溶液中，置于磁力搅拌器上缓慢搅拌24h，5～7h后更换一次浸泡液；再将皮片浸泡在3％碳酸钠溶液中，置于磁力搅拌器上缓慢搅拌24h，5～7h后更换一次浸泡液；最后皮片转移至皮片重量2％的脂肪酶解液中，置于磁力搅拌器上缓慢搅拌24h，反应pH为9.5，5～7h后更换一次脂肪酶酶解液，酶解结束后离心(5000rmp，8min)除去水分，再将牛皮纤维放入注射水中缓慢搅拌10～20分钟，倒出、去除水份。反复清洗三遍。
S3：乙醇梯度脱水：将脂肪酶处理后的牛皮纤维，浸泡在50％、75％、100％的乙醇溶液中，梯度脱水，间隔6h换一次乙醇溶液，然后自然干燥。
S4：粉碎：将牛皮纤维撕成小块放入高分子粉碎机内，关闭仪器装置，以20Hz转频粉碎8s，粉碎2次。取出纤维，用镊子挑除块状硬物，待干燥。
S5：筛分：将粉碎后的胶原纤维经26目筛网筛分，去除纤维碎末，收集筛网中的胶原纤维。
S6：干燥交联：将粉碎的胶原纤维放入真空干燥交联箱内，对箱内抽真空至-90Kpa以上，并保持1h以上，设置温度为100℃，干燥交联时间为12h。
经上述方法制得的胶原止血纤维的主要参数性能如下表：
动物体内止血效能测定与比较：
实验动物及组成：清洁级SD大鼠，由苏州大学实验动物中心提供(实验动物生产许可证号：SCXK(苏)2012-0005)。普通级家兔由苏州大学实验动物中心提供(实验动物生产许可证号：SCXK(苏)2012-0062)。雌雄各半，雌性无孕，所有动物在正式开始实验前，均适应性预养一周。
选用家兔24只，雌雄各半。其中12只(试验组(随机用本发明实施例1-6的胶原止血纤维)、对照组(进口艾微停微纤维止血胶原粉)，每组各6只)进行动物脏器(肝、脾)活体止血实验。12只(试验组、对照组(进口艾微停微纤维止血胶原粉)，每组各6只)进行动物肌肉创面活体止血实验。
选用SD大鼠24只，雌雄各半。其中12只(试验组、对照组(进口艾微停微纤维止血胶原粉)，每组各6只)进行动物脏器(肝、脾)活体止血实验。12只(试验组、对照组(进口艾微停微纤维止血胶原粉)，每组各6只)进行大脑止血实验。
出血模型制作及指标观察：(1)大鼠大脑表面、内脏(肝脏、脾脏)出血模型：取健康SD大鼠24只，雌雄各半，随机分配到试验组、艾微停组，每组6只动物。术前大鼠禁食24h，自来水饲养。用10％水合氯醛300mg/kg经右侧腹腔注射。SD大鼠麻醉后，仰卧位常规消毒，分别制取一创面(脑组织：长宽深约为5mm x3mm x2mm；脏器：长8mm，宽2mm，深5mm)、铺无菌粘贴手术巾，逐层切开皮肤，分离腹膜，充分暴露脏器(肝脏、脾脏)，在每一脏器表面制取1个出血创面(长8mm，宽2mm，深5mm)，立即予灭菌纱布或止血材料覆盖创面，并用精确称量重量的药棉压迫，吸附所渗出的血液，压迫30s后，每5s观察一次，以不再渗血的时间为止血时间，并计算出血量(吸血后药棉重量减去药棉原重)。如伤口上粘有药棉时，可用剪刀剪下，不可为清除药棉而重新导致出血。止血后，分离颈外静脉，以含枸橼酸抗凝剂的真空采血管通过静脉采血针采集1.0ml血液，用于测定肝素抗凝前的凝血指标。随后通过静脉采血针按肝素125单位/公斤体重剂量经颈外静脉注入肝素，使实验动物肝素化，10min后重复进行上述操作，观察止血效果，记录止血时间及出血量。止血后，同法经真空管采血1.0ml血液，用于测定肝素抗凝后的凝血指标。
(2)家兔肌肉、内脏(肝脏、脾脏)出血模型：取健康家兔24只，雌雄各半，随机分配到试验组、艾微停组，每组6只动物。用3％戊巴比妥钠30mg/kg体重耳缘静脉麻醉，备皮后，仰卧位常规消毒，铺无菌粘贴手术巾，在家兔背部左右两侧切除3个2cm X2cm大小全皮肤层，暴露肌肉层，用手术刀片在肌肉层划“#”制造渗血、出血创面，分别在肝脏表面制取3个，在脾脏表面制取1个相同的出血创面(长8mm，宽2mm，深5mm)，分别在出血创面平铺灭菌纱布或止血材料，并用精确称量重量的药棉压迫，吸附所渗出的血液。约30s左右揭开棉球观察出血情况，以后每隔5s观察1次，以不再渗血的时间为止血时间，并计算出血量(吸血后药棉重量减去药棉原重)。如伤口上粘有药棉时，可用剪刀剪下，不可为清除药棉而重新导致出血。止血后，分离颈外静脉，以含枸橼酸抗凝剂的真空采血管通过静脉采血针采集1.0ml血液，用于测定肝素抗凝前的凝血指标。随后用，通过静脉采血针按肝素125单位/公斤体重经耳缘静脉注入肝素，使实验动物肝素化，10min后重复进行上述操作，观察止血效果，记录止血时间及出血量。止血后，同法经真空管采血1.0ml血液，用于测定肝素抗凝后的凝血指标。
本发明实施例1-6的胶原止血纤维和进口同类产品艾微停在SD大鼠体内止血效能比较：
表1：胶原止血纤维与艾微停在SD大鼠体内止血效能比较——止血时间(s)
表2：胶原止血纤维与艾微停在SD大鼠体内止血效能比较——出血量(mg)
表1和表2的结果表明，在SD大鼠大脑、肝脏、脾脏中，本发明的可胶原止血纤维的止血时间和出血量与进口同类产品艾微停无统计学差异，说明胶原止血纤维与进口同类产品艾微停在SD大鼠体内止血效能基本一致。
本发明实施例1-6的胶原止血纤维和进口同类产品艾微停在家兔体内止血效能比较：
表3：胶原止血纤维与艾微停在家兔体内止血效能比较——止血时间(s)
表4：胶原止血纤维与艾微停在家兔体内止血效能比较——出血量(mg)
表3和表4的结果表明，在家兔肌肉、肝脏、脾脏出血模型中，本发明的胶原止血纤维的止血时间和出血量与进口同类产品艾微停无统计学差异，说明本发明的胶原止血纤维与进口同类产品艾微停在家兔体内止血作用基本一致。
结论
综上所述，通过与进口同类产品艾微停比较的结果表明，SD大鼠及家兔体内不同器官出血模型的体内实验结果证实，本发明的胶原止血纤维的止血效果与进口的同类产品艾微停微纤维止血胶原(粉)基本一致。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种胶原止血纤维的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：取整张小牛皮的背部，去除毛发和脂肪层，切成1～2cm的小段，冷冻后切成细碎的皮片；
S2：脱脂处理：将皮片浸泡在氯化钠溶液中，置于磁力搅拌器上缓慢搅拌24h，每5～7h更换一次氯化钠溶液；再将皮片浸泡在碳酸钠溶液中，置于磁力搅拌器上缓慢搅拌24h，5～7h更换一次碳酸钠溶液；然后将皮片转移至脂肪酶解液中，置于磁力搅拌器上缓慢搅拌24h，5～7h后更换一次脂肪酶酶解液，酶解结束后离心除去水分，再将牛皮纤维放入注射水中缓慢搅拌10～20分钟，倒出、去除水份，反复清洗三遍；
S3：乙醇梯度脱水：将脂肪酶处理后的牛皮纤维，浸泡在不同浓度的乙醇溶液中梯度脱水，然后自然干燥；
S4：粉碎：将牛皮纤维撕成小块放入高分子粉碎机内粉碎，取出纤维，用镊子挑除块状硬物；
S5：筛分：将粉碎后的胶原纤维经筛网筛分，去除纤维碎末，收集筛网中的胶原纤维；
S6：干燥交联：放入真空干燥交联箱内，对箱内抽真空至-90Kpa以上，并保持1h以上，在一定温度下，干燥交联，得到胶原止血纤维。
2.如权利要求1所述的胶原止血纤维的制备方法，其特征在于，所制得的胶原止血纤维为长1～5mm，直径5～20μm的微纤维结构。
3.如权利要求1所述的胶原止血纤维的制备方法，其特征在于，步骤S1中，脱毛时可以手工脱毛或使用Na2SO4、Na2S、CaCl2复合脱毛剂脱毛或者使用过氧化氢溶液脱毛。
4.如权利要求3所述的胶原止血纤维的制备方法，其特征在于，步骤S1中，脱毛时使用质量比为Na2SO4:Na2S:CaCl2＝1～2:40～50:10～20的溶液脱毛或者使用质量分数为5～10％的过氧化氢溶液脱毛。
5.如权利要求1所述的胶原止血纤维的制备方法，其特征在于，步骤S1中，在-50℃冷冻后切成厚度为0.1～0.5mm，大小为0.5～2cm的皮片。
6.如权利要求1所述的胶原止血纤维的制备方法，其特征在于，步骤S2中，氯化钠溶液的质量浓度为1％～10％，碳酸钠溶液的质量浓度为1％～5％，脂肪酶的用量为皮片重量的1％～3％，酶解反应的pH为9～13。
7.如权利要求1所述的胶原止血纤维的制备方法，其特征在于，步骤S3中，乙醇梯度脱水时使用浓度为30％～100％乙醇浓度脱水3～8h。
8.如权利要求1所述的胶原止血纤维的制备方法，其特征在于，步骤S4中，粉碎的频率为10～30Hz，粉碎时间为5～15s，粉碎次数为1～3次。
9.如权利要求1所述的胶原止血纤维的制备方法，其特征在于，所述S5步骤中，筛网的大小为26～35目。
10.如权利要求1所述的胶原止血纤维的制备方法，其特征在于，所述S6步骤中，干燥交联的温度为80～110℃，时间为8～24h。
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