CN103327966A - 用于防止hiv传播的基于peg纳米载体的多功能生物可降解水凝胶 - Google Patents

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迈克尔·L·奇金达斯
斯担利·施泰因
亚什维尔·辛
苏亚塔·顺达拉·拉詹
高达原
卡蒂娅·诺尔
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Abstract

本发明提供一种基于聚乙二醇的多功能水凝胶，其包含与至少4个多臂聚乙二醇纳米载体单位共价结合的多臂聚乙二醇交联单位，其中每个纳米载体单位包含与所述纳米载体单位偶联的试剂并且每种试剂选自pH降低剂、生物粘合剂、杀微生物-杀精剂和抑制游离的和与细胞结合的HIV结合的试剂，前提是每个纳米载体单位均包含不同的试剂。

Description

用于防止HIV传播的基于PEG纳米载体的多功能生物可降解水凝胶
相关申请的交叉引用
本申请按照35U.S.C.§119(e)要求2010年11月15日提交的美国临时申请号61/413,652和2012年1月26日提交的美国临时申请号61/436,320的优先权。两份申请的公开内容均通过引用的方式并入本文。
关于联邦赞助研究的声明
本发明受美国政府支持在国家健康研究所HIT-IT计划资助的R01AI084137-01下完成。本发明还受美国政府支持在国家健康研究所资助的NCCAM NIH R21AT002897-01下完成。美国政府享有本发明的某些权利。
背景技术
细菌性阴道病(BV)是一种以阴道微生物菌群失衡为特征的常见疾病，在阴道中有益健康的乳酸杆菌被兼性需氧和厌氧微生物，最显著的是阴道加德纳菌(Gardnerella vaginalis)和普雷沃菌(Prevotella)、消化链球菌(Peptostreptococcus)、卟啉单胞菌(Porphyromonas)和动弯杆菌(Mobiluncus)菌种的增殖所取代。与BV有关的微生物可以视为造成STD的因素。尽管一些研究者和医生不将BV视为性传播疾病，但数个小组已经报道了BV的性传播。
北美估计有10-30%的女性受到这种疾病的困扰，常常迫使她们寻求医护。虽然BV经常保持无症状，但是已经证明这些生物的不受约束的生长具有致病作用，对怀孕女性尤为如此。
BV与盆腔炎性疾病形成以及多种妊娠相关的并发症，包括胎儿出生体重低、伴随婴儿死亡风险升高的早产、导致胎儿脑损伤的羊膜内感染和自发流产有关。另外，已经证明细菌性阴道病，尤其是阴道加德纳菌提高了染上HIV的概率并在多个细胞系中刺激HIV增殖。
随着HIV感染的发生率上升，开发疫苗和局部用杀微生物剂已经成为世界范围的首要事件。然而，最近的试验结果令人沮丧。因此，诱导抗菌性免疫力和保护免受HIV感染仍是公共卫生的一个主要目标。认为“杀微生物剂”(防止HIV在人之间传播的局部施用药物)仍具有巨大的前景。实际上，据估计，由20%的具有风险的女性在50%的时间内使用杀微生物剂时，可能在3年内防止了二千五百万例HIV感染。鉴于最近的临床进展，迫切需要重新考虑杀微生物剂的概念。
发明简述
本发明涉及一种基于聚乙二醇的多功能水凝胶，其包含与至少4个多臂聚乙二醇纳米载体单位共价结合的多臂聚乙二醇交联单位，其中每个纳米载体单位包含与所述纳米载体单位偶联的试剂并且每种试剂选自pH降低剂、生物粘合剂、杀微生物-杀精剂(microbicidal spermicidal agent)和抑制游离的和与细胞结合的HIV结合的试剂，前提是每个纳米载体单位包含不同的试剂，至少两个纳米载体单位包含具有不同功能的试剂。
在一个实施方案中，至少一种试剂通过可降解键与纳米载体单位偶联。在另一个实施方案中，至少一种试剂通过不可降解键与纳米载体偶联。在又一个实施方案中，所述水凝胶包含选自乳酸、柠檬酸、抗坏血酸和马来酸的pH降低剂。
在一个实施方案中，所述水凝胶包含在载体中封装的pH降低剂。在另一个实施方案中，所述载体是环糊精、树模石(dendron)、树状聚物、脂质体或PEG纳米凝胶粒子。
在又一个实施方案中，所述水凝胶包含枯草溶菌素(subtilosin)。在又一个实施方案中，所述水凝胶包含选自可溶性聚阴离子和RGD肽配体的抑制游离的和与细胞结合的HIV结合的试剂。在另一个实施方案中，可溶性聚阴离子选自硫酸葡聚糖、硫酸环糊精和肝素。在又一个实施方案中，所述水凝胶还包含在水凝胶内部共价结合的至少一个纳米载体单位。
本发明还涉及一种通过以下方式制备水凝胶的方法：将某个量的包含与每条臂偶联的巯基反应性官能团的多臂聚乙二醇交联单位与某个量的多臂聚乙二醇纳米载体单位合并，其中每个纳米载体单位包含与一半所述臂偶联的巯基和与每个纳米载体单位的剩余臂偶联的试剂，并且每种试剂选自pH降低剂、生物粘合剂、杀微生物-杀精剂和抑制游离的和与细胞结合的HIV结合的试剂；其中所述交联单位和所述纳米载体单位的量足以在合并时产生水凝胶。在一个实施方案中，与相同聚合物单位合并的每个纳米载体单位包含不同的试剂。
本发明还提供用于制备基于聚环氧烷的多功能水凝胶的试剂盒，所述试剂盒包含：(a)某个量的包含与每条臂偶联的巯基反应性官能团的多臂聚乙二醇交联单位；和(b)某个量的多臂聚乙二醇纳米载体单位，其中每个纳米载体单位包含与一半所述臂偶联的巯基和与每个纳米载体单位的剩余臂偶联的试剂，并且每种试剂选自pH降低剂、生物粘合剂、杀微生物-杀精剂和抑制游离的和与细胞结合的HIV结合的试剂；其中所述交联单位和所述纳米载体单位的量足以在合并时产生水凝胶。
本发明还提供是通过向患者阴道内或直肠内施用以下物质而预防性降低患者HIV形成风险的方法：(a)某个量的包含与每条臂偶联的巯基反应性官能团的多臂聚乙二醇交联单位；和(b)某个量的多臂聚乙二醇纳米载体单位，其中每个纳米载体单位包含与一半所述臂偶联的巯基和与每个纳米载体单位的剩余臂偶联的试剂，并且每种试剂选自pH降低剂、生物粘合剂、杀微生物-杀精剂和抑制游离的和与细胞结合的HIV结合的试剂；其中所述交联单位和所述纳米载体单位的量足以在合并时产生水凝胶。
本发明还提供包含本发明水凝胶的制品。
另一个实施方案包括局部(topical)用组合物，其包含抗微生物有效量和/或杀精有效量的枯草溶菌素，所述枯草溶菌素掺入到可药用水溶液、非水溶液、纳米纤维、水凝胶、凝胶、纳米凝胶、悬剂、膏剂(ointment)、胶剂(jelly)、插入物、栓剂、海绵(sponge)、油膏剂(salve)、霜剂(cream)、泡沫剂、起泡片剂或灌洗剂中。
附图简述
图1是具有独立的交联剂溶液和聚合物溶液的注射器的照片(左小图)，和由交联剂和聚合物形成的水凝胶的照片(右小图)。将蓝色染料添加至聚合物溶液以观察水凝胶，否则水凝胶则是透明和无色的；
图2是显示聚合物上的SH(左)与交联性纳米载体上的TP基团(右)反应以形成水凝胶的反应方案。当凝胶降解时，释放纳米载体；
图3描述来自化学计量为1:1的共聚物和交联剂的5%水凝胶的TEM图像。交联网络清晰可见；
图4是显示应变(G'和G'')对3%和5%(w/v)水凝胶的影响图，所述水凝胶由化学计量为1:1的共聚物和交联剂制备。频率扫描试验显示，所述水凝胶是高弹性的并且它们在身体活动期间出现的应变下具有抵抗结构变化的能力；
图5A描述RGD肽与PEG纳米载体结合的一个合成方案；
图5B描述RGD肽与PEG纳米载体结合的另一个合成方案；
图6是DSC结果，其显示(a)8臂PEG-SH的Tm是53.3°C，(b)中间体8臂PEG-S-TP的Tm是45.81°C(-7.56°C的移动)，和(c)与PEG纳米载体相连的RGD的Tm是37.69°C(-15.6°C的移动证实了连接)；
图7是描述PEG-LA纳米载体合成的反应方案；(a)二氯甲烷(DCM)，二环己基碳二亚胺(DCC)，室温，8小时；和(b)DCM，二甲氨基吡啶(DMAP)，室温，4小时；
图8A显示PEG20KDa-LA(4臂)的GPC图；
图8B显示PPEG20KDa-LA(8臂)的GPC图；
图9A是显示在PBS(pH7.4)缓冲液和乙酸盐(pH4.3)缓冲液中乳酸从8臂PEG-LA纳米载体中累积释放的曲线图；均数±S.E.，n=3。使用单阶指数协调方程拟合释放谱。底部小图显示前12小时的释放谱；
图9B显示在(A)PBS(pH7.4)缓冲液和(B)乙酸盐(pH4.3)缓冲液中乳酸从基于纳米载体的水凝胶中的累积释放；均数±S.E.，n=3。用单阶指数协调方程(A)或二阶指数协调方程(B)拟合数据；an=2；
图9C显示PBS(pH7.4)中乳酸从含有被动携裹的乳酸的水凝胶中累积释放；均数±S.E.，n=3。使用单阶指数协调方程拟合释放谱。an=2，bn=1。
图10是使用8臂PEG20Kda-LA纳米载体和4臂PEG20kDa-NHS交联剂形成水凝胶的示意图；
图11是提供形成基于PEG-LA纳米载体的水凝胶的时间的表格；
图12是显示基于PEG-LA纳米载体的水凝胶中在PBS(pH7.4)缓冲液和乙酸盐(pH4.3)缓冲液中溶胀和降解的曲线图；均数±S.E.，n=3。
图13是用于产生PEG纳米凝胶(左)和代表性PEG纳米凝胶聚集物(右)的合成方案；
图14是PEG纳米凝胶(小图A)、微米级稳定纳米凝胶聚集物(小图B)和大(>100微米)PEG纳米凝胶聚集物的TEM；
图15是显示暴露于枯草溶菌素A后表皮阴道组织(epivaginal tissue)存活力的曲线图。线段是两个独立实验的平均数；
图16是显示枯草溶菌素A以剂量依赖方式使人精子不动的曲线图。在与所示不同终浓度的枯草溶菌素A混合后30秒，测定混合的整个精液中活动精子的百分比。相对70%的正常对照运动性调节全部数据并且在进一步分析前进行反正弦变换。值表示平均%运动性。误差线是90%置信界限；
图17A是交联纳米载体的合成方案。(左小图)：用于结合枯草溶菌素的方案。(右小图)：用于合成聚阴离子纳米载体的方案。相同过程(n=1)将用于降低pH的纳米载体；
图17B是枯草溶菌素结合至纳米载体的另一个方案；
图18是从各种交联纳米载体形成复合水凝胶的概念图。此外，粒子可以被动携裹于凝胶基质中。
图19是描述指示生物的生长条件和枯草溶菌素敏感性的表；
图20是提供酶消化对抗微生物活性的影响的表；
图21是列出针对枯草菌素和枯草溶菌素的功能基因的特异性引物的表；
图22是提供CFS中D-乳酸浓度和L-乳酸浓度的表；
图23是提供温度胁迫对抗微生物活性的影响的表；
图24A和图24B是比较ATP水平的图；
图25A和图25B是说明枯草溶菌素不影响阴道加德纳菌细胞中跨膜电势(Δψ)的曲线图；
图26A和图26B是说明枯草溶菌素消除阴道加德纳菌细胞中跨膜pH梯度(ΔpH)的曲线图；
图27是描述在延长暴露于枯草溶菌素后外宫颈细胞(ectocervical cell)存活力的表；
图28是描述枯草溶菌素、甘油单月桂酸酯、月桂酰精氨酸酯、聚赖氨酸和乳酸锌对与BV有关的病原体阴道加德纳菌的最小抑菌浓度(MIC)的表；
图29是显示由趋势线连接的甘油单月桂酸酯(GML)(20μg/mL)和枯草溶菌素(9.2μg/mL)的各个MIC的等效线图；
图30是提供在棋盘测定法中测定的抗微生物化合物针对阴道加德纳菌的最低抑菌浓度(MIC)的表；
图31是显示由趋势线连接的月桂酰精氨酸酯(LAE)(100μg/mL)和枯草溶菌素(9.2μg/mL)的各个MIC的等效线图；
图32是显示由趋势线连接的枯草溶菌素(9.2μg/mL)和聚赖氨酸(25μg/mL)的各个MIC的等效线图；和
图33是显示由趋势线连接的乳酸锌(1090.1μg/mL)和枯草溶菌素(9.2μg/mL)的各个MIC的等效线图。
图34是显示以(A)频率和(B)应变(strain)为函数，应变(G'和G'')对4%和6%(w/v)基于PEG-LA纳米载体的水凝胶的影响的图。
发明详述
本发明涉及一种用于防止HIV初始感染(即，染上HIV)并经阴道粘膜散布至远处组织的基于纳米载体的多重聚乙二醇(PEG)阴道用水凝胶。多重水凝胶基质通过交联各种PEG纳米载体形成，所述PEG纳米载体在所述水凝胶的功能特性中各自发挥不同的作用(例如，促进粘膜黏附、维持轻度酸性pH、释放杀微生物剂和杀精剂并防止HIV毒粒结合)。
水凝胶通过亲水聚合物的分子间交联形成。它们能吸收大量水并溶胀，同时维持其三维网络。不同大小的分子可以穿过水凝胶基质扩散，而水凝胶基质由于水凝胶的高含水量和柔软/橡皮状特征而类似于活组织。水凝胶用于药物递送、组织工程和成像应用中。目前的聚合物和交联剂纳米载体基于聚乙二醇，所述聚乙二醇是水溶性、无毒和生物相容性聚合物。这特别重要，因为粘膜组织和正常阴道菌群的破坏与HIV-1获取和散播速率的增加相关。水凝胶在输注时为液体，从而允许高的阴道分散度和粘膜覆盖度，在粘膜其经历快速的相变以形成不依赖于温度或pH的粘弹性水凝胶。多重水凝胶基质通过交联各种PEG纳米载体形成，所述PEG纳米载体在所述水凝胶的功能特性中各自发挥不同的作用(例如，促进粘膜黏附、维持轻度酸性pH、释放杀微生物剂和杀精剂并防止HIV毒粒结合)。
已经显示，(1)通过性传播的阴道感染如细菌性阴道病(BV)通过削弱粘膜屏障并通过刺激可活化或招募HIV靶细胞至病毒进入端口的炎症反应而增加HIV传播的风险，(2)低阴道pH(<4.5)使HIV失活并抑制CD4+淋巴细胞活化，从而减少阴道中HIV靶细胞的数目，和(3)与细胞结合的HIV以低频率突破阴道的正常分层扁平上皮屏障。
优选地，本发明的水凝胶提供稳定的物理屏障，恢复阴道的天然杀微生物屏障功能并防止HIV结合。还优选所述水凝胶无色、无味、造价低廉、在超过一日一次长期使用时安全、起效快速、伴侣不可察觉并且可以避孕和非避孕形式获得。例如，所述水凝胶可以直接施加至阴道或直肠。
本发明的水凝胶还可以浸渍至吸附性基底材料(如海绵)中或涂覆到固体基底材料的表面(如男用或女用避孕套、阴道隔膜、子宫帽或医用手套)上，以递送组合物至阴道上皮或其他潜在的可感染上皮。这种类型的其他制品和递送系统对于本领域技术人员而言是非常显而易见的。
如本文所用，“避孕套”指用来在性交期间在男性和女性生殖器之间提供水密性物理屏障并在性交后取出的屏障装置。本术语包括覆盖阴茎的常规避孕套；也包括所谓“女用避孕套”，其在性交之前插入阴道中。优选地，避孕套应当由乳胶或合成塑料(如聚氨酯)制成，原因是这些材料提供针对病毒的高度保护作用。
本发明还提供一种用于预防性降低患者HIV形成风险的方法，所述方法通过向患者阴道内或直肠内施用：(a)某个量的包含与每条臂偶联的巯基反应性官能团的多臂聚乙二醇交联单位；和(b)某个量的多臂聚乙二醇纳米载体单位，其中每个纳米载体单位包含与一半所述臂偶联的巯基和与每个纳米载体单位的剩余臂偶联的试剂，并且每种试剂选自pH降低剂、生物粘合剂、杀微生物-杀精剂和抑制游离的和与细胞结合的(cell-associated)HIV结合的试剂；其中所述交联单位和所述纳米载体单位的量足以在合并时产生水凝胶。
在本发明的一个实施方案中，8臂PEG聚合物纳米载体交联以形成水凝胶形式的携裹水的水凝胶网络。结果，水凝胶由于其高含水量和柔软/橡皮状特征而类似于活组织。PEG水凝胶可以在性交期间充当润滑剂。除了以下两点例外，对于“交联”单位和“纳米载体”单位，基本PEG单元是相同的：(1)在交联单位上的官能团(例如巯基反应性官能团，包括但不限于活化酯、活化巯基，马来酰亚胺和乙烯基砜等)和纳米载体单位上的官能团(例如巯基(-SH))是互补的，从而它们将反应形成水凝胶网络，和(2)除了巯基反应性官能团之外，纳米载体单位还拥有各种功能性，如pH降低单位、生物粘合单位(例如黄原胶、羟丙基纤维素、carpool、聚卡波非、壳聚糖、藻酸盐等)，杀微生物剂单位和杀精剂单位或阻止游离的和与细胞结合的HIV结合的聚阴离子和RGD单位(例如抗病毒)。将各种纳米载体单位与交联单位混合形成多重水凝胶，从而使水凝胶具有所需的功能特性。
使用多臂和/或分枝的PEG-巯基聚合物，制备纳米载体单位。巯基(例如臂)的数目优选地为2-16，更优选地为2-8。巯基聚合物的分子量范围优选地是约10,000Da-约100,000Da，更优选地是约10,000Da-约60,000Da。用来制备本发明水凝胶的纳米载体单位的量为约2%vv/v-约40%w/v、更优选约2%w/v-约20%w/v。在本发明的一个实施方案中，水凝胶包括含有巯基重复单位的共聚物，例如分子量范围为约1,000Da-约100,000Da的聚[聚(乙二醇)-交-聚(巯基琥珀酸)]。
交联单位是包含巯基反应性官能团(如，活化酯、活化巯基、马来酰亚胺、乙烯基砜等)的线型或多臂(分枝)聚合物。交联单位的分子量范围优选地是约1,000Da-约40,000Da，更优选地是约2,000Da-约20,000Da。官能团的数目优选地为2-8。纳米载体单位对交联单位的化学计量为10:0.05至0.05:10。
目前市售的阴道用凝胶(例如Conceptrol
Figure BDA00003511572900081
和Gynol
Figure BDA00003511572900082
是使用胶凝剂如羧甲基纤维素钠来增加其粘度的“软”凝胶。结果，软凝胶的机械强度低，且不能维持针对病原体的强物理屏障。同等重要的是，阴道用凝胶具有良好的粘弹性性能，以便对抗应变下的结构变化(例如，在正常运动、性交等期间)。如果凝胶不能抵抗结构变化，将在凝胶中形成开口，从而使病原体侵入粘膜。就我们所知，目前市售或正在开发的凝胶均没不具有任何显著的弹性性质。凝胶在阴道内部还必须具有高度分散性和停留以确保最大粘膜表面覆盖度。身体用凝胶在滴注入阴道时铺展和覆盖粘膜表面的能力有限(即，铺展仅在凝胶变稀和较不粘稠时才出现，这使其成为有效性较低的屏障)。非常明显的是，目前市售的阴道用凝胶没有设计成提供针对病原体的良好物理屏障。本发明的水凝胶具有作为溶液施用以便获得最大阴道粘膜覆盖度的优点。然而，不同于任何市售凝胶，本发明的水凝胶随后迅速形成具有良好粘度、柔性/弹性和机械强度的坚固水凝胶。
通过将试剂与水凝胶的纳米载体单位共价连接或当水凝胶基质原位形成时将所述试剂被动(即，非共价地)封装在水凝胶基质内部，修改适应本发明水凝胶的功能特性。可以通过被动携裹实现更高的试剂荷载容量，然而，可能并不总是需要高试剂荷载量。例如，如果目标是维持阴道pH或略微减低pH，则共价连接的酸应当足够用，原因是它们的释放将是缓慢并持久的。如果目标是大幅降低pH(例如，在BV的初始治疗期间)，则需要具有短释放持续期的更高“剂量”。被动携裹也可以用来实现这种功能。在一个实施方案中，用巯基反应性官能团官能化一种或多种试剂，所述巯基反应性官能团包括但不限于活化酯、活化巯基、乙烯基砜，马来酰亚胺等，以便与聚合物形成可降解硫酯和二硫键或稳定(不可降解的)硫醚键。与聚合物结合的试剂的数目优选地为1-8，更优选1-4。就量而言，试剂占约10%至约80%、更优选地约10%至约60%范围的巯基修饰作用。在一个实施方案中，不可切割键用于HIV结合功能，而可切割键用于治疗剂的释放。
优选地，本发明的水凝胶恢复阴道的正常杀微生物环境并因此通过有效维持酸性pH和治疗BV感染来防止HIV传播。阴道感染如BV和向阴道中导入精液(其是碱性)将pH提高至高于为失活HIV和BV病原体所需的临界pH(～4.5)。阴道环境的改变有利于HIV进入和传播。不幸地是，维持酸性阴道pH的大多数努力均失败了，这归咎于酸化剂的不良递送方法和/或低缓冲容量。本发明的水凝胶通过缓慢释放少量乳酸或其他安全的温和酸而模拟天然阴道环境的功能。
乳酸由于其在阴道中的天然功能而是优选的酸化剂。乳酸纳米载体通过乳酸的N-羟琥珀酰亚胺酯经硫酯键与聚合物的-SH基团反应而形成。硫酯键降解，缓慢释放乳酸。在患病阴道的pH(pH5-7)，乳酸优选地在18-30小时的时间范围内释放。乳酸直接连接或通过接头连接，所述接头优选地具有2-12个并且更优选地具有2-6个碳长度。聚合物上乳酸的数目优选地为1-8，更优选1-4变。也可以使用柠檬酸、马来酸或抗坏血酸。柠檬酸的接头是巯基乙醇，抗坏血酸的接头是3-巯基丙酸。可选的制备法是将酸封装在载体如环糊精、树模石(dendron)、树状聚物、脂质体或PEG纳米凝胶粒子(如国际公开号W02009123768中公开的那些，所述专利的内容通过引用方式并入本文)中，并将这些粒子被动携裹在水凝胶内，在此这些粒子缓慢释放酸。
在另一个实施方案中，本发明的水凝胶治疗细菌性阴道病(BV)。枯草芽孢杆菌(B.subtilis)产生一种了解较少的细菌素，即枯草溶菌素A，其是具有35个氨基酸的环形肽，在半胱氨酸和两个苯丙氨酸及一个苏氨酸残基的α碳之间存在三个硫交联的独特翻译后修饰。这种细菌素中特有的肽具有针对BV病原体的药理活性并且杀精。在一个实施方案中，将枯草溶菌素掺入水凝胶中作为天然杀微生物-杀精剂用来治疗BV。第23位的谷氨酸上的游离羧基被活化并与聚合物上的巯基反应，形成可降解的硫酯键。或者，使用赖氨酸部分上的胺官能团连接枯草溶菌素。枯草溶菌素直接连接或通过接头连接至聚合物，所述接头优选地具有2-12个并且更优选地具有2-6个碳长度。聚合物上枯草溶菌素部分的数目优选地为1-8，更优选1-4。
在又一个实施方案中，本发明的水凝胶防止HIV与细胞结合，从而减少HIV传播。非特异性结合抑制剂可以有效对抗游离的和与细胞结合的HIV。HIV结合的第一步骤包括与靶细胞的相互作用。在gp120与CD4结合之前发生的这种非特异性吸附/结合过程是基于Env的带正电荷区域与细胞表面的带负电荷蛋白聚糖的相互作用。已经显示，可溶性聚阴离子(如硫酸葡聚糖、硫酸环糊精和肝素)阻止HIV毒粒的非特异性连接。还已经报道，众多其他聚阴离子也具有这类活性。
在本发明的另一个实施方案中，通过连接带负电荷的氨基酸(其包括但不限于Glu和Asp)构建聚阴离子纳米载体。这些氨基酸具有两个羧基(两个负电荷)。将这些氨基酸直接连接或通过接头连接至聚合物，所述接头优选地具有2-12个并且更优选地具有2-6个碳长度。阴离子氨基酸优选地通过不可降解键与聚合物连接。8臂巯基聚合物上氨基酸的数目为1-8，更优选1-4。由于每个氨基酸具有两个阴离子电荷，纳米载体上的负电荷是2-16个，更优选地是2-8个。在另一个实施方案中，通过使用二肽或三肽而非氨基酸，将电荷密度增加2-3倍。聚阴离子的其他例子包括但不限于硫酸葡聚糖、硫酸肝素等。另一个实施方案利用聚集的PEG纳米凝胶(图13和图14)。这些微米粒子被类似地官能化并且被动携裹于水凝胶中，而非与之共价连接。
另一个结合相互作用基于肽配体RGD与细胞表面上的αβ(例如αvβ3、α5β1等)整联蛋白的相互作用。已经提出，当HIV-1粒子在HIV-1感染的细胞和未感染的粘膜上皮细胞之间接触后局部出芽时，HIV-1较高效地进入阴道粘膜的上皮细胞中，而不是通过无细胞的病毒直接进入上皮细胞。对于CD4+T-细胞也是如此，这种相互作用是整联蛋白和蛋白聚糖agrin依赖性的。在本发明的一个实施方案中，RGD肽通过不可降解键与巯基聚合物连接。RGD肽是线形或环状的并且直接连接或通过接头连接，所述接头优选地具有2-12个并且更优选地具有2-6个碳长度。聚合物上RGD肽的数目优选地为1-8，并且更优选1-4。
优选地，本发明中的水凝胶还治疗HIV感染。优选的治疗剂是核苷酸逆转录酶抑制剂(NRT1)-替诺福韦(tenofovir)。替诺福韦是腺苷单磷酸的类似物，并且表征为脂肪族核苷磷酸。替诺福韦以前药(富马酸替诺福韦二吡呋酯)口服施用。这种前药在胞内通过磷酸化转化成其活性形式，二磷酸替诺福韦酯，并且在HIV逆转录酶积极产生病毒DNA时发挥链终止剂的作用。
在本发明的一个实施方案中，替诺福韦通过可降解的硫酯键与巯基聚合物连接。替诺福韦直接连接或通过接头连接，所述接头优选地具有2-12个并且更优选地具有2-6个碳长度。聚合物上的替诺福韦部份优选地为1-8个，更优选1-4个。在本发明的另一个实施方案中，治疗剂被动携裹至水凝胶基质中。治疗剂的其他例子包括但不限于UC781；核苷逆转录酶抑制剂(NRTI)，如齐多夫定(zidovudine)、去羟肌苷(didanosine)、扎西他滨(zalcitabine)、司他夫定(stavudine)、拉米夫定(lamivudine)、阿巴卡韦硫酸盐(abacavir sulfate)、恩曲他滨(emtricitabine)等；非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)，如奈韦拉平(nevirapine)、地拉韦定(delaviridine)、依非韦伦(efavirenz)、entavirine等；蛋白酶抑制剂(PI)，如甲磺沙奎那韦酸(saquinavir mesylate)、利托那韦(ritonavir)、茚地那韦(indinavir)、甲磺酸奈非那韦(nelfinavir mesylate)、安普那韦(amprenavir)、福沙那韦钙(fosamprenavir calcium)、硫酸阿扎那韦盐(atazanavirsulfate)、洛匹那韦(lopinavir)和利托那韦(ritonavir)、替拉那韦(tipranavir)、地瑞那韦(darunavir)等；进入和融合抑制剂如马拉韦罗(maraviroc)、enfuviritide等；和整合酶抑制剂如拉替拉韦(raltegravir)等。
本发明还提供了用于制备本发明水凝胶的方法。在一个实施方案中，通过以下方式制备水凝胶：将某个量的包含与每条臂偶联的巯基反应性官能团的多臂聚乙二醇交联单位与某个量的多臂聚乙二醇纳米载体单位合并，其中每个纳米载体单位包含与一半所述臂偶联的巯基和与每个纳米载体单位的剩余臂偶联的试剂，并且每种试剂选自pH降低剂、生物粘合剂、杀微生物-杀精剂和抑制游离的和与细胞结合的HIV结合的试剂；其中所述交联单位和所述纳米载体单位的量足以在合并时产生水凝胶。在一个实施方案中，与相同聚合物单位组合的每个纳米载体单位包含不同的试剂。
本发明还提供了用于制备基于聚环氧烷的多功能水凝胶的试剂盒，所述试剂盒包含：(a)某个量的包含与每条臂偶联的巯基反应性官能团的多臂聚乙二醇交联单位；和(b)某个量的多臂聚乙二醇纳米载体单位，其中每个纳米载体单位包含与一半所述臂偶联的巯基和与每个纳米载体单位的剩余臂偶联的试剂，并且每种试剂均选自pH降低剂、生物粘合剂、杀微生物-杀精剂和抑制游离的和与细胞结合的HIV结合的试剂；其中所述交联单位和所述纳米载体单位的量足以在合并时产生水凝胶。
本发明还涉及通过以下方式预防性降低患者细菌性阴道病形成风险的方法：向该患者阴道内施用包含细菌性阴道病预防有效量的枯草溶菌素的组合物。在另一个实施方案中，所述组合物还包含选自甘油单月桂酸酯、月桂酰精氨酸酯、聚赖氨酸和乳酸锌的抗微生物剂。
本发明还提供了通过以下方式治疗患者中细菌性阴道病的方法：向所述患者阴道内施加治疗有效量的枯草溶菌素或向患者施加治疗有效量的枯草溶菌素和选自甘油单月桂酸酯、月桂酰精氨酸酯、聚赖氨酸和乳酸锌的抗微生物剂。本发明还涉及多种组合物，所述组合物包含抗微生物有效量和/或杀精有效量的枯草溶菌素，所述枯草溶菌素掺入到可药用水溶液、非水溶液、纳米纤维、水凝胶、凝、纳米凝胶、悬剂、油膏剂、胶剂、插入物、栓剂、海绵、油膏剂、霜剂、泡沫剂、起泡片剂或灌洗剂中。
枯草溶菌素A(常见称作枯草溶菌素)由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefacins)产生并且具有在经表征的细菌素中特有的环状交联结构。细菌素是由细菌产生的通过核糖体合成的肽，所述肽具有对抗与生产该肽的物种密切相关的生物的抗微生物活性。
“细菌性阴道病预防有效量”在本文中用来意指该量在期望部位产生足以抑制患者形成细菌性阴道病的枯草溶菌素浓度。
“治疗有效量”在本文中用来意指该量在感染部位产生足以治疗性改善或减少疾病影响的枯草溶菌素浓度。正在治疗的疾病可以是该疾病在患者中的首次发生或复发。
“抗微生物有效量”用来意指该量产生足以杀死一种或多种微生物或抑制其生长(例如兼性需氧和厌氧微生物，包括但不限于阴道加德纳菌和普雷沃菌、消化链球菌、卟啉单胞菌和动弯杆菌菌种；野生型细菌；和抗生素耐药性细菌性阴道病相关细菌)的枯草溶菌素浓度。
“杀精有效量”在本文中用来意指该量产生足以杀死精子或使其失能的枯草溶菌素浓度。
可以施用本发明中使用的组合物，以预防或治疗细菌性阴道病或杀死精子或使其失能。对于局部施用，合适的载体或媒介包括极性、质子性溶剂，如，水或生理盐水、非极性溶剂、脂类、膏剂、胶剂、插入物和起泡插入物(栓剂、海绵等)、油膏剂、霜剂、泡沫、灌洗液、纳米纤维、水凝胶、凝胶、纳米凝胶等。组合物也可以悬于不与水可溶混的悬液介质(例如，矿脂)中或可以配制于乳液(油包水或水包油)中。更具体地，组合物可以阴道内施加，以预防或治疗细菌性阴道病。含有枯草溶菌素的局部用组合物可能例如用涂抹器或阴道内装置施加，或者局部用组合物可以涂布在男用或女用避孕套或其他性阻隔装置(如阴道隔膜、子宫帽等)上。
对于局部应用，可药用的载体可以额外地包含有机溶剂、乳化剂、胶凝剂、保湿剂、稳定剂、表面活性剂、润湿剂、防腐剂、缓释剂和少量湿润剂、螯合剂、染料、香料以及局部施用药物组合物中常用的其他组分。
用于局部(topical)施用的固体剂型包括栓剂、粉剂和颗粒剂。在固体剂型中，组合物可以与至少一种惰性稀释剂如蔗糖、乳糖或淀粉混合，并且可以额外地包含润滑剂、缓冲剂和本领域技术人员熟知的其他组分。
本发明的组合物还可以浸渍至吸附性基底材料(如海绵)中或涂覆到固体基底材料的表面(如男用或女用避孕套、阴道隔膜、子宫帽或医用手套)上，以将组合物递送至阴道上皮或其他可能感染的上皮。这种类型的其他制品和递送系统将是本领域技术人员轻易显而易见的。
用包含枯草溶菌素的组合物涂覆避孕套的方法包括通过滴(dropping)、浸渍(dipping)、涂布或喷洒含有枯草溶菌素的溶液而涂布避孕套的整个表面或必需部分。避孕套涂布方法是熟知的，并且可以将枯草溶菌素组合物掺入到已知的避孕套涂层组合物中，包括润滑剂组合物。优选的涂布组合物包含硅，所述硅产生润滑性并且以缓释方式释放组合物。以这种方式，可以获得具有杀精和/或抗微生物作用和润滑作用的避孕套。也可以使用生物粘合聚合物用来延长所用的特定局部用药物或其他药物的缓释(time-release)方面。枯草溶菌素也可以在制造期间通过本领域已知的方法浸渍至避孕套中。
施加在一个避孕套上的枯草溶菌素的量可以是这样的任何量，其提供所需的预防性作用，同时副作用小或没有副作用，优选地是约0.001mg至约1000mg。涂布避孕套的一个侧面或内侧面和外侧面两面。
在本发明中，通常以这种剂量施用枯草溶菌素，以实现期望作用，同时副作用有限或没有副作用。虽然实际剂量应当根据医生的判断确定，但可药用载体中的优选浓度可以按重量计为约0.00005%至约5%。
下文所述的非限制性例子描述了本发明的某些方面。
实施例
非官能化水凝胶的特征
原位形成的水凝胶具有两种组分：聚合物和交联剂。在图1(左小图)中显示了两种溶液，具有聚合物的筒具有与之混合的蓝色染料(下筒)，无色的筒含有交联剂溶液(上筒)。按压活塞时，液体在它们通过喷嘴时混合并立即形成水凝胶(见图1右小图中的平板上含有蓝色染料的水凝胶)。图2中显示了用于产生水凝胶的反应方案。一旦聚合物和交联性纳米载体相遇，则立即形成水凝胶网络，甚至所述溶液会静止一段时间。可能在这段时间在水凝胶中被动携裹了小颗粒，形成牢固的粘弹性水凝胶。牢固比率取决于交联性纳米载体的性质。
当50%的臂具有TP基团(如图2)且50%的臂被RGD肽置换时，在约10分钟内发生牢固胶凝。当所有8个臂仅具有TP基团时，在不到1分钟内发生牢固胶凝。交联网络在水凝胶的TEM图像中清晰可见(图3)。进行应变扫描试验(结果未显示)，以建立线性粘弹性谱图(regime)和检验具有不同量交联剂的两种水凝胶在弹性方面的差异(通过贮能/弹性模量的值(G')表示)。应变扫描试验结果显示，G'在两种水凝胶中占优势，并且这得到了频率扫描试验所得结果的支持(图4)，这表明G'大于G''(损耗模量)。这提示，两种水凝胶在所研究的频率范围内均具有高弹性并且在应变下具有抗结构变化的能力。两种水凝胶之间的差异最小，这表明改变聚合物和交联组分并不会严重改变水凝胶的物理特性。基于非官能化水凝胶的这些结果，证明了交联纳米载体形成水凝胶的可行性。预期这种水凝胶将拥有良好阻隔膜的物理属性：它们是高度可分散的，从而提供对不规则表面的广泛覆盖；拥有足以延迟病毒扩散的粘度；并且具有出色的弹性特性以抵抗物理应变，从而允许水凝胶屏障在身体活动期间保持完整。
用于更高粘膜水凝胶滞留(mucosal hydrogel retention)和HIV结合抑制的粘合性RGD纳米载体
已知RGD序列优先结合α,β-整联蛋白。结果，RGD粘合性纳米载体应促进水凝胶和阴道粘膜之间更强的接触。显示了含有RGD的水溶性纳米载体的合成。使用图5A所示的合成方案，合成并表征了每个纳米载体含有4条附加RGD肽的RGD-PEG纳米载体。使用ESI-质谱、NMR、XPS和DSC表征全部中间体和最终的RGD-PEG纳米载体。图6显示了8臂PEG-RGD纳米载体的DSC结果。-15.6°C的移动证实了RGD与PEG的结合。将荧光标签(FITC)连接在RGD肽上(结果未显示)，以测试细胞表面粘合。证明了制备RGD纳米载体交联剂在合成上的可行性。
4臂和8臂PEG-RGD纳米载体的合成和表征
将RGDC肽(100mg，0.0mM)溶解于含有10%二甲基甲酰胺(DMF)的磷酸钠缓冲液(8ml，0.1M，pH7.4)中，并向其中添加1,6-己烷-双乙烯基砜(HBVS)(6当量，356.4mg)(图5B，步骤1)。将反应混合物室温搅拌8小时。使用二氯甲烷(DCM)作为洗脱剂，在二氧化硅柱上纯化产物RGDC-HBVS。使用MALDI-TOF质谱仪表征结合物。
将4臂或8臂PEG20kDa-巯基聚合物(30mg)溶解于磷酸钠缓冲液(0.1M，pH7.4)中，并且向其中添加用HBVS接头修饰的RGDC肽(3当量，3.2mg)。将反应混合物室温搅拌8小时(图5B，步骤2)。使用去离子(DI)水作为洗脱剂，在Sephadex G25尺寸排阻柱上纯化PEG20kDa-RGD纳米载体。在冷冻干燥后获得纯化的纳米载体。使用凝胶渗透层析(GPC)和/或MALDI-TOF质谱表征纳米载体。
4臂和8臂PEG-LA纳米载体的合成和表征。
多个拷贝的乳酸通过可降解的硫酯键与4臂和8臂PEG20kDa-SH聚合物连接(图7)。在二环己基碳二亚胺(DCC)存在下用N-羟琥珀酰亚胺活化乳酸以形成N-羟基琥珀酰亚胺基乳酸酯。所述酯随后在4-二甲氨基吡啶(DMAP)存在下室温与4臂PEG20kDa-SH和8臂PPEG20kDa-SH反应。通过从醚中沉淀并随后干燥，获得纯纳米载体。使用凝胶渗透层析(GPC)测定PEG-LA纳米载体的纯度和分子量(图8)。由GPC层析图估计4臂和8臂PEG-LA纳米载体的滞留时间为8.6分钟和9.09分钟。通过Ellman测定法量化纳米载体的游离巯基含量，估计纳米载体的乳酸荷载效率。Ellman测定法显示，0.1mM8臂PEG-LA纳米载体中有0.403mM乳酸(每分子4个拷贝乳酸)。Ellman测定法显示，乳酸荷载效率在21-85%的范围内。
基于PEG-LA纳米载体的水凝胶的合成和表征
使用可降解的硫酯交联，如下制备水凝胶：将8臂PEG-LA纳米载体(4%、6%和8%；w/v)与含不同量(4%至16%)的4臂PEG20kDa-NHS交联剂的磷酸钠缓冲液(20mM，pH7.4)在室温下混合，并且记录水凝胶形成的时间(图10和11)。PEG-LA纳米载体与4臂PEG-NHS交联剂在约1.5分钟内形成水凝胶。
使用平行板几何形状(平板直径：20mm，间隙：300μm)的流变仪在37°C进行流变学测量。在斜坡升温至37°C之前，在室温下使PEG-LA水凝胶(4%和6%w/v，1:2)在平行平板之间形成。使用动态振荡试验，作为应变和频率的函数测定水凝胶的弹性/储能模量G'和粘性/损耗模量G''。首先，以恒定频率1Hz进行应变扫描试验，以确定线性粘弹性图谱。接下来，以1%的恒定应变实施频率扫描试验(0.1-1Hz)。所有流变学测量均一式三份进行并且以均数±SEM表示。发现，在所测试的频率范围内G'高于G''，这表明水凝胶弹性大于粘性(图34)。另外，贮能模量仅随频率略增并达到平台期，这表明水凝胶可以抵抗应变下的结构变化。
基于PEG-LA水凝胶的这些结果，证明了具有其他功能性的交联纳米载体形成水凝胶的可行性。预期水凝胶将拥有良好阻隔膜的物理属性：它们是高度可分散的，从而提供对不规则表面的广泛覆盖；拥有足够粘度，以延迟病毒扩散；并且具有出色的弹性特性以抵抗所施加的应变，从而使水凝胶屏障在身体活动期间保持完整。
制备具有被动携裹的乳酸的水凝胶
室温下在PB中混合8臂PEG-SH(4%，6%和20%w/v)与200μg乳酸和4臂PEG20kDa-NHS(8%和20%w/v)或8臂PEG20kDa-NHS(20%w/v)。下表中显示这些水凝胶的形成时间。
具有被动携裹的乳酸的水凝胶的形成时间；均数±S.D.，n=3
8臂PEG20kDa-SH(mg) 4臂PEG20kDa-NHS(mg) 水凝胶形成时间(分钟)
4 8 9.8±0.2
6 12 6.6±0.2
20 20 1.67±0.1
PEG-LA纳米载体、基于PEG-LA纳米载体的水凝胶和具有被动携裹的乳酸的水凝胶中的乳酸释放
将8臂PEG-LA纳米载体(1mg/100μl)溶解于磷酸钠缓冲液(20mM，pH7.4)中。用3.6ml PBS(10mM，pH7.4)或乙酸盐缓冲液(pH4.3)在37°C透析溶解的8臂PEG-LA、PEG-LA水凝胶和具有被动携裹的乳酸的水凝胶。以预定的时间间隔抽取等分试样(1ml)并补充介质。按照制造商的操作方案，使用乳酸测定试剂盒(BioVision,Inc.)量化释放的乳酸量(在570nm的O.D.)(图9A-9C)。发现乳酸从纳米载体中的释放是pH依赖性的；与生理pH相比(PBS，pH7.4，半寿期：6.8小时)，在酸性pH中更快(乙酸盐缓冲液，pH4.3，半寿期：4.6小时)。基于纳米载体的水凝胶提供数小时的乳酸控释(在PBS中t1/2=20.03小时；在乙酸盐缓冲液中t1/2=93.11小时)。
水凝胶溶胀和降解研究
将水凝胶称重(W0)并浸于PBS(1.0mL，10mM，pH7.4)或乙酸盐缓冲液(pH4.3)中，并在37°C孵育。以预定时间间隔抽取缓冲液并记录水凝胶重量(Wt)。溶胀比率计算为Wt/W0×100，并且对时间作图(图12a和12b)。发现水凝胶在PBS中降解少于48小时并且在VFS中降解超过5天。基于PEG-LA纳米载体的水凝胶在PBS(pH7.4)和乙酸盐(pH4.3)缓冲液中均显示浓度依赖性溶胀行为(8%>6%>4%)。
水凝胶溶胀和降解研究
将水凝胶称重(W0)并浸于PBS(1.0mL，10mM，pH7.4)或乙酸盐缓冲液(pH4.3)中，并且在37°C孵育。以预定时间间隔抽取缓冲液并且记录水凝胶重量(Wt)。溶胀比率计算为Wt/W0×100，并对时间作图(图12A和12B)。发现水凝胶在PBS中降解少于48小时并且在VFS中降解超过5天。基于PEG-LA纳米载体的水凝胶在PBS(pH7.4)和乙酸盐(pH4.3)缓冲液中均显示浓度依赖性溶胀行为(8%>6%>4%)。
结合HIV毒粒的稳定聚集的聚阴离子纳米粒子
确定产生稳定聚集的PEG纳米凝胶粒子的可行性。使用一步合成法制备PEG纳米凝胶(～20nm)。如图13中所示，使用HVBS接头以不同化学计量比(1:1、0.5:1和0.8:1)交联20kDa的8臂PEG-SH纳米载体。使用多种不同条件(超声波处理、表面活性剂、搅拌速率和持续期)，使这些纳米粒子以1微米至数百微米的多个尺寸稳定聚集。由图14中的TEM可以看出，产生了纳米凝胶(小图A)、小微米尺寸范围内的稳定纳米凝胶聚集物(小图B)和大微米尺寸范围内的聚集物(小图C)。产生了将荷载至水凝胶基质中的粒子。
枯草溶菌素A：来自解淀粉芽孢杆菌的安全的杀微生物蛋白质
枯草溶菌素针对阴道加德纳菌的抗微生物活性使其成为纳入本发明的杀微生物水凝胶中的主要候选物。使用EpiVaginal Tissue ModelTM(MatTekCorp.)检测枯草溶菌素的毒性，所述模型利用无病毒感染、酵母感染和细菌感染的人阴道外宫颈细胞。将这种三维组织模型暴露于枯草溶菌素和其他抗微生物化合物，以测定延长暴露如何影响细胞存活。将存活力计算为外宫颈细胞将黄色化合物MTT分解成紫色甲臜的比例。在24小时后，大约93%的细胞仍有活力，在48小时后存活力仅略微下降至73%(图15)。这与来自阳性对照壬苯醇醚-9的结果形成鲜明对比。仅4.9小时后，具有经证明的细胞毒性的这种常用杀精剂造成细胞存活力下降50%。
枯草溶菌素A：杀精性杀微生物剂
处于临床开发的用于预防性传播感染的几种杀微生物剂(包括最近已经终止试验的那些杀微生物剂)具有避孕性能(例如，Pro2000、SAVVY、VivaGel、硫酸纤维素)。然而，正在开发的这些杀微生物剂均无杀精性。它们的避孕作用由其影响精子功能的作用(而非细胞死亡)介导。尽管避孕活性在一些情况下相当好(例如，硫酸纤维素)，但是它取决于产品的正确计时和放置。真正杀精的避孕杀微生物剂将不如此依赖于这些变量，并且将可能更有效。发明人测试了枯草溶菌素对人精子运动性的影响，结果令人鼓舞。通过使整个精液暴露于不同浓度的枯草溶菌素，实施这项研究。在添加化合物至精液后30秒，显微镜观察每份样品的精子运动性和前向运动(forward progression)。枯草溶菌素溶液以剂量依赖方式降低活动精子的比例(图16)。运动性是对照的0%至88%。与对照样品相比，使用枯草溶菌素的全部样品活动精子均减少(P<0.05，Newman-Keuls多重范围检验)。枯草溶菌素以剂量依赖方式降低前向进展。对照样品中显示前向运动的活动精子的比例超过70%。在50μL枯草溶菌素存在下，降至50-70%，而100μL枯草溶菌素将前向运动降低至大约10%。在200μL枯草溶菌素时，不存在前向运动并且大多数精子尾变得卷曲。尾部卷曲被认为是一种精子畸形，表示质膜损伤。
由解淀粉芽孢杆菌产生的枯草溶菌素
细菌菌株、生长条件和培养基
通过将1ml产品稀释至20ml MRS培养基(DifcoTM，Detroit，MI)中，从酸奶增香的培养饮料YoguFarmTM(JSL Foods,Los Angeles,CA)分离解淀粉芽孢杆菌，其中所述培养饮料从Hong Kong Market,New Brunswick,NJ购买。将培养物在37°C、5%CO2气氛中无搅拌下孵育48小时。接种的平板也在相同的条件下孵育。用相差显微术检查液体培养物的样品，以观察基本细胞特征。将培养样品送至分子遗传学实验室(康奈尔大学，Ithaca，NY)用于核糖体分型，并送至Accugenix(Newark,DE)用于16S核糖体RNA(rRNA)分析以证实生物的未知身份。在30°C在补充有0.6%酵母提取物(DifcoTM)的胰蛋白胨大豆培养液中有氧条件下培育藤黄微球菌(Micrococcus luteus)ATCC10420、单核增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)ScottA和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)ATCC14028-1s。在37°C在MRS培养液中有氧条件下将戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)ATCC43200培育24小时。在HBT琼脂(BD，Franklin Lakes，NJ)上培育阴道加德纳菌ATCC14018，同时在含有5%绵羊血(BD)的Columbia琼脂上培育无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)(链球菌B群)。两种生物均在36°C、5%CO2气氛无搅拌下孵育。在孔扩散测定法中所用的指示菌株从ATCC保藏中心获得或为来自伊利诺伊州芝加哥Rush Presbyterian医学中心的临床分离株(图19)。
样品准备
在37°C、5%CO2气氛下孵育从MRS培养液收获的无细胞上清液(CFS)48小时(直至大约106CFU ml-1)。通过在4°C以4500xg离心(Hermle Z400K，LabNet，Woodbridge，NJ)25分钟，从培养物中除去细胞。使用0.45μm微量滤器(Fisher,Pittsburgh,PA)将上清液过滤除菌。
抗微生物活性测定
根据Cintas,L.M.等人,"Isolation and characterization of pediocin L50,anew bacteriocin from Pediococcus acidilactici with a broad inhibitory spectrum."Appl Environ Microbiol61,2643-48(1995))所述，通过以下修饰，实施孔扩散抑制测定。使用针对MRS培养液的CFS作为阴性对照并使用乳酸链球菌素(nisin,10mg ml-1)(Sigma,St.Louis,MO，溶解于ddH2O中的2.5%细菌素制备物[106IU g-1])作为阳性对照，测试解淀粉芽孢杆菌产物在抑制各种微生物生长方面的功效。根据其具体生长要求过夜培育指示生物，基于藤黄微球菌已知的细菌素敏感性，使用它作为标准。Pongtharangkul,T.和Demirci,A.,"Evaluation of agar biodiffusion assay for nisin quantification,"Appl MicrobiolBiotechnol65,268-72(2004)。通过添加0.7%琼脂至TGY或MRS产生软琼脂；固体基础平板在使用之前于无菌通风橱内干燥大约90分钟，以除去任何外部水分。为产生覆盖物，将指示生物以每10ml软琼脂100μl细菌培养物的比率添加至软琼脂(大约106CFU ml-1)。将4ml这种混合物覆盖到每块基础平板上并使之完全固化。使用巴氏吸管在覆盖的基础平板中产生5mm孔。随后使这些孔干燥大约30分钟。随后，将50μl每份样品添加至各孔并允许自由扩散45-60分钟。随后将全部平板在指示生物的最佳生长条件下孵育过夜(图19)。用于测试针对临床分离株的活性的方法与先前所述方法略有不同。使用无菌拭子将指示生物作为菌苔接种，并且在晾干5分钟后，使用无菌玻璃试管，向琼脂冲压出17mm的孔，并加入400μl CFS。将平板室温保持2小时以允许吸收上清液，并随后在36°C、5%CO2气氛下孵育过夜。
乳酸浓度的确定
根据制造商的操作方案，使用D-乳酸/L-乳酸测试试剂盒(RocheBoehringer，Mannheim，德国)测定CFS中的乳酸浓度。在完成操作方案的步骤后，将采集的数据应用于所提供的方程，以精确计算样品中每种酸形式的量。
酶消化证实抗微生物化合物的蛋白质性质
使CFS过夜暴露于7种不同酶(Sigma；图20)以确定造成细菌生长抑制的化合物的类型。将CFS的等分试样(250μl)与等体积的酶合并，并将混合物的pH和孵育温度调节至最佳酶活性的值。使用两种对照：(i)与无菌MRS培养基混合的酶，和(ii)CFS和酶稀释液(图20)。在24小时后，将全部样品的pH再调节至约6，以达到最大抗微生物活性。针对指示物藤黄微球菌，一式三份实施孔扩散测定法。
蛋白质可视化
使用在Bio-Rad制胶仪(Bio-Rad，Hercules，CA)中产生的Tris-Tricine凝胶，实施SDS-PAGE。在凝胶上加载20μl标记物或200μl样品[1:1样品+上样缓冲液(Bio-Rad)]。使用乳酸链球菌素(106IU g-1，2mg ml-1)作为阳性对照。该过程在配有Power-Pac300电源(Bio-Rad)的Mini-Protean3(Bio-Rad)室中的0.2mol l-1Tris-碱阳极运行缓冲液(pH=8.9)和0.1mol l-1Tris/0.1moll-1Tricine/0.1%SDS阴极运行缓冲液(pH=8.25)内实施。
电泳结束后，将凝胶切成相等两半，一半按覆盖方法处理，而另一半用于染色过程。将覆盖凝胶在100ml10%乙酸/20%异丙醇缓冲液中固定2小时，在2小时内，在100ml ddH2O中洗涤3次，并在4°C下于ddH2O中贮存过夜(全部步骤均在转动下进行)。次日，将它覆盖到干燥的富集TSA平板上并用藤黄微球菌覆盖。根据制造商的银染操作方案(Bio-Rad)处理染色凝胶。
蛋白质纯化
使用储备的过夜培养物，接种解淀粉芽孢杆菌(大约106CFU ml-1)并在正常条件下在500ml MRS中培育。通在12120x g离心25分钟除去细胞。将CFS如先前所述那样过滤除菌。使用列线图计算实现30%饱和度所需固体硫酸铵的量，将所述量的固体硫酸铵添加至在4°C搅拌下孵育过夜的溶液中。次日，如上文所述通过离心收集沉淀物并将其重新溶解于20ml ddH2O中。在扩散测定法中，测试沉淀物和上清液针对藤黄微球菌的活性。使用沉淀物进行进一步的全部实验并且将其命名为“样品”。
用
Figure BDA00003511572900211
Light C18管柱(Waters，Milford，MA)实现对30%硫酸铵沉淀物的进一步纯化，以基于假定的疏水性质分离目的蛋白。在每种情况下，使0.5ml液体以0.2ml min-1流速通过柱子。管柱开始用0.5ml100%甲醇洗涤并通过4次0.5ml ddH2O洗涤平衡，以除去任何痕量甲醇。在水洗涤后，将样品加载到管柱上并收集流过液(flow-though)。之后是另外4次0.5mlddH2O洗涤，单独收集每个级分。在水洗后，立即将柱子依次用50%、70%、90%和100%甲醇1ml洗涤，并收集各级分0.5ml。通过孔扩散测定法验证抗微生物活性。
温度和pH对抗微生物活性的影响
通过将样品在给定温度孵育0-60分钟，测试化合物在温度升高时保留活性的能力。在每个时间点后，获得200μl等分试样，并用ddH2O产生2倍连续稀释物。将每种稀释物用于孔扩散测定法中；将维持活性的最低稀释度的倒数值视为任意单位(AU)ml-1的蛋白质浓度。
测试样品在不同pH水平下的抗微生物活性水平。使用3mol l-1HCl或NaOH，调节溶液的pH以落入2-10的范围内。在实施针对藤黄微球菌的孔扩散测定法之前，将样品在室温孵育1分钟。
遗传分析
使用Promega Wizard SV基因组DNA试剂盒(Promega Corp，Madison，WI)，通过如下修改，从解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌ATCC6633的过夜培养物提取DNA。在离心管中通过13,000xg离心3分钟从所述培养物(2x1.5ml)收获细胞，并使细胞重悬于382μl0.5mol l-1EDTA(pH8.0)中。向其中添加100μl溶菌酶(20mg ml-1)、10μl蛋白酶K(20mg ml-1)和8μl突变溶菌素(2.5Uμl-1)。将混合物在37°C孵育60分钟，此后添加200μl核裂解溶液和5μlRNA酶A，并在65°C孵育20分钟。立即添加250μl裂解缓冲液，随后根据制造商的说明书使用所提供的离心柱纯化DNA，并洗脱于100μl无核酸酶的水中。
进行聚合酶链式反应(PCR)，以评估解淀粉芽孢杆菌产生的细菌素与枯草芽孢杆菌产物枯草菌素和枯草溶菌素之间的相关性。使用枯草芽孢杆菌基因组(GenBank登录号#AJ430547)设计引物(图21中列出)，以特异性识枯草菌素(spaS)和枯草溶菌素(sboA)的功能基因。向由每种引物、核苷酸、缓冲液和HotMaster Taq组成的主混合物(Eppendorf，Hamburg，德国)添加来自解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌ATCC6633的基因组DNA。使用AppliedBiosystems GeneAmp PCR仪2400(Applied Biosystems,Foster City,CA)按以下参数实施PCR：在94°C变性30秒，在55°C(spaS)或50°C(sboA)退火30秒并且在65°C延伸1分钟，总计30个循环。使用ABI Prism3730x1DNA分析仪(GeneWiz,Inc.,South Plainfield,NJ)对PCR产物测序，并且使用VectorNTI软件包程序(Invitrogen，Carlsbad，CA)分析所得到的序列。获得解淀粉芽孢杆菌的序列已经以登录号EU105395提交至GenBank。
未知分离株的表征
尽管Yogu FarmTM饮料声称含有乳杆菌培养物，但是解淀粉芽孢杆菌是从4个独立批次的产品中回收的唯一生物。每份细菌生长样品的相差显微术显示出单个生物，它是非常活泼的产内生孢子的芽孢杆菌。在固体琼脂上，菌落往往迅速扩展形成菌苔，伴以极为褶皱的质地。这种生物似乎从菌落分泌一种粘稠、不透明黏质物，稍后显示这种黏质物是淀粉水解酶-淀粉酶的副产物。核糖体分型和16S rRNA分析确定这种细菌是解淀粉芽孢杆菌，其是与枯草芽孢杆菌物紧密相关的物种。
抗微生物活性的范围
确定解淀粉芽孢杆菌培养物的CFS，以获得针对包括病原体单核增生李斯特菌、阴道加德纳菌和无乳链球菌在内的广泛类型细菌物种的抗微生物活性。对还从临床环境收集的几个阴道益生性乳酸杆菌菌株无活性(图19)。
乳酸浓度的确定
使用制造商操作方案提供的方程，在3个独立实施的测定中确定解淀粉芽孢杆菌产生十分低水平的D-乳酸和L-乳酸。计算显示，每份样品的平均数为0.17g l-1D-乳酸，该值与所测空白的值相等。L-乳酸的平均浓度升至2.22g l-1，其略高于空白的浓度值0.15g l-1(图22)。两种形式乳酸的十分低的浓度表明，它们在微生物抑制方面没有发挥明显作用，并且所检测到的所有活性都可能归因于细菌素。
酶消化、温度和pH对抗微生物活性的影响
抑制测定显示，活性在胃蛋白酶和蛋白酶K存在下彻底丧失，被胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶显著地下降，从而证实该化合物的蛋白质性质(图20)。暴露于越来越高的温度下没有对蛋白质产生明显影响，在样品于100°C加热60分钟后仍存在活性(64AU)(图23)。在范围从2-10的任何pH值下，活性也不下降，虽然事实上CFS的pH通常为中性(约6.5)(数据未显示)。
蛋白质纯化
蛋白质在30%硫酸铵浓度下从溶液中完全沉淀下来，并且在SDS-PAGE凝胶上证实了细菌素(bacteriocin)的存在，其在覆盖部分中有大抑菌区并且对应于已知的枯草溶菌素尺寸(数据未显示)。
抑制测定表明，90%的甲醇将所述蛋白质独自且完全地从柱中洗脱下来。抑制测定还证实，活性完全因抗微生物肽引起并且不是来自甲醇的背景活性。
遗传分析
PCR分析显示，解淀粉芽孢杆菌对编码枯草菌素(spaS)的功能基因呈阴性，但是对编码枯草溶菌素(sboA)的功能基因呈阳性。将从解淀粉芽孢杆菌扩增的PCR产物的DNA序列与来自枯草芽孢杆菌ATCC6633的DNA序列比较，显示91.7%的同一性。在sboA中仅存在3个碱基对变化，它们均不影响蛋白质的氨基酸序列。还鉴定到sboX同源物(95%同一性)，这是一种推定编码细菌素样物质并与sboA重叠的基因。编码YwiA(albA)的基因处于编码SboA的基因下游，并且据信在枯草溶菌素的翻译后修饰方面发挥作用。由于两种基因产物的总体相似性，对该基因之前的序列和基因间序列进行了比较，分别发现具有95.6%和85%的相似性。
抗微生物活性的分析
细菌菌株和生长条件
将阴道加德纳菌ATCC14018的储备培养物保持在-80°C下补充有3%马血清(JRH Biosciences,Lenexa,KS)和15%甘油的BHI培养液(Difco，Sparks，MD)中。在37°C无振荡下在BHI培养液+3%马血清中厌氧培育阴道加德纳菌的培养物。在37°C无振荡下在MRS培养液(Difco)中过夜培育解淀粉芽孢杆菌培养物。初始培养物在用于实验测试之前继代培养多次。
抗微生物溶液的制备
按照Sutyak等人,"Isolation of the Bacillus subtilis antimicrobial peptidefrom the dairy product-derived Bacillus amyloliquefaciens,"J.Appl.Microbiol.104:1067-74(2007)所述，制备部分纯化的枯草溶菌素制备物。根据Turovskiy等人,"Lactocin160,a bacteriocin produced by vaginal Lactobacillus rhamnosus,targets cytoplasmic membranes of the vaginal pathogen,Garclnerella vaginalis,"Probiotics Antimicrob.Proteins1:67-74(2009)给出的操作方案，制备乳酸链球菌素(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO；100AU/mL)。
ATP流出测定
使用ATP生物发光测定试剂盒(Sigma-Aldrich)和LuminoskanTM单管光度计(Labsystems，赫尔辛基，芬兰)，通过先前建立的生物发光方法(Guihard等人,"Phosphate efflux through the channels formed by colicins and phage T5inEscherichia coli cells is responsible for the fall in cytoplasmic ATP,"J.Biol.Chem.268:17775-80(1993))和Turovskiy等人的改进形式，评估枯草溶菌素对阴道加德纳菌细胞中的ATP耗尽的影响。这种试剂盒将ATP释放与因萤火虫萤光素酶在ATP和Mg2+存在下氧化D-萤光素分子而产生的相对荧光相关联。将阴道加德纳菌细胞在补充有3%马血清的15mL BHI培养液中过夜培育至OD660≈0.6。一旦它们达到合适的生长期，将细胞在室温以4500g离心15分钟(Hermle Z400K；LabNet，Woodbridge，NJ)，随后用50mmol/LMES缓冲液(pH6.5)洗涤一次。随后将细胞在室温维持5分钟，此后为激发(energization)期，在该时期使细胞重悬于体积为其初始体积一半的含0.2%葡萄糖的50mmol/L MES缓冲液(pH6.5)中并室温保持20分钟。在激发后，通过在前述条件下离心收集细胞并重悬于体积为其初始体积一半的50mmol/LMES缓冲液(pH6.5)中。将悬液以100μL体积等分至1.5mL无菌微量离心管中，并添加20μl适宜的处理液(appropriate treatment)。根据Winkowski等人,"Correlation of bioenergetic parameters with cell death in Listeria monocytogenescells exposed to nisin,"Appl.Envrion.Microbiol.60:4186-88(1994)所述，使用终浓度为2μg/mL枯草溶菌素，而阳性对照(细菌素乳酸链球菌素)达到终浓度1.5μg/mL。使用枯草溶菌素稀释剂(ddH2O)和乳酸链球菌素稀释剂(0.02M氢氯酸，pH1.7)作为阴性对照。随后使每份样品在室温保持5分钟，之后记录生物发光测量值。
通过将20μl最终细胞悬液与4.9mL冰冷ddH2O和80μL DMSO合并，测量阴道加德纳菌细胞中的总ATP浓度。选择DMSO的原因在于，已知它能够彻底裂解细菌细胞，由此释放全部胞内ATP。所获得的阴性对照的数据是极其均一的，从而可以将全部其他结果相对于这些数据的平均数归一化并表示为百分比值。
枯草溶菌素对阴道加德纳菌中质子动力势(PMF)的影响
ΔΨ消散测定
根据Sims等人,"Studies on the mechanism by which cyanine dyes measuremembrane potential in red blood cells and phosphatidylcholine vesicles,"Biochemistry13:3315-30(1974)的操作方案和Turovskiy等人概述的改进形式，评估枯草溶菌素影响阴道加德纳菌细胞跨膜电势(ΔΨ)的能力。
简而言之，将阴道加德纳菌细胞如先前所述培育至OD600为0.6，收获，随后洗涤一次并重悬于体积为其初始体积的1/100的新鲜培养基中。使用PerkinElmer LS-50B荧光光谱仪(PerkinElmer Life and Analytical Science,Inc.,Boston,MA)，在狭缝宽度为10nm并且激发波长和发射波长分别为643nm和666nm的情况下，在22°C监测作为探针碘化-3,3ˊ-二丙基硫杂二羰花青[DiSC3](Molecular Probes,Eugene,OR)的荧光强度的函数的细胞ΔΨ。最初，将5μl探针以终浓度5μmol/L添加至含补充有3%马血清的2mL新鲜BHI培养液的石英小杯(10mm光程)中。之后添加20μl细胞悬液，这造成荧光立即下降。一旦信号平衡，使细胞暴露于2μL5mM尼日利亚菌素(nigericin，Sigma)，以将ΔpH转化成ΔΨ。在信号稳定后，添加枯草溶菌素、阳性对照乳酸链球菌素或阴性对照乳酸链球菌素稀释剂。最后，通过添加2μl2mmol/L万古霉素(Sigma)消散任何剩余的ΔΨ。
ΔpH消散测定
根据Molenaar等人,"Continuous measurement of the cytoplasmic pH inLactococcus lactis with a fluorescent pH indicator,"Biochim.Biophvs.Acta1115:75-83(1991)的操作方案和Turovskiy等人描述的改进形式，分析枯草溶菌素影响阴道加德纳菌细胞跨膜pH梯度(ΔpH)的能力。
起初，将阴道加德纳菌细胞培育过夜至OD600为0.6，收获，随后洗涤2次并重悬于体积为其最初体积1/100的50mmol/L磷酸钾缓冲液(PPB，pH6.0)中。随后使细胞在环境温度下暴露于pH敏感探针BCECF-AM(MPBiomedicals,Inc.,Solon,OH)5分钟，以使探针扩散至细胞质中。在暴露后，将细胞用1mL50mmol/L PBS(pH6.0)洗涤两次并重悬于200μl的相同缓冲液中。为测量跨膜pH梯度的消散，用10μl细胞悬液处理含有2mL PPB(pH7.0)的石英小杯。使用PerkinElmer LS-50B荧光光谱仪，在激发用狭缝宽度为5nm和发射用狭缝宽度为15nm以及激发波长和发射波长分别为502nm和525nm的情况下，读取荧光。在信号稳定后，细胞用4μl2.2mmol/L葡萄糖再激发；荧光随后因胞内pH增加而上升。再次使信号平稳后，添加2μl5μmol/L万古霉素，以将PMF的ΔΨ组分转化成ΔpH。随后细胞用枯草溶菌素、阳性对照(乳酸链球菌素)或阴性对照(乳酸链球菌素稀释剂)处理。添加2μl2μmol/L尼日利亚菌素，以消散任何剩余的ΔpH。
枯草溶菌素造成ATP从阴道加德纳菌细胞流出
借助萤光素酶在胞外ATP和Mg2+存在下氧化发光性D-萤光素分子，以生物发光的函数评价枯草溶菌素对阴道加德纳菌细胞中胞内ATP水平的影响。在图24A和图24B中，填充柱代表总ATP含量(胞内+细胞外的)，而空白柱代表胞外ATP。枯草溶菌素(24A)造成ATP流出比乳酸链球菌素(24B)高约1.5倍，比阴性对照高2倍。相比之下，阳性对照(乳酸链球菌素)不造成ATP流出，但是触发该分子的内部水解，表现为总ATP样品中的发光下降(图24B)。乳酸链球菌素(24B)的总ATP水平比枯草溶菌素(24A)和两个阴性对照(24A，24B)低20%，表明ATP胞内水解。不能测定暴露于枯草溶菌素和对照在单个5分钟时间点过后的影响，因为严格厌氧性阴道加德纳菌细胞对延长的有氧条件的耐受差(数据未显示)。
枯草溶菌素不影响阴道加德纳菌跨膜电势(ΔΨ)
使用荧光探针碘化-3,3ˊ-二丙基硫杂二羰花青[DiSC3]，观察到枯草溶菌素消散阴道加德纳菌细胞中的跨膜电势(ΔΨ)的能力。将离子载体尼日利亚菌素(K+/H+交换剂)添加至生长培养基中的阴道加德纳菌细胞，以将ΔpH转化成ΔΨ。添加乳酸链球菌素造成探针的荧光信号瞬时增加，原因在于细胞膜因细菌素而去极化(图25B)。离子载体万古霉素的后续导入几乎不产生影响，这表明乳酸链球菌素造成这种PMF组分完全崩解。然而，添加枯草溶菌素或阴性对照(乳酸链球菌素稀释剂和ddH2O)不造成探针的荧光升高，这表明它们不影响ΔΨ(图25A、B)。对于乳酸链球菌素稀释剂和枯草溶菌素两者，万古霉素的后续添加完全耗尽了ΔΨ，导致与添加乳酸链球菌素后所见情况相比荧光增加(图25A、B)。不同于造成ΔΨ完全消散的阳性对照乳酸链球菌素，枯草溶菌素不通过耗尽PMF这种组分造成阴道加德纳菌细胞损伤。
枯草溶菌素造成跨膜pH梯度(ΔpH)立即耗尽。
在开始荧光读数时，用2.2mM葡萄糖激发细胞。使用2μmol/L万古霉素(Val)将PMF的ΔΨ转化成ΔpH。添加枯草溶菌素造成pH依赖性荧光探针BCECF-AM的信号强度迅速降低，这表明阴道加德纳菌细胞中pH的立即胞内下降(图26A)。乳酸链球菌素还造成荧光信号下降，虽然以较慢、更平缓的速率(图26B)。由于将测定缓冲液设计成具有低于阴道加德纳菌细胞胞内pH的pH(39)，胞内pH下降归因于ΔpH的耗尽。为耗尽任何剩余ΔpH而添加尼日利亚菌素并不造成任一种样品的荧光进一步降低，这表明乳酸链球菌素和枯草溶菌素均通过形成跨膜孔造成ΔpH完全耗尽(图26A、B)。
结果显示，枯草溶菌素通过完全耗尽跨膜pH梯度(ΔpH)和造成胞内ATP立即流出而发挥作用，但是对跨膜电势ΔΨ没有影响。目前的结果有力地表明，由枯草溶菌素带来的PMF的改变原因在于阴道加德纳菌的胞质膜中瞬时孔的形成。
杀精活性的分析
枯草溶菌素的产生
按照Sutyak等人,"Isolation of the Bacillus subtilis antimicrobial peptidefrom the dairy product-derived Bacillus amyloliquefaciens,"Journal of AppliedMicrobiology104(4):1067-74(2008)先前所述，制备枯草溶菌素。为制备无细胞上清液(CFS)，通过在4500g、4°C离心(Hermle Z400K；LabNet，Woodbridge，NJ，USA)25分钟除去细胞。使用0.45/2m滤器(Fisher,Pittsburgh,Pa,USA)，将上清液过滤除菌。通过添加30%硫酸铵(w/v)同时在4°C搅拌过夜使目的蛋白从上清液沉淀出来，并将其重悬于20mL双蒸H2O中。使用Sutyak等人描述的柱层析方法从CFS纯化枯草溶菌素，产生在90%甲醇洗脱物中近乎纯的分离物。根据Cintas,L.M.等人,"Isolation and characterization of pediocinL50,a new bacteriocin from Pediococcus acidilactici with a broad inhibitoryspectrum,"Applied and Environmental Microbiology61(7):2643-48(1995)的操作方案和Sutyak等人所讨论的额外修改，通过孔扩散测定验证全部样品的抗微生物活性。使用Savant SCI10Speed Vac和U VS400通用真空系统(SavantInstruments,Farmingdale,NY,USA)将活性部分浓缩至干燥，随后使其重悬于1.5mL ddH2O中。
蛋白质浓度的测定
根据制造商的操作方案，使用Micro BCA蛋白质分析试剂盒(Pierce,Rockford,111,USA)测定枯草溶菌素在柱级分中的浓度。简言之，该测定通过用二辛可宁酸比色检测Cu1+而测量Cu2+至Cu1+的还原。使用牛血清白蛋白(BSA)形成具有0.5-20μg/mL浓度范围的标准曲线；使用来自标准曲线图的趋势线的R值计算枯草溶菌素浓度。
由于溶剂(MRS培养基)中高水平的背景蛋白质，CFS中枯草溶菌素的浓度不可用Micro BCA蛋白质测定法测定。或者，通过比较已知浓度的柱纯化蛋白与相等体积的CFS的抗微生物活性，计算蛋白质浓度。利用CFS和柱纯化级分的储备样品制备5份两倍稀释物。使用50μl每种稀释物进行针对藤黄微球菌ATCC10420的孔扩散测定，所述藤黄微球菌ATCC10420常用作测定细菌素生物活性的参比微生物。
测定弱有机酸的存在
如先前报道，测量CFS中乳酸的浓度，以评估其对抗微生物活性和细胞存活力的潜在影响。Sutyak等人,"Isolation of the Bacillus subtilis antimicrobialpeptide from the dairy product-derived Bacillus amyloliquefaciens,"Journal ofApplied Microbiology104(4):1067-74(2008)。使用市售的D-乳酸/L-乳酸试剂盒(Roche Boehringer，Mannheim，德国)，根据制造商的说明书，测量样品中每种形式的酸的量。
鞘外宫颈组织模型(EpiVaginal ectocervical tissue model)
完全如Dover等人,"Safety study of an antimicrobial peptide lactocin160,produced by the vaginal Lactobacillus rhamnosus,"Infectious Diseases inObstetrics and Gynecology,第6页,论文ID78248(2007)所述，使用并维持EpiVaginal(VEC-100)外宫颈组织模型(MatTek Corporation,Ashland,Mass,USA)。使组织暴露于83μl枯草溶菌素CFS(约136μg/mL)4、24和48小时。对于暴露时间超过24小时的，通过将组织安置在两个金属洗涤器(MatTekCorporation,Ashland,Mass,USA)上并提供5ml分析媒介，使组织曝气。将双蒸水(ddH2O)用作阴性对照，并在6、24、和48小时后施加至细胞。基于其记录的细胞毒特性，使用含有4%壬苯醇醚-9杀精产品(Ortho OptionsCONCEPTROL阴道避孕凝胶，高级护理产品,Skillman,N J,USA)作为阳性对照。使用含有4%无毒BV活性化合物硝酸咪康唑的霜剂(Monistat-3，OrthoMcNeil Pharmaceutical,Inc.,Raritan,N J,USA)作为阴性对照。
在指定的暴露时间后，使用MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四氮唑鎓)测定法测定细胞总存活力。这些数据用来接近于将细胞存活力降低至50%的有效时间(ET)(ET-50)。
MTT存活力测定
根据Dover等人概述的操作方案，实施MTT测定法。简而言之，将外宫颈细胞在暴露于枯草溶菌素后的存活力计算为黄色化合物四氮唑分解成紫色甲臜的正比例，原因是仅活细胞可以引起这种反应发生。使组织暴露于枯草溶菌素和两种对照几个规定的时间点；当每种暴露结束时，将平板孔中的液体与来自组织插入物的液体合并。随后使用96孔读数仪(MRX revelation,Dynex Technologies,Va,USA)通过分光光度分析这种混合物以确定四氮唑降解水平。
根据制造商提供的方程：%存活力=OD570(处理的组织/OD570(阴性对照组织)，计算处理的组织插入物的存活力(%)。根据Ayehunie等人,"Organotypichuman vaginal-ectocervical tissue model for irritation studies of spermicides,microbicides,and feminine-care products,"Toxicology in Vitro20(5):689-98(2006)描述的[V=a+bxlog(t)]，其中V=%存活力，t=以分钟为单位的时间，并且“a”和“b”是代表来自50%存活力之前和之后的时间点的存活力数据的常数，计算出减低组织存活力50%的暴露时间(ET-50)。总体上，在ET-50的长度和所测试应用的毒性之间存在直接关系(即，较短的ET-50对应于更有害的化合物)。
精液样品采集和分析
使用从解淀粉芽孢杆菌培养物收集的CFS测试枯草溶菌素暴露对人精子运动性的影响。首先，用生理盐水(0.9%)稀释CFS，从而使200μL最终物质等同于50μL、100μL或200μL未稀释的CFS。
在实验日采集两份精液样品。在转移至实验室之前，通过自慰在聚丙烯标本容器(Fisher)中收集每份样品。在采集1小时内，汇集样品。在生理盐水中稀释(1:50)精液后，使用明视野光学显微镜(Olympus BX50；400x)，计算总精子计数。用牛鲍氏血细胞计数板检验之前计算活动精子初始百分比。使用随机选择的视域(400x)通过104-201个细胞的计数确定活动精子百分数。将任何目视运动的精子(定向或固定)计数为活动细胞。
基于正常样品中的70%精子为如此行为方式的假设，主观确定前进运动精子的百分比。这个实验中使用的样品落入“正常”类别。
用枯草溶菌素处理精子
使用改良的Sander-Cramer试验测定柱纯化的枯草溶菌素对人精子运动性的影响。这测量了各稀释度的(用生理盐水稀释的25%和50%以及100%)5体积溶液(200μL)与1体积完整精液(40μL)在30秒的暴露时间后，枯草溶菌素产生的影响。
如上文所述，一式两份地测定来自样品的随机高放大率视野(400x)中的细胞的运动性。
数据分析
在进一步实验之前，将%运动性数据反正弦变换。使用StatMost32(4.1版)统计软件(DataMost Corporation,Sandy,Utah,USA)计算全部统计参数。运动性%值以平均数和90%置信限表示。通过Newman-Keuls多重范围检验，评估处理组之间的任何差。认定0.05的置信水平下的差异是显著的。
蛋白质浓度的确定
枯草溶菌素在柱纯化的样品中的浓度估计在135.7μg/mL。CFS和柱纯化的样品在每个稀释度上产生相同的抑菌圈(数据未显示)；因此，假定两个溶液中的蛋白质浓度相等。尽管不可能由柱层析实现100%的产率，但是先前工作已经显示，可以基于我们实施的比较精确地计算蛋白质浓度。由于通过其他测定法测量CFS蛋白浓度中的难度，认定所选择的方法是最精确和可重复的。
细胞存活力%和ET-50值
在暴露于枯草溶菌素48小时后，与阳性对照壬苯醇醚-9和阴性对照硝酸咪康唑相比，鞘外宫颈(epivaginal ectocervical)组织保留高水平的存活力(图27)。鉴于缺少抗微生物剂的毒性，不能确定枯草溶菌素的ET-50值，原因是总细胞存活力在任何给定时间点均不下降低于50%。然而，通过数据外推可能预测ET-50值。在表1中显示的数据可以拟合于Ln(V)=a+bt2描述的曲线，其中a=4.605995356，b=-0.00014151(决定系数，或r2，=0.9998)，从中估计ET-50是处在70小时。
活动精子的定量观察结果
枯草溶菌素以剂量依赖性方式降低人精子运动性(图16)。在如所示与不同终浓度的枯草溶菌素A混合后30秒，确定汇集的完整精液中活动精子的百分比。相对70%的正常对照运动性调整全部数据，并在进一步分析之前进行反正弦变换。值表示为平均%运动性。误差线是90%置信限。在4倍的枯草溶菌素浓度范围内，经处理的精子的运动性是对照运动性水平的0至88%。与对照样品相比，测试的全部枯草溶菌素浓度均降低运动性。根据Newman-Keuls多重范围检验，发现全部样品中(28.3、56.7和113.3μg/mL蛋白质当量)活动精子的比例的差异均是显著的(P<.05)。使用TableCurve2D(5.0版)曲线拟合软件(SPSS Scientific Software,Chicago,II1,USA)用来将数据拟合于Ln.(%运动性)=a+b[枯草溶菌素A]3所描述的剂量-反应曲线；其中a=4.20781，b=-2.5814e-06并且[枯草溶菌素A]表述为μg/mL蛋白质当量。该曲线的决定系数(r2)=0.9959。计算出IC50值或将完整精液中的精子运动性降低50%所需的枯草溶菌素的量是64.5μg/mL。
精子的半定量观察结果：前向运动
与运动性相似，枯草溶菌素以剂量依赖性方式降低精子的前向运动。在对照样品中，70%精子显示前向运动；在50μL枯草溶菌素存在下，降至50-70%，而100μL造成降低至仅10%前向运动。用200μL枯草溶菌素处理后，消除全部前向运动，大部分精子尾变得卷曲。
对于测试的全部浓度，发现枯草溶菌素均以浓度依赖性方式显著减少人精子的运动性。还观察到枯草溶菌素对精子前向运动的影响是一种剂量依赖性相互作用。连续稀释物显示前向运动稳定下降，全部前向运动在测试的最高浓度均停止。还发现在最高浓度，精子细胞的尾部弯曲或卷曲，这表明细胞受损超出单纯的运动受限。认为细胞卷曲是一种精子畸形，并且可能表示质膜损伤。在猴精子体外暴露于甲基汞后，观察到尾部卷曲。
枯草溶菌素与其他天然抗微生物剂的组合
细菌菌株和生长条件
在37°C无振荡下在BHI培养液(Difco,Sparks,MD)+3%马血清(JRHBiosciences,Lenexa,KS)中无氧培育阴道加德纳菌ATCC14018培养物。在37°C无振荡下在MRS培养液(Difco)中过夜培育解淀粉芽孢杆菌培养物。两种生物的初始培养物在使用之前继代培养多次。对于全部实验，将阴道加德纳菌培育过夜以接近于细胞浓度108CFU/mL，随后在生长培养基中稀释100倍至工作浓度106CFU/mL。将两种生物的储备培养物保持在-80°C、补充有15%v/v甘油的适宜生长培养基中。
抗微生物溶液的制备
如上文所述制备枯草溶菌素的部分纯化的制备物。无菌
Figure BDA00003511572900331
(甘油单月桂酸酯)获赠自伊利诺伊州芝加哥市拉什医学中心的Alla Aroutcheva博士。在预温至37°C的BHI+3%马血清培养液中制备2mg/mL甘油单月桂酸酯储备液。MIRENAT-CF获赠自Vedeqsa Corp.(Barcelona，Spain)，并含有1mg/mL月桂藻酸盐(Nα-月桂酰-L-精氨酸乙酯单盐酸盐，LAE)。含有25%ε-聚-L-赖氨酸(250mg/mL)的储备液获赠自Chisso America,Inc.(批号2090501；Rye,NY)。乳酸锌固态储备液(Puramex Zn)获赠自Purac America,Inc.(批号#0807000376；Lincolnshire，IL)。使用ddH2O产生5.45mg/mL乳酸锌储备液。在使用之前使用0.45μm滤器(Nalgene，Rochester，NY)，将全部抗微生物溶液过滤除菌。
最低抑菌浓度(MIC)的测定
根据Amrouche,T.、Sutyak等人,"Antibacterial activity of subtilosin aloneand combined with curcumin,poly-lysine,and zinc lactate against Listeriamonocytogenes strains,"Probiotics Antimicrob Prot.doi10.1007/s12602-010-9042-7(2010)，在略作修改情况下，使用培养液微量稀释法测定每种抗微生物剂单独抑制阴道加德纳菌生长的能力。利用储备液，在恰当稀释剂中产生每种抗微生物剂的10倍连续稀释物(枯草溶菌素：230-0.023μg/mL；甘油单月桂酸酯：200-0.02μg/mL；月桂酰精氨酸酯：10,000-10μg/mL；聚赖氨酸：25,000-25μg/mL；乳酸锌：5450-0.545μg/mL)。如先前所述，过夜培育并制备阴道加德纳菌细胞。通过在水平行中添加抗微生物剂的连续稀释物，从测试的最高浓度递降至最低浓度，准备无菌96孔微量平板(Corning，Inc.，Corning，NY)。抗微生物剂以20μL增量测试(0-100μL)，其中每个体积一式两份测试。通过添加无菌ddH2O，将每个孔的体积增加至总计100μL，并且通过柔和吹吸混合每个孔的内容物。将100μL阴道加德纳菌细胞添加至每个孔；将仅含有细胞、仅含有抗微生物剂、仅含有水和仅含有生长培养基的孔用作对照。将50μL无菌矿物油吸放到到每个孔的顶部上以形成气密密封，所述气密密封将允许阴道加德纳菌细胞厌氧生长。随后将每个平板转移至Coy C型厌氧室(Coy Laboratory Products,Inc.,Grass Lake,MI)中并置于Bio-Rad550型微量平板读数仪(Bio-Rad Life Sciences，Hercules，CA)内。在48小时内，在37°C每隔30分钟记录每个孔在595nm的浊度。为了防止矿物油封与每孔的内容物混合，在每次测量前均不摇动平板。使用Microplate Manager(5.1.2版)软件(Bio-Rad)采集并分析数据。将不显示光密度增加(无细菌生长)的每种抗微生物剂的最低浓度认定为MIC。每个测定法一式两份进行至少2次。
棋盘测定法
通过能够同时测试各种浓度的多种抗微生物剂的“棋盘”测定法测试枯草溶菌素和所选择的抗微生物剂之间的相互作用。根据Badaoui Najjar等人,"Epsilon-poly-L-lysine and nisin A act synergistically against Gram-positivefood-borne pathogens Bacillus cereus and Listeria monocytogenes,"Lett.Appl.Microbiol.45:13-18(2007)，通过如下修改进行测定法。在每个实验中，准备无菌96孔微量平板(Corning)，从而枯草溶菌素(水平行)与所选择的抗微生物剂之一(垂直列)组合。使用浓度比其相应MIC高10倍的储备液，将每种化合物等分至适宜的行或列中。将每块平板设计成直接测试高于、等于并且尤其低于每种抗微生物剂各自的MIC的浓度(图28)。使用无菌ddH2O，将每个孔的体积增加至100μL。
如先前所述，过夜培育并制备阴道加德纳菌；将100μL这种制备物添加至每个孔。微量平板的第一行和第一列充当对照(无抗微生物剂)，单独一行水或单独一行培养基也充当对照。将50μL无菌矿物油吸放到每个孔的顶部上以确保厌氧条件。使用与前文描述相同的设备和条件处理每块平板。每个MIC测定法测试每种化合物的宽范围的浓度，并且一式两份地进行至少2次。实施的全部测定均对全部物质产生相同结果(无标准偏差)。
数据图示
使用Microsoft Excel2007(Microsoft，Redmond，WA)分析来自全部测定的动力学生长曲线数据。针对每种协同测定产生等效线图，作为观察协同作用、加合效应或拮抗作用存在的方式。在等效线图中，x轴和y轴代表每种抗微生物剂的浓度；每种物质的MIC随后在该图上作图，并且两个点由线连接。完全抑制微生物生长的抗微生物剂的混合浓度随后在该图上作图。落在该线下侧的点表示协同作用，在该线上的点显示加合效应，并且该线上侧的点表示拮抗作用(Chou,T.-C.,"Theoretical basis,experimental design,andcomputerized simulation of synergism and antagonism in drug combinationstudies,"Pharmacol Rev.58:621-81(2006))。
MIC的测定
在补充有3%马血清的BHI培养液中，通过培养液微量稀释法测试枯草溶菌素、GML、LAE、聚赖氨酸和乳酸锌针对阴道加德纳菌的MIC。如图28所示，全部测试物质均能够完全抑制所选择的阴道病原体生长。枯草溶菌素证明相当有效，MIC仅为9.2μg/mL，而GML和聚赖氨酸的MIC分别为20μg/mL和25μg/mL。GML的MIC得到了Strandberg,K.L.,et al"Glycerolmonolaurate inhibits Candida and Gardnerella vaginalis in vitro and in vivo butnot Lactobacillus,"Antimicrob Agents Chemother.54:597-601(2010)的研究结果支持，他们证明GML针对阴道加德纳菌的临床分离株的MIC为10μg/mL。在1.0901mg/mL，乳酸锌的MIC比其他测试化合物高40倍。如先前陈述，全部MIC测定均一式两份地进行至少两次。尽管所测试浓度的范围广，但每种化合物的结果在测定之间没有偏差；因此，这些结果不存在记录的标准偏差(图28)。
测定抗微生物剂之间的协同作用
一旦计算出全部所选择化合物各自的MI C，使用与一种其他物质组合的枯草溶菌素进行棋盘测定法。将每种测定设计成测试宽范围的浓度，始于比每种化合物各自的MIC略高的浓度且以连续方式降低至零浓度(阴性对照)。用等效线图分析低于完全抑制微生物生长的各MIC水平的浓度的组合，以确定协同作用、加合效应或拮抗作用的存在。
枯草溶菌素和甘油单月桂酸酯(GML)之间的相互作用
由于已经证明了GML针对与BV相关的病原体阴道加德纳菌的抗微生物活性，因此它是与我们的靶肽(枯草溶菌素)一起测试协同作用的第一个物质。为观察两种化合物组合之间的协同作用，通过以下方式构建等效线图：将枯草溶菌素的各个MIC在x-轴上作图、将GML的各个MIC在y-轴上作图并连接两个点(图29)。根据棋盘测定法，造成阴道加德纳菌总体生长抑制的枯草溶菌素和GML的最低组合浓度分别是4.6μg/mL和2μg/mL(图30)。当联合使用时，枯草溶菌素的MIC下降2倍，GML的MIC下降4倍。将代表这两个浓度的点添加至所述等效线图并且完全落在趋势线下侧，从而显示协同作用。尽管2.3μg/mL枯草溶菌素和10μg/mLGML的浓度组合还造成完全抑制阴道加德纳菌生长，但是相应曲线点更靠近趋势线，从而显示较弱的协同作用(图29)。
枯草溶菌素和月桂酰精氨酸酯(LAE)之间的相互作用
第二种天然抗微生物月桂酰精氨酸酯先前已经显示了与鼠李糖乳杆菌产生的细菌素乳酸菌素160协同对抗阴道加德纳菌(Y.Turovskiy，个人通信)。如对GML描述那样，评估其与枯草溶菌素的潜在协同作用，并使用枯草溶菌素和LAE的各自MIC构建等效线图(图31)。棋盘测定显示了完全抑制阴道加德纳菌生长的枯草溶菌素和LAE的最低浓度组合分别是4.6μg/mL和25μg/mL(图30)。这种组合造成枯草溶菌素的自身MIC下降2倍，LAE的自身MIC下降4倍。在等效线图上作图时，代表这两个浓度的点也落在趋势线下侧，从而显示两种化合物之间的协同作用(图31)。
枯草溶菌素和ε-聚-L-赖氨酸之间的相互作用
使用枯草溶菌素和聚赖氨酸各自的MIC构建等效线图(图32))。棋盘测定展示出完全抑制阴道加德纳菌生长的枯草溶菌素和聚赖氨酸的最低浓度组合分别为4.6μg/mL和2.5μg/mL(图30)。这种组合造成枯草溶菌素的自身MIC下降2倍，聚赖氨酸的自身MIC显著下降10倍。在等效线图上作图时，代表这两个浓度的点也落在趋势线下侧，从而显示两种化合物之间的协同作用(图32)。
枯草溶菌素和乳酸锌之间的相互作用
使用枯草溶菌素和乳酸锌各自的MIC构建等效线图(图33)。棋盘测定显示完全抑制阴道加德纳菌生长的枯草溶菌素和乳酸锌的最低浓度的组合分别为2.3μg/mL和272.5μg/mL(图30)。这种组合造成枯草溶菌素的自身MIC下降4倍，乳酸锌的自身MIC下降5倍。在等效线图上作图时，代表这两个浓度的点也落在落在趋势线下侧，从而显示两种化合物之间的协同作用(图33)。尽管其他两个浓度组合(2.3μg/mL枯草溶菌素和545μg/mL聚赖氨酸；4.6μg/mL枯草溶菌素和272.5μg/mL乳酸锌)也造成完全抑制阴道加德纳菌生长，但是相应曲线点更靠近趋势线，从而显示较弱的协同作用(图33)。
讨论
研究了枯草溶菌素和4天然抗微生物剂在单独和组合下针对与BV相关的病原体阴道加德纳菌的抗微生物活性。棋盘测定法用来研究多个浓度的枯草溶菌素和另一种抗微生物化合物是否存在针对靶微生物的协同作用、加合效应用或拮抗作用。单独的枯草溶菌素在9.2μg/mL具有针对阴道加德纳菌的最低MIC，不过GML、LAE和聚赖氨酸也具有μg/mL范围的MIC。就自身而言，显示乳酸锌对抗阴道加德纳菌的效果较低，MIC略高于1mg/mL(图28)。然而，当4种化合物的每一种在与枯草溶菌素组合的情况下测试时，它们的MIC大幅度下降。GML和LAE的MIC均下降4倍，而枯草溶菌素的MIC下降一半。聚赖氨酸的MIC降低10倍，是最明显的变化，而乳酸锌的相对高的自身MIC下降5倍(图30)。如每个等效线图中所见(图29和图31-33)，代表枯草溶菌素和第二抗微生物剂的组合MIC的点均完全落在趋势线下侧，其中所述趋势线连接表示每种化合物各自MIC的点。由此，显而易见的是枯草溶菌素与全部测试的抗微生物剂协同。

Claims (17)

1.基于聚乙二醇的多功能水凝胶，其包含与至少4个多臂聚乙二醇纳米载体单位共价结合的多臂聚乙二醇交联单位，其中每个纳米载体单位均包含与所述纳米载体单位偶联的试剂，并且每种试剂均选自pH降低剂、生物粘合剂、杀微生物-杀精剂和抑制游离的和与细胞结合的HIV结合的试剂，前提是每个纳米载体单位均包含不同的试剂。
2.根据权利要求1所述的水凝胶，其中至少两个纳米载体单位包含具有不同功能的试剂。
3.根据权利要求1所述的水凝胶，其中至少一种试剂通过可降解键与纳米载体单位偶联。
4.根据权利要求1所述的水凝胶，其中至少一种试剂通过不可降解键与纳米载体偶联。
5.根据权利要求1所述的水凝胶，包含选自乳酸、柠檬酸、抗坏血酸和马来酸的pH降低剂。
6.根据权利要求1所述的水凝胶，包含在载体中封装的pH降低剂。
7.根据权利要求7所述的水凝胶，其中所述载体是环糊精、树模石、树状聚物、脂质体或PEG纳米凝胶粒子。
8.根据权利要求1所述的水凝胶，其包含枯草溶菌素。
9.根据权利要求1所述的水凝胶，其包含选自可溶性聚阴离子和RGD肽配体的抑制游离的和与细胞结合的HIV结合的试剂。
10.根据权利要求9所述的水凝胶，其中所述可溶性聚阴离子选自硫酸葡聚糖、硫酸环糊精和肝素。
11.根据权利要求1所述的水凝胶，其还包含在水凝胶内部非共价结合的至少一个纳米载体单位。
12.用于制备根据权利要求1所述的水凝胶的方法，其包括将某个量的多臂聚乙二醇交联单位与某个量的多臂聚乙二醇纳米载体单位合并，其中，所述多臂聚乙二醇交联单位包含与每条臂偶联的巯基反应性官能团，每个纳米载体单位均包含与一半所述臂偶联的巯基和与每个纳米载体单位的剩余臂偶联的试剂，并且每种试剂均选自pH降低剂、生物粘合剂、杀微生物-杀精剂和抑制游离的和与细胞结合的HIV结合的试剂，其中所述交联单位和所述纳米载体单位的量足以在合并时产生水凝胶。
13.根据权利要求12所述的方法，其中与相同聚合物单位组合的每个纳米载体单位均包含不同的试剂。
14.用于制备基于聚环氧烷的多功能水凝胶的试剂盒，所述试剂盒包含：
(a)某个量的多臂聚乙二醇交联单位，所述多臂聚乙二醇交联单位包含与每条臂偶联的巯基反应性官能团；和
(b)某个量的多臂聚乙二醇纳米载体单位，其中每个纳米载体单位均包含与一半所述臂偶联的巯基和与每个纳米载体单位的剩余臂偶联的试剂，并且每种试剂均选自pH降低剂、生物粘合剂、杀微生物-杀精剂和抑制游离的和与细胞结合的HIV结合的试剂；
其中所述交联单位和所述纳米载体单位的量足以在合并时产生水凝胶。
15.用于预防性降低患者HIV发展风险的方法，所述方法包括向患者阴道内或直肠内施用：
(a)某个量的多臂聚乙二醇交联单位，所述多臂聚乙二醇交联单位包含与每条臂偶联的巯基反应性官能团；和
(b)某个量的多臂聚乙二醇纳米载体单位，其中每个纳米载体单位均包含与一半所述臂偶联的巯基和与每个纳米载体单位的剩余臂偶联的试剂，并且每种试剂均选自pH降低剂、生物粘合剂、杀微生物-杀精剂和抑制游离的和与细胞结合的HIV结合的试剂；
其中所述交联单位和所述纳米载体单位的量足以在合并时产生水凝胶。
16.制品，包含根据权利要求1所述的水凝胶。
17.局部用组合物，其包含抗微生物有效量和/或杀精有效量的枯草溶菌素，所述枯草溶菌素掺入到可药用水溶液、非水溶液、纳米纤维、水凝胶、凝胶、纳米凝胶、悬剂、膏剂、胶剂、插入物、栓剂、海绵、油膏剂、霜剂、泡沫剂、起泡片剂或灌洗剂中。
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