CN113332491A - 一种诱导no释放的抗凝血水凝胶材料及其制法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种诱导NO释放的抗凝血水凝胶材料及其制法与应用，该诱导NO释放的抗凝血水凝胶材料是将肝素接枝在六臂聚乙二醇的末端，获得抗凝血的水凝胶材料，然后进一步在肝素分子上接枝硒代胱胺，从而获得诱导NO释放的抗凝血水凝胶材料。采用本发明的方法制备的诱导NO释放的抗凝血水凝胶材料具有优异的吸水性能，引入的肝素分子使水凝胶材料具有良好的抗凝血性能，而接枝的硒代胱胺可以催化血液中内源性NO供体释放NO分子，从而起到促进血管内皮修复的作用。

Description

一种诱导NO释放的抗凝血水凝胶材料及其制法与应用
技术领域
本发明涉及一种诱导NO释放的抗凝血水凝胶材料及其制法与应用，属于生物医用高分子材料领域。
背景技术
心脑血管疾病仍然是全球主要的死亡原因，对完全闭塞的血管病变来说，采用自体动脉或静脉移植物来进行搭桥手术，或者完全替换闭塞的血管以恢复血流供应，是临床常用的治疗方法，但是由于自体血管来源有限并且会造成新的创伤，其临床应用受到很大限制，因此，采用人造血管移植物替代闭塞血管一直是心血管疾病治疗的研究热点和难点。目前应用的合成血管移植物(如膨胀聚四氟乙烯、涤纶等)在较大直径(>6mm)的血管中表现出令人满意的长期性能，但在小直径血管(<6mm)的应用中表现较差，主要原因是这些材料应用于小直径血管时，容易在术后形成急性血栓而导致血管迅速闭塞，同时，血管移植物管腔和吻合口的大量内膜增生也是导致血管闭塞发生的重要原因，而这与材料的抗凝血性能较差以及无法迅速促进血管内皮化具有十分密切的关系。
另一方面，在心血管疾病的临床治疗中，介入治疗已成为重要方式。目前，金属植入/介入器械(如血管支架)被临床普遍使用，但是其生物相容性尚未达到理想要求，比如，支架植入后发生的晚期血栓和再狭窄等严重影响其临床治疗效果。尽管以高分子材料为载体的药物洗脱支架在治疗狭窄性心血管疾病方面发挥了积极的作用，但其效果依然不佳，主要原因在于药物载体释放的抗增生药物在抑制新生内膜增生的同时也抑制了血管内皮细胞的生长，载体材料本身并不具备抗凝血促内皮修复的作用，容易造成晚期血栓等临床并发症，因此，在血管支架表面构建具有调控血液、血管细胞行为的生物功能层是目前改善材料生物相容性和临床性能的有效手段。
六臂聚乙二醇是一种人工合成的具有良好生物相容性的高分子聚合物，广泛应用于生物材料与组织工程领域，在人工血管以及血管支架表面涂层方面具有潜在的应用，但是其抗凝血性能有待提高，并且由于聚乙二醇优异的抗生物污染能力以及阻止蛋白吸附能力，因此其促进血管内皮修复的能力有限。通过与其它物质进行共聚合(如与己内酯的共聚合)或者引入其它生物活性物质(如，末端接枝细胞外基质蛋白)是提高六臂聚乙二醇促细胞生长的常用方法，然而这些方法虽然在一定程度上改善了材料的内皮化能力，但抗凝血性能以及促内皮修复的能力仍然未能得到根本解决。肝素是一种具有优异抗凝血性能的多糖材料，具有广泛的生理作用，研究表明，肝素不仅具有优异的抗凝血性能，而且在一定的浓度范围内具有促进内皮细胞生长的作用，在现有技术中，还未见将优异抗凝血性能的肝素分子与六臂聚乙二醇连用的相关报道。
研究表明，由血管内皮细胞释放的NO分子在维持人体血液平衡方面具有重要的作用，并且NO分子还具有抗炎、抗凝血、促内皮修复以及抑制平滑肌细胞生长的作用，因此，在血管内植入材料方面具有重要的应用价值，但在病理环境中，内皮功能受损，NO释放受阻，导致损伤修复无法正常进行。人体血液中含有大量的内源性NO供体，因此，制备催化释放NO的材料来催化分解内源性NO供体释放NO分子，可以赋予材料优异的抗凝血性能和促内皮修复性能。为了赋予材料具有NO释放的能力，现有技术通常通过两个方面来解决，一方面是在材料表面固定可以释放NO的物质，但这种方法NO的释放量有限，长期效果不佳；另一方面，人体血液中含有大量可以释放NO的内源性NO释放分子，因此，在材料表面或者内部结构中引入可以催化诱导内源性NO释放物质释放NO(如Cu2+，Zn2+，没食子酸等)是另外一种方法。硒代胱胺是一种富含氨基的小分子物质，其分子结构中特有的双硒键结构能有效催化血浆中的NO供体释放NO，从而改善血管内环境，调节损伤修复。在现有技术和报道中，尽管有联合应用肝素和硒代胱胺促进血管内皮修复的报道，但大多是用于材料表面接枝改性，将硒代胱胺引入到肝素改性的六臂聚乙二醇材料中，从而制备具有促内皮修复能力的水凝胶材料，还未见相关报道。
发明内容
发明目的：本发明的第一目的是提供一种诱导NO释放的抗凝血水凝胶材料，本发明的第二目的是提供一种该诱导NO释放的抗凝血水凝胶材料的制备方法，本发明的第三目的是提供该诱导NO释放的抗凝血水凝胶材料在制备催化诱导NO释放的抗凝血组织工程人工血管中的应用以及在制备修复血管内皮医疗器械方面的应用。
技术方案：本发明所述的一种诱导NO释放的抗凝血水凝胶材料，其特征在于，所述的诱导NO释放的抗凝血水凝胶材料的结构式为：
Figure BDA0003060416890000021
其中，
Figure BDA0003060416890000031
为肝素链段，其肝素链段基本结构如下：
Figure BDA0003060416890000032
本发明所述的诱导NO释放的抗凝血水凝胶材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备抗凝血的水凝胶材料：在四氢呋喃溶液中加入六臂聚乙二醇，搅拌溶解，加入肝素，继续搅拌溶解，加入4-二甲氨基吡啶与碳二亚胺，在冰浴中充分搅拌，常温搅拌反应，加入冰乙醇生成沉淀，抽滤，真空干燥，得到抗凝血的水凝胶材料，即肝素接枝的六臂聚乙二醇水凝胶材料；
(2)制备诱导NO释放的抗凝血水凝胶材料：在四氢呋喃溶液中加入肝素接枝的六臂聚乙二醇水凝胶材料，搅拌溶解，加入硒代胱胺，搅拌反应，加入碳二亚胺水溶液和N-羟基琥珀酰亚胺水溶液，继续搅拌反应，蒸发水分，加入冰乙醇生成沉淀，抽滤，真空干燥，得到诱导NO释放的抗凝血水凝胶材料。
进一步地，步骤(1)中，所述六臂聚乙二醇的分子量为2000-20000。
进一步地，步骤(1)中，所述碳二亚胺为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺中的一种。
进一步地，步骤(1)中，所述肝素与六臂聚乙二醇的质量比为1:5-1:20，所述4-二甲氨基吡啶与碳二亚胺的质量比为1:5-1:10；所述肝素和六臂聚乙二醇与四氢呋喃溶液的固液比分别为0.01-1g:mL。
进一步地，步骤(1)中，所述常温搅拌反应时间为12-24h。
进一步地，步骤(2)中，所述碳二亚胺水溶液和N-羟基琥珀酰亚胺水溶液的浓度分别为2-10mM，所述加入碳二亚胺水溶液和N-羟基琥珀酰亚胺水溶液体积比为1:1-4:1。
进一步地，步骤(2)中，所述肝素接枝的六臂聚乙二醇水凝胶与硒代胱胺的质量比为1:1-5:1，所述肝素接枝的六臂聚乙二醇水凝胶材料与四氢呋喃溶液的固液比为0.1-1g:mL，硒代胱胺与四氢呋喃溶液的固液比为0.1-0.5g:mL，所述继续搅拌反应时间为6-24h。
本发明所述的诱导NO释放的抗凝血水凝胶材料在制备催化诱导NO释放的抗凝血组织工程人工血管中的应用。
本发明所述的诱导NO释放的抗凝血水凝胶材料在制备修复血管内皮医疗器械方面的应用。
本发明所述的诱导NO释放的抗凝血水凝胶材料的反应步骤如下：
Figure BDA0003060416890000041
其中，
Figure BDA0003060416890000042
为
Figure BDA0003060416890000043
Figure BDA0003060416890000044
为肝素链段。
在上述反应中，肝素分子中的羧基与聚乙二醇末端的羟基反应，从而接枝肝素分子。由于碳二亚胺的化学偶联作用，可以通过肝素分子的羟基与硒代胱胺的羧基反应将硒代胱胺接枝在肝素分子上，也可以通过肝素分子的羧基与硒代胱胺的氨基反应，从而将硒代胱胺引入到水凝胶材料中。
有益效果：本发明和现有技术相比，具有如下显著性特点：
(1)采用的六臂聚乙二醇具有优异的抗生物污染性能和亲水性能，可以吸附大量水分，从而可以将材料制备成水凝胶材料；肝素分子具有良好的抗凝血性能，而硒代胱胺具有催化内源性NO供体释放NO分子的能力，因此，本发明制备的抗凝血水凝胶具有多种生理功能，可以在人工血管移植物或者诸如血管支架等医疗器械的表面涂层中获得应用。
(2)本发明技术采用的合成条件温和，不需要特殊的条件和设备，因此，工艺成本较低，可控制性强，效果显著。
(3)本发明制备的诱导NO释放的抗凝血水凝胶胶材料应用广泛，具有优异的凝血性能和催化诱导体内NO供体释放NO的功能，不仅可以用于小直径血管移植物的制备，也可以应用于血管内植入器械(如人工血管、血管支架)的表面涂层制备，用于提高器械的抗凝血性能和促内皮修复性能。
附图说明
图1为诱导NO释放的抗凝血水凝胶胶材料的红外光谱图；
图2为诱导NO释放的抗凝血水凝胶胶材料表面血小板粘附性能图；
图3为诱导NO释放的抗凝血水凝胶胶材料表面内皮细胞粘附性能。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1制备诱导NO释放的抗凝血水凝胶材料
(1)在六臂聚乙二醇的末端接枝肝素分子，获得抗凝血的水凝胶材料：在100mL单口瓶中，加入50mL四氢呋喃溶液，再加入10g的六臂聚乙二醇，充分溶解1h。加入1g肝素继续搅拌10min，再加入0.03g的4-二甲氨基吡啶(DMAP)与0.2g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，冰浴处理30min后在常温搅拌反应12h，旋转蒸发掉多余的水后加入50mL冰乙醇生产沉淀，抽滤，随后置于真空干燥箱干燥，得到肝素改性的六臂聚乙二醇水凝胶材料。
(2)在肝素分子上接枝硒代胱胺，获得诱导NO释放的抗凝血水凝胶材料胶材料：常温下在100mL的单口烧瓶中，加入50mL四氢呋喃溶液，再加入25g肝素改性的六臂聚乙二醇水凝胶材料，充分搅拌溶解后加入5g硒代胱胺，继续搅拌反应10min后加入10mM的EDC水溶液8mL和10mM的N-羟基琥珀酰亚胺水溶液2mL，继续搅拌反应12h，旋转蒸发掉多余的水后加入50mL冰乙醇生产沉淀，抽滤，随后置于真空干燥箱干燥，得到硒代胱胺改性的六臂聚乙二醇水凝胶材料，即诱导NO释放的抗凝血水凝胶材料。
实施例2
将实施例1获得的诱导NO释放的抗凝血水凝胶材料溶解在四氢呋喃溶液中，得到10mg/ml的溶液，采用溶剂挥发法制备成薄膜材料，然后将薄膜材料在常温下进行红外光谱测量，测量范围为4000-400cm－1，结果如图1所示，图1为抗凝血水凝胶胶材料的红外光谱图，由图1可以看出，波长3480cm－1处具有较宽的羟基吸收峰，波长2910cm－1和波长2880cm－1处出现明显的甲基和亚甲基吸收峰，波长1650cm－1和波长1475cm－1处的吸收峰为酰胺键的吸收峰或酯基的吸收峰，波长1100cm－1处出现了较强的C-O基团的吸收峰(主要为PEG结构中的C-O所产生)，这些结果证明成功合成了目标高分子材料。
实施例3
将实施例1获得的诱导NO释放的抗凝血水凝胶材料充分溶解在四氢呋喃溶液中形成20mg/mL的溶液，采用溶剂蒸发法获得水凝胶薄膜材料。分别在未加NO供体和添加20uL的NO供体(10μM的亚硝基谷胱甘肽和谷胱甘肽)的情况下，以聚苯乙烯为对照材料，进行体外血小板粘附实验，将新鲜人体全血(淮安市第二人民医院提供)以1500rpm离心15min获得富含血小板的血浆。将200μL富含血小板的血浆滴在每个样品表面以覆盖整个表面。在37℃孵育2h后，样品用0.1M的PBS缓冲液(pH＝7.4)冲洗。将粘附的血小板用2.5％戊二醛的PBS溶液固定24h，再用PBS缓冲液冲洗。然后依次用30％、50％、75％、90％、100％乙醇溶液依次脱水，每次10min，脱水后样品在空气气氛中充分干燥。样品表面喷金后用扫描电子显微镜(SEM，FEI Quanta250)观察血小板的粘附数量和形态，结果如图2所示。图2为诱导NO释放的抗凝血水凝胶胶材料表面血小板粘附性能图，其中a为聚苯乙烯对照样品，b未加NO供体的诱导NO释放的抗凝血水凝胶材料，c为添加NO供体的诱导NO释放的抗凝血水凝胶材料。由图2可以看出，使用聚苯乙烯对照样品，有大量的血小板粘附聚集在聚苯乙烯材料表面，说明聚苯乙烯的抗凝血性能很差。在未添加NO供体的情况下，粘附数量相对聚苯乙烯显著减少，是因为合成的诱导NO释放的抗凝血水凝胶材料含有肝素，能够显著抑制血小板的粘附和激活。但在添加NO供体的情况下，血小板粘附数量进一步减少，形态也更加完整，说明诱导NO释放的抗凝血水凝胶材料具有催化NO供体释放NO的作用，而NO也具有一定的抗凝血作用。
实施例4
将实施例1获得的诱导NO释放的抗凝血水凝胶材料充分溶解在四氢呋喃溶液中形成20mg/mL的溶液，采用溶剂蒸发法获得水凝胶薄膜材料。分别在未加NO供体和添加NO供体(10μM的亚硝基谷胱甘肽和谷胱甘肽)的情况下，以聚苯乙烯为对照材料，进行内皮细胞粘附实验。将样品放在24孔培养板中，在超净台上对样品使用紫外灯进行灭菌，然后在每个样品表面加0.5mL的内皮细胞(5×104个细胞/mL，ECV304，购自重庆比欧赛因生物科技发展有限公司)悬液和1.5mL细胞培养液。37℃，5％CO2环境下分别培养1、3天后，用0.1M的PBS缓冲液(pH＝7.4)洗涤样品3次。每个样品表面加入200μL的罗丹明的PBS溶液(罗丹明与PBS比例为1:400)染色20min，再用PBS缓冲液洗涤样品3次。最后加入200μL的4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(DAPI与PBS比例为1:400)到样品表面，染色3min，用PBS缓冲液洗涤样品3次。染色后的样品采用荧光显微镜(Zeiss，invertedA2)观察细胞的数量和形态，结果如图3所示。图3为抗凝血水凝胶胶材料表面内皮细胞粘附性能，其中a为聚苯乙烯对照样品，b未加NO供体的诱导NO释放的抗凝血水凝胶材料，c为添加NO供体的诱导NO释放的抗凝血水凝胶材料。由图3可以看出，聚苯乙烯对照样品表面细胞粘附数量很少，在未加NO供体的情况下，粘附数量相对聚苯乙烯显著增加，是由于合成的诱导NO释放的抗凝血水凝胶材料含有肝素，具有一定的促进内皮细胞粘附生长的作用。在添加NO供体的情况下，内皮细胞粘附数量再次增加，说明合成的诱导NO释放的抗凝血水凝胶材料具有催化NO供体释放NO的作用，而NO可以显著促进内皮细胞的粘附与增殖。

Claims (10)

1.一种诱导NO释放的抗凝血水凝胶材料，其特征在于，所述的诱导NO释放的抗凝血水凝胶材料的结构式为：
Figure FDA0003060416880000011
其中，
Figure FDA0003060416880000012
为肝素链段。
2.权利要求1所述的一种诱导NO释放的抗凝血水凝胶材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备抗凝血的水凝胶材料：在四氢呋喃溶液中加入六臂聚乙二醇，搅拌溶解，加入肝素，继续搅拌溶解，加入4-二甲氨基吡啶与碳二亚胺，在冰浴中充分搅拌，常温搅拌反应，加入冰乙醇生成沉淀，抽滤，真空干燥，得到抗凝血的水凝胶材料，即肝素接枝的六臂聚乙二醇水凝胶材料；
(2)制备诱导NO释放的抗凝血水凝胶材料：在四氢呋喃溶液中加入肝素接枝的六臂聚乙二醇水凝胶材料，搅拌溶解，加入硒代胱胺，搅拌反应，加入碳二亚胺水溶液和N-羟基琥珀酰亚胺水溶液，继续搅拌反应，蒸发水分，加入冰乙醇生成沉淀，抽滤，真空干燥，得到诱导NO释放的抗凝血水凝胶材料。
3.根据权利要求2所述的诱导NO释放的抗凝血水凝胶材料的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述六臂聚乙二醇的分子量为2000-20000。
4.根据权利要求2所述的诱导NO释放的抗凝血水凝胶材料的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述碳二亚胺为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺中的一种。
5.根据权利要求2所述的诱导NO释放的抗凝血水凝胶材料的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述肝素与六臂聚乙二醇的质量比为1:5-1:20，所述4-二甲氨基吡啶与碳二亚胺的质量比为1:5-1:10；所述肝素和六臂聚乙二醇与四氢呋喃溶液的固液比分别为0.01-1g:mL。
6.根据权利要求2所述的抗凝血水凝胶材料的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述常温搅拌反应时间为12-24h。
7.根据权利要求2所述的诱导NO释放的抗凝血水凝胶材料的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述碳二亚胺水溶液和N-羟基琥珀酰亚胺水溶液的浓度分别为2-10mM，所述加入碳二亚胺水溶液和N-羟基琥珀酰亚胺水溶液体积比为1:1-4:1。
8.根据权利要求2所述的诱导NO释放的抗凝血水凝胶材料的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述肝素接枝的六臂聚乙二醇水凝胶材料与硒代胱胺的质量比为1:1-5:1，所述肝素接枝的六臂聚乙二醇水凝胶与四氢呋喃溶液的固液比为0.1-1g:mL，硒代胱胺与四氢呋喃溶液的固液比为0.1-0.5g:mL，所述继续搅拌反应时间为6-24h。
9.权利要求1所述的诱导NO释放的抗凝血水凝胶材料在制备催化诱导NO释放的抗凝血组织工程人工血管中的应用。
10.权利要求1所述的诱导NO释放的抗凝血水凝胶材料在制备修复血管内皮医疗器械方面的应用。
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