RU2702239C1 - Технология изготовления функционально активных биодеградируемых сосудистых протезов малого диаметра с лекарственным покрытием - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области медицины, а именно к технологии изготовления функционального биодеградируемого сосудистого протеза малого диаметра с лекарственным покрытием из смеси биосовместимых полимеров ε-поликапролактона и полигидроксибутирата/валерата, с введенными в структуру ангиогенными факторами и тромборезистентной внутренней поверхностью для проведения операций по реконструкции кровеносных сосудов. Основу протеза изготавливают методом эмульсионного электроспининга, формируя два слоя с разной функциональной активностью: внутренний слой составляет 1/3 стенки протеза и содержит сосудистый эндотелиальный фактор роста, внешний слой составляет 2/3 стенки протеза и содержит смесь основного фактора роста фибробластов и стромального фактора-1 альфа. Тромборезистентность протеза достигается формированием на внутренней поверхности гидрогелевого покрытия из поливинилпирролидона с последующим введением в него антитромбогенных лекарственных средств: нефракционированного гепарина и илопроста или их аналогов. Техническим результатом изобретения является изготовление биоактивного биодеградируемого сосудистого протеза малого диаметра с тромборезистентной внутренней поверхностью для эффективного функционирования после имплантации в кровеносное русло и регенерации тканей кровеносного сосуда на его основе. 6 з.п. ф-лы, 3 ил., 1 пр.

Description

Настоящее изобретение относится к области медицины и может быть использовано для изготовления сосудистых протезов, в частности, биодеградируемых сосудистых имплантатов, стимулирующих регенерацию тканей кровеносного сосуда, для применения в сердечнососудистой хирургии.

На сегодняшний день отмечается непрерывный рост частоты развития атеросклероза среди населения, в том числе, с поражением коронарных артерий и периферических кровеносных сосудов. В связи с этим возрастает количество хирургических вмешательств по восстановлению эффективного кровотока в поврежденных кровеносных сосудах посредством их протезирования или наложения шунтов. При проведении данных операций используют аутологичные вены и артерии, либо синтетические сосудистые протезы с внутренним диаметром менее 6 мм. Наилучшим вариантом для проведения шунтирующих операций и замены поврежденных сосудов является использование аутологичных кровеносных сосудов, например, внутренней грудной артерии и большой подкожной вены бедра при аортокоронарном шунтировании. Однако аутологичные вены и артерии имеют ограниченную доступность. Причинами этого являются ранее перенесенные операции с использованием данных сосудов, прогрессирующий атеросклероз и другие заболевания. В свою очередь, синтетические протезы с диаметром менее 6 мм, применяемые в клинической практике в настоящее время, подвержены высокому риску тромбообразования, а также гиперплазии неоинтимы в отдаленный послеоперационный период. В связи с этим, наиболее острой стала проблема создания альтернативного сосудистого имплантата малого диаметра.

Одной из перспективных современных областей, занимающихся разработкой эффективных протезов кровеносных сосудов, является сосудистая тканевая инженерия. Существуют различные подходы тканевой инженерии кровеносных сосудов, но все они направлены на создание функционального сосудистого имплантата, имеющего строение, сходное с организацией тканей нативной артерии, и демонстрирующего проходимость в отдаленный послеоперационный период. Основой подобного сосудистого протеза является искусственный трубчатый матрикс, чаще всего выполненный из биодеградируемых природных и/или синтетических полимеров, обладающих высокой биосовместимостью. Матрикс представляет собой каркас, который заселяется аутологичными клетками в условиях in vitro или in situ. Заселение матрикса in vitro собственными клетками пациента является очень трудоемким, длительным, дорогостоящим процессом и сложно осуществимым в условиях клиники, особенно при проведении экстренных операций. В свою очередь, заселение матрикса клетками in situ, то есть непосредственно в месте имплантации, происходит благодаря естественным процессам биоремоделирования имплантата. Несмотря на перспективность и кажущуюся простоту данного подхода, разрабатываемые протезы демонстрируют ряд недостатков, связанных с возникновением осложнений после имплантации: аневризмы или разрыв стенки протеза в результате быстрой деградации матрикса и потери прочности протеза; острый тромбоз из-за недостаточной тромборезистентности искусственной поверхности протеза, а также медленного формирования эндотелиальной выстилки; гиперплазия неоинтимы в результате различной комплаентности нативного сосуда и материала протеза.

Решением данных проблем может стать обеспечение направленной регуляции и стимуляции процесса ремоделирования сосудистого протеза после его имплантации in situ, а также формирование тромборезистентной внутренней поверхности протеза для предотвращения тромбообразования в ранний послеоперационный период. Введение биологически активных веществ, таких как ростовые факторы, хемокины, интерлейкины, аминокислоты и прочие, в структуру имплантата и их пролонгированное высвобождение может имитировать естественные биохимические сигналы и направлять процесс регенерации с формированием всех структурных слоев сосудистой ткани, в том числе эндотелия. Эндотелиальный слой представляет собой монослой эндотелиальных клеток и образует внутреннюю поверхность нативных кровеносных сосудов. Благодаря способности экспрессировать антикоагулянты и фибринолитические вещества, а также контролировать адгезию, агрегацию и активацию тромбоцитов, эндотелий формирует тромборезистентный барьер между тканями кровеносного сосуда и циркулирующей кровью. Кроме того, эндотелий обладает противоспалительной функцией, что позволяет сохранять целостность кровеносного сосуда и препятствует гиперплазии неоинтимы. Однако формирование непрерывного эндотелиального слоя на внутренней поверхности имплантированного сосудистого протеза в процессе его ремоделирования требует определенного времени. При этом остается высокий риск острого тромбоза имплантата в ранний послеоперационный период, что делает необходимым дополнительную модификацию протеза для придания ему тромборезистентных свойств. В свою очередь, этого можно добиться иммобилизацией на его внутренней поверхности антитромботических лекарственных средств (антиагрегантов и антикоагулянтов).

Известен биодеградируемый сосудистый имплантат малого диаметра, содержащий комбинацию биологически активных веществ для регенерации кровеносного сосуда in situ (RU 2642259 С2; МПК A61F 2/06; A61L 27/14; A61L 27/54. Тканеинженерный биодеградируемый сосудистый имплант. Антонова Л.В., Кудрявцева Ю.А., Барбараш О.Л., Барбараш Л.С.; №2016123645 заявл. 14.06.2016; опубл. 24.01.2018). Протез изготовливают методом электроспиннинга из смеси поликапролактона и полигидроксибутирата/валерата. Стенка протеза состоит из нановолокон, в которые инкорпорированы биологически активные молекулы: сосудистый эндотелиальный фактор роста, основной фактор роста фибробластов и стромальный фактор 1 альфа. При этом выход биомолекул из протеза происходит в процессе его деградации и обеспечивает привлечение клеток сосудистой стенки.

Основной недостаток данного имплантата заключается в отсутствии антитромботической обработки его внутренней поверхности и в существующем риске тромбообразования при контакте с кровью, что обусловлено как использованием искусственного полимера, так пористой структурой внутренней поверхности.

Известен способ изготовления пористого сосудистого графта малого диаметра с улучшенной проходимостью после имплантации в кровеносное русло (Wang S, Mo ХМ, Jiang BJ, Gao CJ, Wang HS, Zhuang YG, Qiu LJ. Fabrication of small-diameter vascular scaffolds by heparin-bonded P(LLA-CL) composite nanofibers to improve graft patency. Int J Nanomedicine 2013; 8: 2131-9). Имплантат изготавливают из сополимера молочной кислоты и поликапролактона, вводя в его структуру гепарин с помощью коаксильного электроспиннинга. При этом стенка графта состоит из полимерных волокон, в центральной части которых находится антикоагулянт. Контролируемый выход гепарина осуществляется благодаря деградации полимерного материала. Также для того, чтобы улучшить биосовместимость графта и его проходимость, внутреннюю поверхность эндотелизируют in vitro аутологичными эндотелиальными клетками.

Представленный подход к изготовлению сосудистого имплантата имеет несколько недостатков. Во-первых, инкорпорирование гепарина внутрь полимерного волокна приводит к его полной изоляции от окружающей среды, что препятствует его действию в первые минуты после имплантации графта и контакта с кровью. Необходимый эффект гепарина будет получен только после деградации части полимерных волокон графта и высвобождения лекарственного средства в окружающие ткани. Все это увеличивает риск острого тромбоза. Во-вторых, использование аутологичных клеток для эндотелизации графта in vitro значительно усложняет процесс изготовления имплантата, так как получение аутологичных эндотелиальных клеток является инвазивной процедурой, а клеточная экспансия и формирование эндотелиального монослоя на внутренней поверхности протеза занимают достаточно много времени. В-третьих, данные протезы не содержат биологически активных веществ, которые бы стимулировали формирование других слоев сосудистой стенки - медии и адвентиции. В свою очередь, медленное ремоделирование имплантата может привести к потере его прочности в результате деградации полимера и недостатка нативного внеклеточного матрикса, синтезируемого собственными клетками организма. Это может привести к таким осложнениям, как формирование аневризм или разрыв стенки полимерного графта.

Известен способ изготовления пористого биодеградируемого сосудистого графта из поликапролактона, модифицированного ростовыми факторами и гепарином, для сосудистой тканевой инженерии in situ (RU 2496526 С1; МПК A61L 27/58; A61L 33/06; A61F 2/06. Тканеинженерный сосудистый графт малого диаметра и способ его изготовления. Барбараш Л.С., Эльгудин Я.Л., Севостьянова В.В., Головкин А.С.; №2012113439/15 заявл. 06.04.2012; опубл. 27.10.2013). Графт имеет пористую структуру, так как его изготавливают методом электроспининга. При проведении электроспининга в полимерные волокна вводят сосудистый эндотелиальный фактор роста, основной фактор роста фибробластов, стромальный фактор 1 альфа и гепарин. Биологически активные вещества могут быть введены как по отдельности, так и в комбинациях (в смеси или послойно).

К недостаткам этого изобретения можно отнести использование, в качестве материала для изготовления, поликапролактона. Известно, что сосудистые протезы из чистого поликапролактона после имплантации в кровеносное русло подвергаются значительной кальцификации. Кроме того, после изготовления имплантата ростовые факторы и гепарин полностью запаяны внутрь поликапролактоновых волокон и высвобождаются только в процессе деградации графта. Поэтому действие гепарина значительно отсрочено, что увеличивает вероятность тромбообразования в ранний послеоперационный период.

Известен тканеинженерный сосудистый графт на основе полиэстеров для формирования кровеносных сосудов малого диаметра in situ (US 2014/0309726 A1: Int. C1. A6IF 2/06; A6IL 27/20; A6IL 27/54; A6L 27/8. Biodegradable vascular grafts. Yadong Wang (US); appl. no. 14/365987; filed 21.12.2012; pub. date 16.10.2014). Графт имеет сложное строение. Внутреннюю часть имплантата изготовливают методом плавления или высаливания из полиглицеролсебаката (poly(glycerol sebacate, PGS), а также из других биодеградируемых полимеров, схожих по свойствам с PGS (полимолочной кислоты, полигликолиевой кислоты, сополимеров полимолочной и полигликолиевой кислоты, полидиоксанона, полифосфоэстеров и других), и/или дериватов полигликолиевой кислоты, поликарбоната, полиуретана, полиэтиленгликоля и полиортоэстера. Кроме того, внутренняя часть протеза может содержать вещества природного происхождения (коллаген, желатин, пептиды, аминокислоты, протеины, липиды, гликолипиды, протеогликаны, нуклеиновые кислоты и другие). Внешнюю часть имплантата изготавливают из поликапролактона методом электроспининга. Внутреннюю поверхность протеза покрывают гепарином и/или другими антикоагулянтами для увеличения его тромборезистентности. Также изделие может быть пропитано биологически активными веществами: ростовыми факторами, гормонами, интерлейкинами, интегринами, коллагеном, эластином, ламинином и другими.

Недостатки данного сосудистого имплантата заключаются в использовании для его изготовления быстро деградируемых полимеров и в способе модификации биологически активными веществами. Так, PGS и полимеры, имеющие схожие с ним свойства, отличаются высокой скоростью биодеградации, что может привести к быстрой потери прочности сосудистого графта, изготовленного на их основе, и, соответственно, к разрыву стенки графта. Покрытие же имплантанта гепарином и другими биоактивными молекулами без использования дополнительных связывающих агентов приведет к быстрому вымыванию этих веществ из графта током крови и их малой эффективности.

Наиболее близким к заявленному техническому решению является способ изготовления покрытий для медицинских устройств, имплантируемых в кровеносное русло, в том числе, и сосудистых графтов, изготовленных из биосовместимых биодеградируемых полимеров для доставки биологически активных веществ (ЕР 1135178 В1: Int. C1. A61L 29/08; A61L 29/16; A61L 31/10; A61L 31/16. Polymeric coatings with controlled delivery active agents. Kalpana R. Kamath (US), James J. Barry (US), Sepideh H. Nott (US).; appl. no. 99964984.1; filed 12.11.1999; pub. date 09.03.2011). Создание сосудистого графта, содержащего биологически активные вещества, заключается в формировании на основном материале имплантата нескольких функциональных слоев. Основа протеза может быть изготовлена из различных материалов, в том числе, из полимолочной кислоты, полигликолиевой кислоты, поликапролактона, полигидроксибутирата/валерата и других биодеградируемых полимеров, их сополимеров и смесей. На основу протеза наносят слой композитного материала, изготовленного из смеси полимера и биологически активного вещества (в виде раствора или эмульсии). При этом композитный слой является монолитным и представляет собой депо биоактивного вещества. Композитный слой наносят на основной материал с помощью напыления, погружения в раствор, электростатического взаимодействия или ковалентного связывания. В качестве биоактивных агентов в композитный слой может быть введен широкий спектр веществ, включая ангиогенные и ростовые факторы, антикоагулянты, тромболитики, гены, кодирующие ростовые факторы, антипролиферативные лекарственные средства и другие. В свою очередь, биосовместимый полимерный материал композита может быть представлен поликарбоксильными кислотами, ацетатом целлюлозы, нитратом целлюлозы, желатином, поливинилпирролидоном, сшитым поливинилпирролидоном, полиангидридами, полиамидами, полиэстерами и другими. Для обеспечения контролируемого выхода биомолекул композитный слой покрывают барьерным слоем, который наносят с помощью плазменной полимеризации мономеров: циклических и нециклических силоксанов, силанов, силимидазолов, гидрофлюорокарбонов, алифатических или ароматических гидрокарбонов, акриловых мономеров, N-винилпирролидона, этиленоксида. Барьерный слой может также содержать дополнительные биологически активные вещества, например, гепарин, или может быть покрыт ими.

Один из недостатков предложенного подхода к изготовлению биоактивного сосудистого графта заключается в непористой структуре основного материала имплантата, что, в свою очередь, затруднит его ремоделирование. Также биоактивные молекулы находятся только в композитном и барьерном слоях, которые достаточно тонкие по сравнению с основным слоем изделия, следовательно, их эффекты, например, привлечение клеток сосудистой стенки, будут осуществляться только на поверхности основной части протеза, что может замедлить процесс его ремоделирования.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является технология изготовления биоактивного биодеградируемого сосудистого протеза малого диаметра с тромборезистентной внутренней поверхностью для эффективного функционирования после имплантации в кровеносное русло и регенерации тканей кровеносного сосуда на его основе.

Технический результат достигается при совокупности следующих параметров:

1. В качестве основного материала для изготовления биоактивного сосудистого протеза с тромборезистентной внутренней поверхностью используют смесь биосовместимых биодеградируемых полимеров: полигидроксибутирата/валерата (poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate), PHBV) и ε-поликапролактона (ε-polycaprolactone, PCL). При этом PHBV представляет собой полимер природного происхождения и отличается высокой биосовместимостью, но изделия, полученные из него, имеют значительную жесткость и хрупкость. В свою очередь PCL является материалом с достаточно высокой прочностью и эластичностью, но менее биосовместимым. Комбинация двух полимеров при изготовлении протезов позволяет нивелировать их недостатки и получить имплантат с оптимальными показателями механических свойств и биосовместимости.

2. Для стимуляции процесса ремоделирования протеза после имплантации in situ в качестве биологически активных веществ для локальной доставки в место имплантации используют ангиогенные факторы, к которым относится сосудистый эндотелиальный фактор роста (vascular endothelial growth factor, VEGF), основной фактор роста фибробластов (basic fibroblast growth factor, bFGF) и стромальный фактор 1 альфа (stromal cell-derived factor 1 alpha, SDF-1α). VEGF известен своей способностью стимулировать эндотелизацию, так как он активирует и поддерживает миграцию, пролиферацию, выживание и дифференцировку эндотелиальных клеток В свою очередь, bFGF стимулирует миграцию, пролиферацию и выживание как эндотелиальных, так и гладкомышечных клеток. A SDF-1α привлекает мезенхимальные стволовые клетки костного мозга в место регенерации и обладает функцией стабилизировать новые кровеносные сосуды.

3. Сосудистый протез изготавливают методом эмульсионного электроспининга, что позволяет ввести биологически активные молекулы внутрь полимерного волокна в процессе изготовления имплантата. При этом биомолекулы высвобождаются в месте ремоделирования протеза в процессе деградации полимерного материала. Стенка самого протеза образована тонкими полимерными волокна от 100 нм до 2 мкм и имеет высокопористую структуру, при этом пористость стенки составляет не менее 50%.

4. При изготовлении протеза ангиогенные факторы вводят в его стенку в разные слои в зависимости от их биологических функций. VEGF инкорпорируют во внутреннюю 1/3 стенки, а смесь bFGF и SDF-1α - во внешние 2/3 стенки протеза (Фиг. 1).

5. Для увеличения тромборезистентности внутренней поверхности сосудистого протеза ее модифицируют антитромботическими лекарственными средствами. В качестве антитромботических лекарственных средств могут быть использованы антиагреганты (илопрост и его аналоги) и антикоагулянты (нефракционированный гепарин). Модификация внутренней поверхности протеза может осуществляться только илопростом или гепарином, а также и смесью данных препаратов или их аналогов. При этом использование комбинаций препаратов из разных групп усиливает антитромботический эффект модификации.

6. Модификация протеза антитромботическими средствами осуществляется с помощью формирования на его внутренней поверхности гидрогелевого покрытия из поливинилпирролидона (polyvinylpyrrolidone, PVP), который способен связывать лекарственные средства в результате комплексообразования. Кроме того, образование на поверхности сосуда гидрогелевого слоя из PVP увеличивает его гидрофильность, что способствует снижению степени адгезии белковых молекул и форменных элементов крови, в частности, тромбоцитов, а также предотвращению конформационных изменений белковых структур. Подвижностью макромолекулярных цепей в гидрогелях, в том числе, обусловлена высокая скорость десорбции молекул белка, дополняющая спектр причин их антитромбогенного потенциала.

7. Гидрогелевое покрытие на внутренней поверхности полимерного протеза формируют с помощью метода радиационной прививочной полимеризации, который позволяет проводить процесс при достаточно низких температурах: в твердом состоянии, обеспечивая сшивание полимер-полимер; в жидкой среде мономера или в парах мономера.

8. Антитромбогенные препараты вводят в готовое гидрогелевое покрытие таким образом, что лекарственный компонент частично проникает в полимер PVP, а частично остается в просвете сосудистого протеза. Благодаря этому при контакте протеза с кровью антитромбогенное действие лекарственных средств осуществляется мгновенно. Такой способ включения лекарственных препаратов, в отличие от ковалентного связывания, позволяет максимально сохранить их биологическую активность, не создавая стерических препятствий и не блокируя центры связывания молекул с факторами свертывания крови.

Изготовление биологически активного сосудистого протеза с тромборезистентной внутренней поверхностью проводят следующим образом.

Этап 1. Изготовление полимерного протеза методом электроспининга.

- Готовят эмульсию для формирования внутренней 1/3 части стенки протеза из раствора смеси полимеров PHBV/PCL в соотношении 1:2 в органическом растворителе трихлорметане с концентрацией 10-20%. Полимерный раствор смешивают с раствором VEGF в физиологическом растворе или в фосфатно-солевом буфере, или в стерильной воде в концентрации 1-10 мг/мл. Соотношение раствора полимеров к раствору VEGF составляет 20:1. Растворы тщательно смешивают с помощью магнитной мешалки или ультразвуковой ванне до образования устойчивой эмульсии.

- Готовят эмульсию для формирования внешней 2/3 части стенки протеза из раствора смеси полимеров PHBV/PCL в соотношении 1:2 в трихлорметане, концентрацией 10-20%, который смешивают с раствором смеси bFGF и SDF-1α в физиологическом растворе или в фосфатно-солевом буфере, или в стерильной воде в концентрации 1-10 мг/мл. Соотношение раствора полимеров к раствору смеси bFGF и SDF-1α составляет 20:1. Растворы тщательно смешивают с помощью магнитной мешалки или на ультразвуковой ванне до образования устойчивой эмульсии.

- Растворы VEGF, bFGF и SDF-1α могут быть как одной концентрации, так и в разных концентрациях.

- Осуществляют электроспининг раствора PHBV/PCL/VEGF на поверхность металлического вращающегося штифта диаметром 1-6 мм при скорости подачи раствора 0,1-5 мл/ч, подаваемом напряжении 15-25 кВ, расстоянии от места выхода полимерной нити до коллектора 5-30 см. Процесс электроспининга продолжают до образования слоя толщиной 50-350 мкм. Далее электроспининг продолжают с использованием раствора PHBV/PCL/bFGF/SDF-1α при тех же условиях процесса до формирования слоя 100-700 мкм. При этом толщина стенки сосудистого протеза составляет 150-1050 мкм.

Этап 2. Антитромбогенная модификация внутренней поверхности полимерного протеза.

- Для модификации внутренней поверхности протеза готовят раствор PVP в этиловом спирте или воде с концентрацией 1-25%. Протез погружают в раствор PVP, при этом полностью заполняют раствором внутренний канал протеза на 10-60 минут. Далее протез вынимают из раствора и сушат горизонтально в течение 24 часов.

- Для проведения прививки PVP к поверхности полимерного протеза, изделие помещают в стеклянную пробирку, которую заполняют инертным газом и облучают ионизирующим излучением с общей поглощенной дозой 25-50 кГр.

- Готовят растворы антитромбогенных лекарственных средств с использованием глицинового буферного раствора (рН=2,5-2,6):

модифицирующий раствор лекарственного препарата нефракционированного гепарина в глициновом буферном растворе в концентрации 50-1000 МЕ/мл;

модифицирующий раствор лекарственного препарата илопроста (или его аналога) в глициновом буферном растворе в концентрации 0,1-2,0 мкг/мл. модифицирующий раствор, содержащий нефракционированный гепарин 50-1000 МЕ/мл и илопрост (или его аналог) 0,1-2,0 мкг/мл в глициновом буферном растворе.

- Для присоединения лекарственных препаратов к PVP покрытию сосудистые протезы выдерживают в одном из модифицирующих растворов в течение 30 минут. Далее изделие высушивают на воздухе в стерильных условиях.

Сущность изобретения поясняется иллюстрациями.

Фиг. 1. Схема поперечного среза функционально активного биодеградируемого сосудистого протеза малого диаметра с лекарственным покрытием: 1 - внешний слой протеза, содержащий сосудистый эндотелиальный фактор роста; 2 - внутренний слой протеза, содержащий основной фактор роста фибробластов и стромальный фактор-1 альфа; 3 - покрытие на внутренней поверхности протеза из гидрогеля на основе поливинилпирролидона; 4 - антиагрегантные лекарственные средства (гепарин и/или илопрост).

Фиг. 2. Степень гемолиза эритроцитов и максимум агрегации тромбоцитов крови человека после контакта с полимерными протезами из полигидроксибутирата/валерата и ε-поликапролактона немодифицированных (PHBV/PCL), модифицированных гепарином (PHBV/PCL/гепарин) и модифицированных гепарином и илопростом (PHBV/PCL/гепарин/илопрост).

Фиг. 3. Результаты проходимости сосудистых протезов PHBV/PCL/гепарин/илопрост и PHBV/PCL, имплантированных в сонную артерию овец. Срок наблюдения - 3 месяца после имплантации. Метод визуализации - ультразвуковое исследование с функцией доплера.

Пример 1. Изготовление биоактивных сосудистых протезов с внутренней поверхностью, модифицированной гепарином и гепарином в сочетании с илопростом.

Сосудистые протезы с проангиогенными факторами изготавливали методом эмульсионного электроспининга из смеси PHBV и PCL. Для инкорпорирования в сосудистые протезы использовали рекомбинантные ростовые факторы человека: VEGF и bFGF, а также рекомбинантную хемоаттрактантную молекулу человека - SDF-1α. Внутренний слой протеза изготавливали из полимерного раствора в трихлорметане, содержащего 5% PHBV и 10% PCL, который смешивали с раствором VEGF (10 мкг/мл) в физиологическом растворе в соотношении 20:1 с помощью магнитной мешалки до получения эмульсии. Для изготовления внешнего слоя протеза полимерный раствор в трихлорметане, содержащий 5% PHBV и 10% PCL, смешивали с раствором, содержащим равные количества bFGF (10 мкг/мл) и SDF-1α (10 мкг/мл) в физиологическом растворе, в соотношении 20:1. Конечная концентрация каждого вида биомолекул составила 500 нг/мл полимерного раствора. Электроспининг осуществляли при напряжении 23 kV, скорости подачи раствора 0,5 мл/ч, расстоянии до коллектора 150 мм, с использованием затупленной иглы 22G. В качестве коллектора использовали штифт диаметром 4 мм. Внутреннюю 1/3 часть стенки протеза изготавливали из суспензии PHBV/PCL с раствором VEGF. Для изготовления внешних 2/3 стенки электроспининг продолжали с использованием полимерного раствора, содержащего bFGF и SDF-1α. Толщина стенки протезов составила ~400 мкм.

На внутренней поверхности изготовленных сосудистых протезов формировали полимерную подложку. Для этого образцы предварительно выдерживали в 5%-ом спиртовом растворе PVP и высушивали на воздухе при комнатной температуре в течение суток. Далее сосудистые протезы размещали в стеклянные пробирки, которые заполняли инертным газом аргоном и герметично запаковывали парафильмом. Прививку полимера на поверхность сосудистого протеза проводили под действием ионизирующего излучения при мощности дозы 20 кГр и времени облучения 2,5 ч. Одновременно с модифицированием происходила стерилизация сосудистых протезов, поэтому дальнейшие действия по обработке проводили в стерильных условиях. Непривитый полимер отмывали водой для инъекций в течение 1 часа.

Основываясь на способности PVP образовывать комплексы, последующее модифицирование проводили, используя гепарин и илопрост. Модифицирующие растворы готовили на глициновом буфере (рН=2,61): раствор №1 - 25000 ME нефракционированного гепарина в 100 мл буфера, раствор №2 - 12500 ME невракционированного гепарина и 20 мкг илопроста в 100 мл буфера. Сосудистые протезы выдерживали в приготовленных растворах в течение 30 минут, высушивали в течение суток на воздухе и размещали в стерильные емкости для хранения.

Оценка эффективности разработанной технологии.

Оценка гемосовместимости сосудистых протезов, модифицированных гепарином и гепарином в сочетании с илопростом.

Оценку степени гемолиза эритроцитов проводили согласно стандарту ISO 10993.4. Результаты испытаний показали, что степень гемолиза эритроцитов после контакта с протезами, модифицированными и без модификации, не превышала 2% во всех исследуемых группах (Фиг. 2), что свидетельствует о высокой гемосовместимости материала. Между протезами, модифицированными гепарином и гепарином с илопростом, статистически значимых отличий выявлено не было (р=0,61). При сравнении групп, модифицированных гепарином и гепарином с илопростом, с немодифицированными протезами результаты показали статистически значимое повышение степени гемолиза у модифицированных протезов (р<0,05), но при этом уровень гемолиза не выходил за допустимые пределы (2%).

Оценку агрегации тромбоцитов проводили согласно стандарту ISO 10993.4. Измерения осуществляли в спонтанном режиме без индукторов агрегации. Максимум агрегации тромбоцитов интактной обогащенной тромбоцитами плазмы (ОТП), выступающей в качестве положительного контроля, составил 14,61% (min: 9,43; max: 20,64; 25%: 13,63; 75%: 17,72). Сравнение модифицированных гепарином протезов с интактной ОТП показало достоверное повышение уровня агрегации тромбоцитов после модификации (р<0,05), при этом немодифицированные протезы не имели достоверных различий с интактной ОТП (р=0,41). Модификация протезов гепарином и илопростом позволила существенно уменьшить агрегацию тромбоцитов на их поверхности в сравнении с немодифицированными протезами и с интактной ОТП (р<0,05).

Оценка проходимости сосудистых протезов PHBV/PCL/гепарин/илопрост в сравнении с сосудистыми протезами PHBV/PCL после их имплантации в сонную артерию крупных лабораторных животных.

Имплантация сосудистых протезов PHBV/PCL/гепарин/илопрост диаметром 4 мм длиной 40 мм в сонную артерию овец проводилась по схеме 1 животное - 1 протез. Количество животных в группе - 8. В качестве группы сравнения осуществляли имплантацию сосудистых протезов PHBV/PCL без лекарственного покрытия. Количество животных в группе сравнения - 8, схема имплантации: 1 животное - 1 протез. Животным групп PHBV/PCL/гепарин/илопрост и PHBV/PCL вшивали сосудистые протезы в соответствии с названиями групп (протезы длиной 40 мм диаметром 4 мм). Послеоперационный скрининг проходимости имплантированных сосудистых протезов осуществляли методом ультразвукового исследования с функцией доплера спустя 1 и 5 суток после операции, через 1 и 3 месяца после операции.

Выявлено, что в группе сосудистых протезов PHBV/PCL/гепарин/илопрост, имплантированных в сонную артерию овец, проходимость имплантатов на протяжении всего периода наблюдения составила 62,5% (Фиг. 3). В группе немодифицированных сосудистых протезов PHBV/PCL проходимость имплантатов составила 0%.

Таким образом, предложенный способ лекарственного покрытия гепарином и илопростом поверхности биодеградируемых сосудистых протезов на основе PHBV/PCL значимо повысил проходимость протезов после их имплантации в сосудистое русло крупных лабораторных животных.

Claims (7)

1. Технология изготовления функционального активного биодеградируемого сосудистого протеза малого диаметра с лекарственным покрытием, основанная на формировании основной части протеза методом эмульсионного электроспининга из смеси ε-поликапролактона и полигидроксибутирата/валерата с введением в структуру полимерных нитей внутренней 1/3 стенки протеза молекул сосудистого эндотелиального фактора роста, и внешней 2/3 стенки протеза молекул основного фактора роста фибробластов и стромального фактора-1 альфа и нанесением на внутреннюю поверхность тромборезистентного покрытия, содержащего антитромботические лекарственные средства, отличающаяся тем, что тромборезистентное покрытие формируют из гидрогеля на основе поливинилпирролидона, способного связывать лекарственные средства путем комплексообразования, в качестве антитромботических лекарственных средств используют антикоагулянт - нефракционированный гепарин и антиагрегант - илопрост или его аналоги, или смесь - гепарин и илопрост или их аналоги.

2. Технология по п. 1, отличающаяся тем, что гидрогель из поливинилпирролидона сшивают с поверхностью полимерного протеза с помощью радиационной графт-полимеризации.

3. Технология по п. 2, отличающаяся тем, что радиационную графт-полимеризацию осуществляют под действием ионизирующего излучения с общей поглощенной дозой 25-50 кГр.

4. Технология по п. 1, отличающаяся тем, что антитромботическое лекарственное средство частично проникает в гидрогелевое покрытие из поливинилпирролидона.

5. Технология по п. 1, отличающаяся тем, что при модификации внутренней поверхности гепарином используют модифицирующий раствор, содержащий 50-1000 МЕ/мл гепарина в глициновом буферном растворе.

6. Технология по п. 1, отличающаяся тем, что при модификации внутренней поверхности илопростом используют модифицирующий раствор, содержащий 0,1-2,0 мкг/мл илопроста в глициновом буферном растворе.

7. Технология по п. 1, отличающаяся тем, что при модификации внутренней поверхности смесью гепарина и илопроста используют модифицирующий раствор, содержащий 50-1000 МЕ/мл нефракционированного гепарина и 0,1-2,0 мкг/мл илопроста или его аналога в глициновом буферном растворе.

Images