CN109549212A - 一种含有牡蛎多糖、牡蛎多肽的肠内营养剂及其制备方法 - Google Patents

一种含有牡蛎多糖、牡蛎多肽的肠内营养剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种含有牡蛎多糖、牡蛎多肽的肠内营养剂及其制备方法，属于特殊医学用途食品领域。所述肠内营养剂包括：蛋白质和碳水化合物；所述蛋白质至少包括牡蛎多肽；所述碳水化合物至少包括牡蛎多糖；所述牡蛎多肽和牡蛎多糖的重量比为(1‑3)：(1‑5)。所得牡蛎多糖对肿瘤细胞具有非常显著的抑制作用；所得的适合肿瘤病人的肠内营养剂具有增强免疫功能的效果。还提供了一种方法能够同时获得牡蛎多糖和牡蛎多肽，使资源被最大化利用，有利于降低成本。

Description

一种含有牡蛎多糖、牡蛎多肽的肠内营养剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种含有牡蛎多糖、牡蛎多肽的肠内营养剂及其制备方法，属于特殊医学用途食品领域。
背景技术
牡蛎，属牡蛎科或燕蛤科，双壳类软体动物，分布于温带和热带各大海洋沿岸水域。在我国沿海牡蛎分布很广，渤海、黄海至南沙群岛均产，约有20种。牡蛎肉肥爽滑，味道鲜美，营养丰富，素有“海底牛奶”之美称。目前，国外除了将牡蛎作为还未直接食用外，还大量开发研制了以牡蛎为主要成分的保健食品、食品、调味剂等多种产品。随着牡蛎提取物及牡蛎功能性食品和保健食品的效用的确认，其应用范围会不断的扩大，研制和开发牡蛎保健食品的前景十分诱人，而且作为营养辅助食品，可以带来显著的社会效益和经济效益，目前，全世界年产牡蛎1Mt左右，年贸易总额9000万美元，是沿海国家的一种重要的海洋经济贝类。
中医理论认为，牡蛎肉味甘、咸，微寒，性平，归肝、胆、肾经。《海药本草》中：牡蛎肉“主治男子遗精、虚劳乏损，补肾正气，止盗汗，去烦热”。《本草纲目》中：牡蛎“肉甘温、无毒，主治虚损，调中，解丹毒”。牡蛎味道鲜美，营养丰富。牡蛎肉中含有蛋白质7.284％，糖原4.914％，牛磺酸646.3mg/100g(以湿重计)；干牡蛎中蛋白质含量高达45％-57％，牡蛎中含有处理人体必需的20种常用氨基酸，所含糖分为糖原，占其肝重的20％-40％。糖原可为机体所吸收利用，从而减轻胰腺负担，对糖尿病的防治有十分重要的意义，并且具有调节机体免疫、抑制肿瘤、延缓衰老、降血糖、血脂等生物活性。
近年来对牡蛎功能的研究多数是基于牡蛎肉提取物(蛋白质≧25％，糖原≧25％，牛磺酸≧10(g/Kg)等)进行的，牡蛎提取物是以全牡蛎为原料，采用特殊方法分离提取的一种混合物的简称。目前，关于牡蛎提取物在抗疲劳、抗动脉粥样硬化和预防高血脂症等方面已有报道，但具体的有效成分、适应症难以确定。因此，研究牡蛎中具体的有效成分，开发牡蛎提取物相关产品，尤其是含有牡蛎提取物的肠内营养剂的产品将具有重大意义。
发明内容
本发明提供一种牡蛎多糖和/牡蛎多肽的制备方法及肠内营养剂，为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种肠内营养剂，包括：蛋白质和碳水化合物；
所述蛋白质至少包括牡蛎多肽；所述碳水化合物至少包括牡蛎多糖；所述牡蛎多肽和牡蛎多糖的重量比为(1-3)：(1-5)。
本发明所述的肠内营养剂，优选地，所述蛋白质还包括选自乳清蛋白、花生蛋白、大豆蛋白、大米蛋白、小麦蛋白、玉米蛋白、谷氨酰胺肽中的一种或几种；
所述碳水化合物还包括选自麦芽糖糊精、食用淀粉、膳食纤维、低聚果糖、β-葡聚糖中的一种或几种；
更优选地，所述蛋白质和所述碳水化合物的用量比为(1-3)：(2-8)。
所述肠内营养剂，关于所述蛋白质：优选地包括牡蛎多肽、谷氨酰胺肽，和乳清蛋白、花生蛋白、大豆蛋白、大米胚乳蛋白、小麦蛋白、玉米蛋白中的至少一种；更优选地，所述牡蛎多肽、谷氨酰胺肽，和乳清蛋白、花生蛋白、大豆蛋白、大米胚乳蛋白、小麦蛋白、玉米蛋白中的至少一种的用量比为(1-3)：(2-4)：(4-24)。上述蛋白质中：乳清蛋白、花生蛋白、大豆蛋白、大米胚乳蛋白、小麦蛋白、玉米蛋白可在配方中彼此替换，也可同时添加。
所述肠内营养剂，关于所述碳水化合物：优选地包括所述牡蛎多糖、膳食纤维，所述麦芽糖糊精、水解玉米淀粉中的至少一种，和低聚果糖、低聚异麦芽糖、低聚甘露糖、β-葡聚糖中的至少一种。
更优选地，所述牡蛎多糖，所述麦芽糖糊精、水解玉米淀粉中的至少一种，和低聚果糖、低聚异麦芽糖、低聚甘露糖、β-葡聚糖中的至少一种的用量比为(1-5)：(20-60)：(0.5-2)；优选的比例为(3-5)：(20-60)：(0.5-2)。
优选地，所述膳食纤维的用量与所述牡蛎多糖的比例为(1-3)：(1-5)；所述膳食纤维包括：可溶性膳食纤维和不溶性膳食纤维；更优选地，可溶性膳食纤维与不溶性膳食纤维的比例为1:(0.1-2)；更优选地，可溶性膳食纤维与不溶性膳食纤维的比例为1:(0.81.2)。
可溶性膳食纤维选自果胶、瓜尔豆胶、阿拉伯胶、卡拉胶、黄原胶、海藻胶、魔芋粉、米糠半纤维素中的一种或几种；
不溶性膳食纤维选自大豆膳食纤维、小麦麸纤维、玉米纤维、甜菜纤维中的一种或几种。
上述碳水化合物中，所述麦芽糖糊精、水解玉米淀粉可在配方中彼此替换，也可同时添加。所述低聚果糖、低聚异麦芽糖、低聚甘露糖、β-葡聚糖可在配方中彼此替换，也可同时添加。
本发明所述的肠内营养剂，优选地，还包括脂肪；所述脂肪与所述蛋白质和碳水化合物总重的重量比为(1-2)：(3-12)。
所述脂肪选自玉米油、亚麻油、紫苏油、火麻油、橄榄油中的一种或几种。
作为本发明的优选技术方案，所述的肠内营养剂包括：(由如下组分组成)
牡蛎多肽1-3份、乳清蛋白10-24份、谷氨酰胺肽2-3份；麦芽糖糊精20-35份、水解玉米淀粉20-35份、低聚果糖1-2份、牡蛎多糖3-5份、膳食纤维5-10份；紫苏油1-10份、玉米油1-15份；
其中，膳食纤维为果胶1.5份、瓜尔豆胶1份、米糠半纤维素1.5份；大豆膳食纤维1.5份、小麦麸纤维1份、玉米纤维1.5份。
作为本发明所述的最优选实施方式，包括(由如下组分组成)：
牡蛎多肽1-3份、乳清蛋白10-24份、谷氨酰胺肽2-3份；麦芽糖糊精20-35份、水解玉米淀粉20-35份、低聚果糖1-2份、牡蛎多糖3-5份、膳食纤维5-10份；紫苏油1-10份、玉米油1-15份；
其中，膳食纤维为果胶1.5-3份、瓜尔豆胶1-2份、米糠半纤维素1.5-2份；大豆膳食纤维1-1.5份、小麦麸纤维1-2份、玉米纤维1.5-2.5份。
更优选地，所述肠内营养剂还包括微量元素和维生素中的至少一种。
所述微量元素包括：钙、镁、铁、钠、钾、锌、铜、锰、锌、磷、氯、碘、硒中的至少一种；
优选地，每100g或400ml所述肠内营养剂添加钙260-280mg、镁90-100mg、铁2-3mg、钠350-400mg、钾500-560mg、锌1.5-2.0mg、铜200-300μg、锰100-200μg、锌1-3mg、磷150-200mg、氯200-300mg、碘30-40μg、硒16-50μg；(上述重量份均以微量元素本身的质量计)
所述维生素包括：维生素A、维生素E、维生素D、维生素K1、维生素C、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、烟酸、叶酸、泛酸、生物素中的至少一种；
优选地，每100g或400ml适合肿瘤病人的肠内营养剂添加维生素A190-210μg、维生素E 4.0-8.0mg、维生素D 3.5-4.0μg、维生素K1 21-25μg、维生素C 36-45mg、维生素B10.3-0.4mg、维生素B2 0.3-0.4mg、维生素B6 0.3-0.4mg、维生素B12 0.62-0.65μg、烟酸1.0-1.2mg、叶酸105-110μg、泛酸1.4-1.6mg、生物素10.5-11μg。
本发明所述的肠内营养剂，其中，牡蛎多糖由如下方法制备而得：
将牡蛎肉进行酶解反应时，使用的酶包括枯草杆菌蛋白酶和米曲霉蛋白酶。
本发明所述的牡蛎多糖的制备方法，优选地，所述枯草杆菌蛋白酶和米曲霉蛋白酶的用量比(此处是指重量比)为(1-5)：(5-1)；更优选地，所述用量比为(1-2)：(1-2)。
本发明所述的牡蛎多糖的制备方法，所述酶解反应时，所使用的酶还包括异淀粉酶。优选地，所述异淀粉酶与所述枯草杆菌蛋白酶和米曲霉蛋白酶总量的用量比为(0.5-2)：(2-10)；进一步地，是所述枯草杆菌蛋白酶的(0.5-2)：(1-5)；和/或，是所述米曲霉蛋白酶的(0.5-2)：(1-5)。
本发明所述的牡蛎多糖的制备方法，所述枯草杆菌蛋白酶和米曲霉蛋白酶的用量是所述牡蛎肉的2-10％；和/或，所述异淀粉酶的用量是所述牡蛎肉的0.5-2％。更优选地，所述异淀粉酶的用量是所述牡蛎肉的0.8％-1.5％。
本发明所述的牡蛎多糖的制备方法，优选地，所述酶解反应包括第一酶解反应和第二酶解反应；先以所述枯草杆菌蛋白酶和米曲霉蛋白酶进行所述第一酶解反应，再以所述异淀粉酶进行所述第二酶解反应。
更优选地，所述第一酶解反应中，将牡蛎肉匀浆调节pH值6-8，在30-50℃下，以所述枯草杆菌蛋白酶和米曲霉蛋白酶酶解1-4小时后，升温80-90℃，保持5-10分钟后，降温20-40℃，离心取清液，再进行所述第二酶解反应。
和/或，所述第二酶解反应中，将所述异淀粉酶加入所述第一酶解反应后得到的清液中，酶解反应2-6小时，离心取清液即可。
更优选地，所述第二酶解反应中，需调整清液pH值至6.5-7.0，酶解温度为30-50℃，酶解反应结束后煮沸10-15分钟，冷却至室温后即可。
本发明所述的牡蛎多糖的制备方法，优选地，还包括在所述酶解反应之后，进行去蛋白的步骤；将经过酶解反应的清液以截留分子量为1×104Da-6×104Da的膜分离，得到截留物溶液，再将所述截留物溶液按1：(4-6)的体积比加入氯仿-正丁醇溶液，混合搅拌20-30分钟，充分静止分层除去白色沉淀，数次后直至界面无白色沉淀即得；或，将经过酶解反应的清液以截留分子量为1×104Da-6×104Da的膜分离，得到截留物溶液，向所述截留物溶液加入占所述截留物溶液体积比为3-5％的三氯乙酸。本领域技术人员可以理解，在除去蛋白之后，还可包括将经过除蛋白截留物溶液的真空浓缩、冷冻干燥的步骤，采用本领域常规操作即可，在此不做特殊限制。
本发明所述的牡蛎多糖的制备方法，优选地，在所述去蛋白的步骤之后，还包括纯化。所述纯化包括：将已去蛋白的截留物溶解于蒸馏水中，加入处理好的ME-1树脂中，吸附过夜，装柱；分别以水、5％乙醇及15％乙醇依次洗脱，至洗脱液中不含糖，收集15％乙醇洗脱组分，收集冻干，得牡蛎多糖。
本发明所述的牡蛎多糖的制备方法，所述牡蛎肉是加入1-6倍重量的水再进行匀浆的。
本发明所述的牡蛎多糖的制备方法，具体包括如下步骤：
步骤一、将牡蛎肉洗净，加入1-6倍重量的水，匀浆；
步骤二、调节匀浆液pH值至6-8，温度为30-50℃，加入枯草杆菌蛋白酶和米曲霉蛋白酶酶解1-4小时，升温至80-90℃，保持5-10分钟后，降温至20-40℃，离心，取清液；
步骤三、将异淀粉酶加入到清液中，进行酶解反应2-6小时，离心，取清液；
步骤四、将清液用截留分子量为1×104Da-6×104Da的膜分离，得到截留物；
步骤五、在截留物溶液中按1：4加入氯仿-正丁醇溶液，混合搅拌20-30分钟，充分静止分层除去白色沉淀，数次后直至界面无白色沉淀；也可以直接加3％三氯乙酸法除蛋白；将经过除蛋白截留物溶液的真空浓缩、冷冻干燥；
步骤六、截留物纯化：将截留物溶解于蒸馏水中，加入处理好的ME-1树脂中，吸附过夜，装柱；分别以水、5％乙醇及15％乙醇洗脱，至洗脱液中不含糖，收集15％乙醇洗脱组分，收集冻干，得牡蛎多糖；
优选地，在步骤二中所述枯草杆菌蛋白酶的用量为牡蛎肉重量的1％-5％，所述米曲霉蛋白酶的用量为牡蛎肉重量的1％-5％。
优选地，在步骤三中，所述异淀粉酶的用量为牡蛎肉重量的0.5％-2％，调整清液pH值至6.5-7.0，酶解温度为30-50℃，酶解反应结束后煮沸10分钟，冷却至室温。
本发明所述的肠内营养剂，进一步地，所述牡蛎多糖和牡蛎多肽以如下制备方法同时获得，包括：
将牡蛎肉匀浆后以枯草杆菌蛋白酶和米曲霉蛋白酶酶解，离心得到清液1和沉淀物1；
将所述清液1经1000-1500Da的膜截留得到透过液A和截留物B；所述截留物B以异淀粉酶酶解，得到清液2；
将所述清液2经1×104Da-6×104Da的膜截留得到截留物C，所述截留物C经纯化后得到牡蛎多糖。
将所述透过液A和所述沉淀物1经冷冻干燥，即得牡蛎多肽。
优选地，所述枯草杆菌蛋白酶的用量为牡蛎肉重量的1％-5％，所述米曲霉蛋白酶的用量为牡蛎肉重量的1％-5％。
优选地，所述异淀粉酶的用量为牡蛎肉重量的0.5％-2％，调整清液pH值至6.5-7.0，酶解温度为30-50℃，酶解反应结束后煮沸10分钟，冷却至室温。
本发明同时提供上述任意一项技术方案所述的肠内营养剂的制备方法：
将全部原料按照每100g原料400毫升水的比例在50-60℃、14-21MPa条件下均质，得到乳液，经过灭菌后，于50-60℃、真空度为8-21KPa条件下进行真空浓缩至原体积的20-30％，经喷雾干燥即得。
所述的制备方法中：牡蛎多糖与牡蛎多肽的提取方法如下：
步骤一、将牡蛎肉洗净，加入1-6倍重量的水，匀浆；
步骤二、调节匀浆液pH值至6-8，温度为30-50℃，加入枯草杆菌蛋白酶和米曲霉蛋白酶酶解2-6小时，升温至80-90℃，保持5-10分钟后，降温至20-40℃，离心得上清液1和沉淀物1；步骤三、将上清液1用截留分子量为1000Da的膜分离上清液，得到透过液A和截留物B；
步骤四、将异淀粉酶加入到截留物B中，进行酶解反应2-6小时，离心，取清液；
步骤五、将清液用截留分子量为1×104Da-6×104Da的膜分离，得到截留物C；
步骤六、在截留物C溶液中按1：4加入氯仿-正丁醇溶液，混合搅拌20-30分钟，充分静止分层除去白色沉淀，数次后直至界面无白色沉淀；也可以直接加3％三氯乙酸法除蛋白；将经过除蛋白截留物C溶液的真空浓缩、冷冻干燥；
步骤七、截留物C纯化：将截留物C溶解于蒸馏水中，加入处理好的ME-1树脂中，吸附过夜，装柱；分别以水、5％乙醇及15％乙醇洗脱，至洗脱液中不含糖(苯酚-硫酸法检测)，收集15％乙醇洗脱组分，收集冻干，得牡蛎多糖；
步骤八、透过液A的处理：将透过液A透析浓缩后，与沉淀物1一起冷冻干燥，得到牡蛎多肽粉。
优选地，在步骤二中所述枯草杆菌蛋白酶的用量为牡蛎肉重量的1％-5％，所述米曲霉蛋白酶的用量为牡蛎肉重量的1％-5％。
优选地，在步骤四中，所述异淀粉酶的用量为牡蛎肉重量的0.5％-2％，调整清液pH值至6.5-7.0，酶解温度为30-50℃，酶解反应结束后煮沸10分钟，冷却至室温。
本发明具有以下有益效果：1.本发明方法能够同时获得牡蛎多糖和牡蛎多肽，使资源被最大化利用，有利于降低成本；2.本发明方法所得牡蛎多糖对肿瘤细胞具有非常显著的抑制作用；3.本发明方法所得的适合肿瘤病人的肠内营养剂具有增强免疫功能的效果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
称取4Kg牡蛎肉(含蛋白质349.95g，糖原154.9g)洗净，加入12Kg的水，匀浆；调节匀浆液pH值至7.0，温度为37℃，加入80g枯草杆菌蛋白酶和80g的米曲霉蛋白酶酶解4小时，升温至80℃，保持5-10分钟后，降温至25℃。在6000r/min的转速下离心15分钟，得上清液1和沉淀物1。将上清液1用截留分子量为1000Da的膜分离上清液，得到透过液A和截留物B；
将40g异淀粉酶加入到截留物B中，调整清液pH值至6.5，酶解温度为45℃，酶解反应3小时后煮沸10分钟，冷却至室温，离心，取清液。
用截留分子量为1×104Da-6×104Da的膜分离清液，得到截留物C。
氯仿与正丁醇按4：1的体积混合后，置于棕色瓶中保存，在截留物C溶液中按1：4加入氯仿-正丁醇溶液，混合搅拌20分钟，充分静止分层除去白色沉淀，重复数次后直至界面无白色沉淀。将经过除蛋白截留物C溶液的真空浓缩、冷冻干燥，得截留物C粉末。
将截留物C粉末溶解于蒸馏水中，加入处理好的ME-1树脂中，吸附过夜，装柱。分别以水、5％乙醇及15％乙醇洗脱，至洗脱液中不含糖，收集15％乙醇洗脱组分，收集冻干，得牡蛎多糖79.4g，平均分子量4.01×104Da，收率为51.3％。
将透过液A透析浓缩后，与沉淀物1一起冷冻干燥，得到牡蛎多肽粉。
实施例2
本实施例提供一种牡蛎多糖及其制备方法。具体步骤如下：
称取4Kg牡蛎肉(含糖原154.9g)洗净，加入12Kg的水，匀浆；调节匀浆液pH值至7.0，温度为37℃，加入80g枯草杆菌蛋白酶和80g的米曲霉蛋白酶酶解8小时，升温至80℃，保持5-10分钟后，降温至25℃。
将40g异淀粉酶加入到清液中，调整清液pH值至6.5，酶解温度为45℃，酶解反应3小时后煮沸10分钟，冷却至室温，离心，取清液。
用截留分子量为1×104Da-6×104Da的膜分离清液，得到截留物。
氯仿与正丁醇按4：1的体积混合后，置于棕色瓶中保存，在截留物溶液中按1：4加入氯仿-正丁醇溶液，混合搅拌20分钟，充分静止分层除去白色沉淀，重复数次后直至界面无白色沉淀。将经过除蛋白截留物溶液的真空浓缩、冷冻干燥，得截留物粉末。
将截留物粉末溶解于蒸馏水中，加入处理好的ME-1树脂中，吸附过夜，装柱。分别以水、5％乙醇及15％乙醇洗脱，至洗脱液中不含糖，收集15％乙醇洗脱组分，收集冻干，得牡蛎多糖79.4g，平均分子量4.01×104Da，收率为51.3％。
实施例3
本实施例提供一种肠内营养剂，其具体配方如下(每100g/400ml)：
牡蛎多肽2g、乳清蛋白15.8g、谷氨酰胺肽2g；麦芽糖糊精24.9g、水解玉米淀粉24.9g、低聚果糖1g、牡蛎多糖3g、膳食纤维8g；紫苏油4g、玉米油14.4g；
其中，膳食纤维为果胶1.5g、瓜尔豆胶1g、米糠半纤维素1.5g；大豆膳食纤维1.5g、小麦麸纤维1g、玉米纤维1.5g；
配方解析：能量分布：蛋白质：碳水化合物：脂肪＝16:50:34
热氮比：130:1
能量密度：1.23Kcal/ml
总热量：492Kcal
本实施例所使用的牡蛎多肽、牡蛎多糖来源于实施例1。
实施例4
本实施例提供一种肠内营养剂，其具体配方如下：
牡蛎多肽2g、乳清蛋白15.8g、谷氨酰胺肽2g；麦芽糖糊精24.9g、水解玉米淀粉24.9g、低聚果糖1g、牡蛎多糖3g、膳食纤维8g；紫苏油4g、玉米油14.4g；
其中，膳食纤维为果胶1.5g、瓜尔豆胶1g、米糠半纤维素1.5g；大豆膳食纤维1.5g、小麦麸纤维1g、玉米纤维1.5g；
钙260mg、镁90mg、铁2mg、钠350mg、钾500mg、锌1.5mg、铜220μg、锰100μg、锌2mg、磷150mg、氯200mg、碘30μg、硒25μg；
维生素A 190μg、维生素E 6.0mg、维生素D 3.5μg、维生素K1 21μg、维生素C 40mg、维生素B1 0.3mg、维生素B2 0.3mg、维生素B6 0.3mg、维生素B12 0.62μg、烟酸1.0mg、叶酸105μg、泛酸1.4mg、生物素10.5μg。
本实施例所使用的牡蛎多肽、牡蛎多糖来源于实施例1。
实施例5
本实施例提供一种肠内营养剂的制备方法：将实施例3的肠内营养剂按每100g原料400毫升水的比例混溶于水中，在60℃、14-21MPa条件下均质，得到乳液；将均质后的乳液于94℃灭菌24秒；将灭菌后的乳液在50-60℃、真空度为8-21KPa条件下进行真空浓缩至原体积的1/4；喷雾干燥，冷却，过30目筛，包装。
实施例6
本实施例提供一种肠内营养剂的制备方法：将实施例4的肠内营养剂按每100g原料400毫升水的比例混溶于水中，在60℃、14-21MPa条件下均质，得到乳液；将均质后的乳液于94℃灭菌24秒；将灭菌后的乳液在50-60℃、真空度为8-21KPa条件下进行真空浓缩至原体积的1/4；喷雾干燥，冷却，过30目筛，包装。
试验例1
本试验例提供实施例1中所述的牡蛎多肽的氨基酸组成分析。
牡蛎多肽氨基酸溶液：称取50mg牡蛎多肽在5mL浓度为6mol/L氢氧化钠溶液中，置于安剖瓶中，真空封存，110℃条件下水解24h，中和氢氧化钠，用0.1mol/L盐酸定容至25mL，4℃避光保存。采用柱前衍生反相液相色谱法测定氨基酸含量。
标准氨基酸混合溶液：分别称取18种标准氨基酸各25mg，溶于0.1mlo/L盐酸溶液中，定容至25mL，得1g/L氨基酸混合标准液，4℃避光保存。
衍生化试剂1：准确称取邻苯二甲醛0.1203g，加入无水乙醇2mL，3-巯基丙酸50μL，用0.2mol/L的硼酸缓冲液(pH10.8)定容至25mL,4℃避光保存。
衍生化试剂2：准确称取9-芴甲基氯甲酸酯，用乙腈定容至5mL。
分别取20μL标准氨基酸混合溶液与牡蛎多肽氨基酸溶液于2mLEppendorf管中，加入70μL衍生化试剂1和10μL衍生化试剂2，振荡反应2分钟，用0.22μm膜过滤后，进样分析，拟合氨基酸标准曲线，对牡蛎多肽氨基酸溶液进行定量分析。
色谱条件：色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18反相色谱柱，柱温35℃，DAD二极管阵列检测器；0-5分钟：检测波长338nm，流动相为20mmol/L醋酸钠缓冲溶液(pH10.3)：甲醇：乙腈＝98:1:1，流速为1mL/min；6-10分钟：检测波长338nm，流动相为20mmol/L醋酸钠缓冲溶液(pH10.3)：甲醇：乙腈＝92:4:4，流速为1mL/min；11-20分钟：检测波长338nm，流动相为20mmol/L醋酸钠缓冲溶液(pH10.3)：甲醇：乙腈＝80:10:10，流速为1mL/min；20-35分钟：检测波长338nm，流动相为20mmol/L醋酸钠缓冲溶液(pH10.3)：甲醇：乙腈＝80:10:10，流速为1mL/min；35-45分钟：检测波长262nm，流动相为20mmol/L醋酸钠缓冲溶液(pH10.3)：甲醇：乙腈＝70:20:10，流速为1mL/min。
表1牡蛎多肽中氨基酸组成成分
氨基酸 含量(g/100g牡蛎多肽) 氨基酸 含量(g/100g牡蛎多肽)
赖氨酸 11.29 酪氨酸 2.97
色氨酸 5.44 半胱氨酸 2.94
苯丙氨酸 3.68 丙氨酸 7.16
蛋氨酸 3.61 精氨酸 5.69
苏氨酸 4.09 天冬氨酸 9.11
异亮氨酸 5.06 丝氨酸 1.75
亮氨酸 9.86 谷氨酸 11.26
缬氨酸 4.61 甘氨酸 6.46
组氨酸 2.38 脯氨酸 1.98
注：疏水性氨基酸：酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸和蛋氨酸
由上表数据可知，牡蛎多肽中氨基酸组成合理，人体必需的8种氨基酸含量为47.64g/100g牡蛎多肽，非必需氨基酸含量为51.7g/100g牡蛎多肽。疏水性氨基酸含量为42.39g/100g牡蛎多肽。
试验例2
本试验例提供实施例1所提供的牡蛎多肽与牡蛎多糖的急性毒性实验。
1.试验方法
选取清洁级昆明种小鼠60只(雌雄各20只，体重20.7±0.8g)，随机分为3组，分别为试验1组、试验2组和对照组，每组20只，雌雄各半。试验1组小鼠分别在上午和下午灌胃实施例1所得的牡蛎多肽，灌胃剂量为200mg/0.8ml/只；试验2组小鼠分别在上午和下午灌胃实施例2所得的牡蛎多糖，灌胃剂量为200mg/0.8ml/只；对照组小鼠在相同的时间灌胃注射用水0.8ml/只。
灌胃后观察动物即刻反应(动物行为、活动、瞳孔、眼睑、分泌、呼吸、腹形、排便等)连续观察2小时。其后上述内容每天观察1-2次。试验开始后5、10和15天各称重一次，处理动物进行解剖观察，若有肉眼可见变化，则进行组织病理学检查。
2.实验结果
2.1动物喂食后急性毒性反应
试验2组动物官微后出现活动减少，药后20分钟内恢复正常。
2.2动物死亡情况
在15天的观察期内未见动物死亡。
2.3动物体重的变化
试验1组、试验2组和对照组小鼠体重迅速增长，试验后15天，小鼠体重分别增长至29.1±1.1g、33.9±1.4g、32.5±1.2g。试验1组和试验2组小鼠的体重较对照组相比有明显增加趋势。
表1小鼠灌胃后体重绝对值的变化
2.4动物解剖观察
试验后15天称重后处理动物进行大体解剖，脑、心、肝、脾、肺、胃、肾等主要脏器肉眼未见明显变化。
2.5MTD的计算
试验1组小鼠按200mg/只一天两次灌胃，小鼠灌胃前平均体重为20.6g，小鼠给药剂量为19.4g/Kg。此剂量按公斤体重计算，为拟用临床用量(2g/人/日)的679倍。
试验2组小鼠按200mg/只一天两次灌胃，小鼠灌胃前平均体重为20.5g，小鼠给药剂量为19.5g/Kg。此剂量按公斤体重计算，为拟用临床用量(2g/人/日)的683倍。
2.6结论
昆明种小鼠灌胃牡蛎多肽，MTD>19.4g/Kg；昆明种小鼠灌胃牡蛎多糖，MTD>19.5g/Kg。
昆明种小鼠分别灌胃牡蛎多肽和牡蛎多糖后，与对照组小鼠并无异常反应。
试验例3
本试验例提供实施例3所提供的肠内营养剂对小鼠免疫功能的影响。
1.动物实验
选取清洁级昆明种小鼠120只，6-8周龄，体重20±0.2g，雄性，进行以下6项实验：脏器/体重比值实验和碳廓清实验、迟发性变态反应(DTH)实验、血清溶血数实验和抗体生成细胞实验、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验、ConA诱导小鼠脾淋巴细胞转化实验、小鼠NK细胞活性实验，每项实验20只，分为2组，分别为空白对照组、实施例3组，每组10只。
每组剂量：实施例3组每只每天灌胃1.5g实施例3肠内营养剂，喂养30天；空白对照组每天喂养3-7g饲料，喂养30天。
2.指标测定
2.1脏器/体重比值实验和碳廓清实验
小鼠经喂养30天后，分别按照小鼠的体重从小鼠尾静脉注射稀释的印度墨汁(100ml/Kg)，注入墨汁后2分钟、10分钟，分别从内毗静脉丛取血20μL，并立即将其加到2mL0.1％碳酸钠溶液中。用分光光度计在600nm波长处测光密度值(OD)，以碳酸钠溶液作空白对照。分别用OD1和OD2表示2分钟、10分钟所取血样的光密度值。
将小鼠处死，取肝脏、脾脏和胸腺，用滤纸吸干脏器表面血污，分别称重。
以吞噬指数(a)表示小鼠碳廓清的能力，按下式计算。
K＝(lgOD1－lgOD2)/(t2－t1)
a＝体重×K1/3(肝重+脾重)
表2脏器/体重比值实验结果
备注：“*”表示P<0.05。
由上表结果可知，经灌胃小鼠30天实施例3肠内营养剂后，小鼠胸腺/体重比值和脾脏/体重比值均明显增加(P<0.05)，具有显著性差异，表明实施例3肠内营养剂能使小鼠脾脏、胸腺质量增加，促使其产生免疫细胞。
表3小鼠碳廓清实验结果
备注：“*”表示P<0.05。
由表3结果可知，经灌胃小鼠30天实施例3肠内营养剂后，通过碳廓清实验对小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能进行评价，吞噬指数增加，且具有显著性差异(P<0.05)，表明实施例3肠内营养剂后对小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能有明显的增强作用。
2.2迟发性变态反应(DTH)实验
小鼠经灌胃30天后，每鼠腹部皮肤用硫化钡脱毛，范围约3cm×3cm，用DNFB溶液50μL均匀涂抹致敏，5天后，用DNFB溶液10μL均匀涂抹于小鼠右耳(两面)进行攻击，攻击24小时后颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳壳，用打孔器取下直径8mm的耳片，称重，以左右耳之差为DTH的程度，用肿胀率表示。
肿胀率(％)＝[(右耳重-左耳重)/右耳重]×100％
表4小鼠迟发性变态反应(DTH)实验结果
备注：“*”表示P<0.05。
由表4结果可知，经灌胃小鼠30天实施例3肠内营养剂后，小鼠迟发性变态反应(DTH)实验结果显示，小鼠耳肿胀率显著高于空白对照组(P<0.05)，实验结果为阳性。
2.3血清溶血素实验和抗体生成细胞实验
小鼠经灌胃30天后，每鼠腹腔注射2％(v/v)SRBC的细胞悬液0.2ml进行免疫，5天后，取小鼠血及脾脏分别做半数溶血值(HC50)的测定及抗体生成细胞检测。
半数溶血值(HC50)的测定
小鼠经灌胃30天后，每鼠腹腔注射2％(v/v)SRBC的细胞悬液0.2ml进行免疫，5天后，摘除眼球取血，放置1小时，使血清析出，2000转/min离心10分钟，收集血清。用生理盐水稀释血清(300倍)，将稀释后的血清1ml置试管内，依次加入10％(v/v)SRBC的细胞悬液0.5ml，补体1ml(用生理盐水按1:10稀释)，另设不加血清的对照管(以生理盐水代替)，置37℃恒温水浴中保温15～30分钟后，冰浴终止反应。2000转/min离心，取上清液1ml，加都氏试剂，同时取10％(v/v)SRBC的细胞悬液0.25ml加都氏试剂至4ml，充分混匀，放置10分钟后，于540nm处以对照管做空白，分别测定各管光密度值。
半数溶血值(HC50)＝(样品光密度/SRBC半数溶血时的光密度值)×稀释倍数
抗体生成细胞检测
取上述SRBC免疫5天的小鼠脾脏，放在盛有Hank’s液的小平皿内，轻轻磨碎脾脏，制成细胞悬液，经200目筛网过滤，1000转/min离心10分钟，用Hank’s液洗两次，最后将细胞悬浮在5mLRPMI1640培养液中，计数细胞，并将细胞浓度调整为5×106个/mL。将表层培养基(1g琼脂糖加双蒸水至100mL)加热溶解后，放45～50℃水浴保温，与等量pH7.2～7.4、2倍浓度的Hank’s液混合，分装小试管，每管0.5mL，再向管内加50μL10％SRBC(v/v，用SA缓冲液配制)，20μL脾细胞悬液(5×106个/mL)，迅速混匀，倾倒于已刷琼脂糖薄层的玻片上，做平行片，待琼脂凝固后，将玻片水平扣放在片架上，放入二氧化碳培养箱中孵育1～1.5小时，然后用SA缓冲液的补片(1:8)加入到玻片架凹槽内，继续温育1～1.5小时后，计数溶血空斑数。
表5小鼠血清溶血数实验和抗体生成细胞实验结果
备注：“*”表示P<0.05。
由表5结果可知，经喂食小鼠30天实施例3肠内营养剂后，半数溶血值(HC50)、溶血空斑数/106脾细胞结果显著高于空白对照组(P<0.05)，实验结果为阳性。
2.4小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验
小鼠经灌胃30天后，每只小鼠腹腔注射2％鸡红细胞悬液1mL，30分钟后，颈椎脱臼法处死小鼠，仰位固定于蜡板上，正中剪开腹壁皮肤，经腹腔注入生理盐水2mL，转动鼠板1分钟，吸出腹腔洗液1mL，平均滴于2片载玻片上，放入垫有湿纱布的搪瓷盒内，37℃孵育30分钟，然后在生理盐水中漂洗，除去未贴片细胞。晾干，以1:1(v/v)丙酮甲醇溶液固定20分钟，4％(v/v)Giemsa-磷酸缓冲溶液染色15分钟，用蒸馏水冲洗干净，晾干，用40×显微镜计数巨噬细胞。
吞噬率(％)＝(吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/计数的巨噬细胞)×100
吞噬指数＝被吞噬的鸡红细胞数/计数的巨噬细胞
表6小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验结果
备注：“*”表示P<0.05。
由表6结果可知，经喂食小鼠30天实施例3肠内营养剂后，吞噬率和吞噬指数结果显著高于空白对照组(P<0.05)，实验结果为阳性。
2.5ConA诱导小鼠脾淋巴细胞转化实验
小鼠经灌胃30天后，颈椎脱臼法处死，无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank’s液平皿中，用镊子轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤，用Hank’s液洗2次，每次按1000转/min离心10分钟，然后将细胞悬浮于1mL的完全培养液中，用台酚蓝染色计数活细胞数(应在95％以上)，调整细胞浓度为3×106个/mL。
将每份脾细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1mL，一孔加75μLConA液(相当于7.5μg/mL)，另一孔作为对照，置37℃、5％二氧化碳培养箱中培养72小时，培养结束前4小时，每孔轻轻吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT(5mg/mL)50μL/孔，继续培养4小时。培养结束后，每孔加入1mL酸性异丙醇，吹打均匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每个孔作3个平行孔，用酶标仪以570nm波长测定光密度值(OD值)。用加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值表示淋巴细胞的增殖能力。
表7ConA诱导小鼠脾淋巴细胞转化实验结果
备注：“*”表示P<0.05。
由表7结果可知，经喂食小鼠30天实施例3肠内营养剂后，ConA诱导淋巴细胞增殖(OD差值)结果显著高于空白对照组(P<0.05)，实验结果为阳性。
2.6小鼠NK细胞活性实验
小鼠经灌胃30天后，颈椎脱臼法处死，无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank’s液平皿中，用镊子轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤，用Hank’s液洗2次，每次按1000转/min离心10分钟。弃上清将细胞浆弹起，加入0.5mL灭菌水20秒，裂解红细胞后再加入0.5mL2倍Hank’s液及8mLHank’s液，1000转/min离心10分钟，用1mL含10％小牛血清的RPMI1640完全培养液重悬，用1％冰醋酸稀释后计数(活细胞数应在95％以上)，用台酚蓝染色计数活细胞数(应在95％以上)，最后用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为2×107个/mL。
取靶细胞和效应细胞各100μL(效靶比50:1)，加入U型96孔培养板中，靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μL，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1％NP40各100μL，上述各项均设三个平行孔，于37℃，5％二氧化碳培养箱中培养4小时，然后将96孔培养板以1500转/min离心5分钟，每孔吸取上清100μL置96孔培养板中，同时加入LDH基质液100μL，反应3分钟，每孔加入130μL的1mol/L的HCl，在酶标仪490nm处测定光密度值(OD)。
按下式计算NK细胞活性：
NK细胞活性(％)＝[(反映孔OD值－自然释放孔OD值)/(最大释放孔OD值－自然释放孔OD值)]×100％
表8小鼠NK细胞活性实验结果
备注：“*”表示P<0.05。
由表8结果可知，经喂食小鼠30天实施例3肠内营养剂后，小鼠NK细胞活性(％)结果显著高于空白对照组(P<0.05)，实验结果为阳性。
根据保健食品功能学检验方法中有关增强免疫力功能判定规定，在细胞免疫功能、体液免疫功能、单一巨噬细胞功能、NK细胞活性四个方面任两方面结果为阳性，可判定受试样品具有增强免疫力功能作用。根据2.1至2.6的各项指标测定及结果显示，经喂食小鼠30天实施例3肠内营养剂后，所得各项结果均为阳性，因此，本发明方法所得肠内营养剂具有显著增强小鼠免疫功能。
试验例4
本试验例提供实施例3所提供的肠内营养剂对肿瘤病人的影响。
选取5名营养不良型肿瘤患者，年龄在40-55岁，对所选病人进行为期3天调查，详细记录患者的进食情况，性别、年龄、体重等，以此全面了解患者的身体状况，正确评估BMI(体质指数)，然后由营养学家计算出患者每天的营养摄入量，在正常摄食时间给予本发明肠内营养剂，摄入量为25～35kcal/(kg·d)，食用时间为30天，开始食用后每10天记录一次患者的BMI、白细胞、红细胞、血红蛋白、血小板总数、白蛋白、前白蛋白、总蛋白，结果用统计学方法处理。
表9肠内营养剂对肿瘤病人的影响
由表9结果可知，经过30天的肠内营养剂的摄入，此5名营养不良型肿瘤患者血象生化指标趋向正常，BMI指数也趋向正常，说明本发明肠内营养剂能够为肿瘤患者提供营养支持。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种肠内营养剂，其特征在于，包括：蛋白质和碳水化合物；
所述蛋白质至少包括牡蛎多肽；所述碳水化合物至少包括牡蛎多糖；所述牡蛎多肽和牡蛎多糖的重量比为(1-3)：(1-5)。
2.根据权利要求1所述的肠内营养剂，其特征在于，所述蛋白质还包括选自乳清蛋白、花生蛋白、大豆蛋白、大米蛋白、小麦蛋白、玉米蛋白、谷氨酰胺肽中的一种或几种；
所述碳水化合物还包括选自麦芽糖糊精、食用淀粉、膳食纤维、低聚果糖、β-葡聚糖中的一种或几种；
优选地，所述蛋白质和所述碳水化合物的用量比为(1-3)：(2-8)。
3.根据权利要求1或2所述的肠内营养剂，其特征在于，所述蛋白质包括牡蛎多肽、谷氨酰胺肽，和乳清蛋白、花生蛋白、大豆蛋白、大米胚乳蛋白、小麦蛋白、玉米蛋白中的至少一种；优选地，所述牡蛎多肽、谷氨酰胺肽，和乳清蛋白、花生蛋白、大豆蛋白、大米胚乳蛋白、小麦蛋白、玉米蛋白中的至少一种的用量比为(1-3)：(2-4)：(4-24)。
4.根据权利要求2或3所述的肠内营养剂，其特征在于，所述碳水化合物包括所述牡蛎多糖、膳食纤维，所述麦芽糖糊精、水解玉米淀粉中的至少一种，和低聚果糖、低聚异麦芽糖、低聚甘露糖、β-葡聚糖中的至少一种；优选地，所述牡蛎多糖，所述麦芽糖糊精、水解玉米淀粉中的至少一种，和低聚果糖、低聚异麦芽糖、低聚甘露糖、β-葡聚糖中的至少一种的用量比为(1-5)：(20-60)：(0.5-2)；更优选的比例为(3-5)：(20-60)：(0.5-2)；
优选地，
所述膳食纤维的用量与所述牡蛎多糖的比例为(1-3)：(1-5)；所述膳食纤维包括：可溶性膳食纤维和不溶性膳食纤维；更优选地，可溶性膳食纤维与不溶性膳食纤维的比例为1:(0.1-2)；更进一步优选地，可溶性膳食纤维与不溶性膳食纤维的比例为1:(0.8-1.2)。
5.根据权利要求1-4任一项所述的肠内营养剂，其特征在于，所述肠内营养剂中还包括脂肪；所述脂肪与所述蛋白质和碳水化合物总重的重量比为(1-2)：(3-12)；
所述脂肪选自玉米油、亚麻油、紫苏油、火麻油、橄榄油中的一种或几种。
6.根据权利要求1-5任一项所述的肠内营养剂，其特征在于，按重量份计，包括：
牡蛎多肽1-3份、乳清蛋白10-24份、谷氨酰胺肽2-3份；麦芽糖糊精20-35份、水解玉米淀粉20-35份、低聚果糖1-2份、牡蛎多糖3-5份、膳食纤维5-10份；紫苏油1-10份、玉米油1-15份；
其中，膳食纤维为果胶1.5-3份、瓜尔豆胶1-2份、米糠半纤维素1.5-2份；大豆膳食纤维1-1.5份、小麦麸纤维1-2份、玉米纤维1.5-2.5份。
7.根据权利要求1-6任一项所述的肠内营养剂，其特征在于，所述肠内营养剂还包括微量元素和维生素中的至少一种；
所述微量元素包括：钙、镁、铁、钠、钾、锌、铜、锰、锌、磷、氯、碘、硒中的至少一种；优选地，每100g或400ml的所述肠内营养剂添加钙260-280mg、镁90-100mg、铁2-3mg、钠350-400mg、钾500-560mg、锌1.5-2.0mg、铜200-300μg、锰100-200μg、锌1-3mg、磷150-200mg、氯200-300mg、碘30-40μg、硒16-50μg；
和/或，
所述维生素包括：维生素A、维生素E、维生素D、维生素K1、维生素C、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、烟酸、叶酸、泛酸、生物素中的至少一种；优选地，每100g或400ml的所述肠内营养剂添加维生素A 190-210μg、维生素E 4.0-8.0mg、维生素D 3.5-4.0μg、维生素K1 21-25μg、维生素C 36-45mg、维生素B1 0.3-0.4mg、维生素B2 0.3-0.4mg、维生素B60.3-0.4mg、维生素B12 0.62-0.65μg、烟酸1.0-1.2mg、叶酸105-110μg、泛酸1.4-1.6mg、生物素10.5-11μg。
8.根据权利要求1-7任一项所述的肠内营养剂，其特征在于，所述牡蛎多肽和牡蛎多糖以如下制备方法同时获得：
将牡蛎肉匀浆后以枯草杆菌蛋白酶和米曲霉蛋白酶酶解，离心得到清液1和沉淀物1；
将所述清液1经1000-1500Da的膜截留得到透过液A和截留物B；所述截留物B以异淀粉酶酶解，得到清液2；
将所述清液2经1×104Da-6×104Da的膜截留得到截留物C，所述截留物C经纯化后得到牡蛎多糖；
将所述透过液A和所述沉淀物1经冷冻干燥，即得牡蛎多肽；
优选地，所述枯草杆菌蛋白酶的用量为牡蛎肉重量的1％-5％，所述米曲霉蛋白酶的用量为牡蛎肉重量的1％-5％；
和/或，所述异淀粉酶的用量为牡蛎肉重量的0.5％-2％，调整清液pH值至6.5-7.0，酶解温度为30-50℃，酶解反应结束后煮沸后冷却。
9.根据权利要求1-8任一项所述的肠内营养剂，其特征在于，
牡蛎多肽1-3份、乳清蛋白14-16份、谷氨酰胺肽2-3份；麦芽糖糊精22-28份、水解玉米淀粉22-28份、低聚果糖1-2份、牡蛎多糖3-5份、膳食纤维8-10份；紫苏油4-5份、玉米油10-15份；
其中，膳食纤维为果胶1.5-2份、瓜尔豆胶1-2份、米糠半纤维素1.5-2份；大豆膳食纤维1-1.5份、小麦麸纤维1-2份、玉米纤维1.5-2份。
10.一种制备权利要求1-9任一项所述的肠内营养剂的方法，其特征在于，将全部原料按照每100g原料400毫升水的比例在50-60℃、14-21MPa条件下均质，得到乳液，经过灭菌后，于50-60℃、真空度为8-21KPa条件下进行真空浓缩至原体积的20-30％，经喷雾干燥即得。
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