CN107319400A - 牡蛎中生物活性成分集成提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了牡蛎中生物活性成分集成提取方法，它属于生物科技领域。提取方法为：将牡蛎取肉绞碎、匀浆，加纯化水和复合蛋白酶，灭酶得酶解液，酶解液过陶瓷膜得澄清液体，澄清液体过截有机膜，用纯化水多次稀释截留液再过有机膜，合并透过液，合并截留液备用，将合并的透过液入反应釜内，加β‑环糊精1‑5%，搅拌包埋得到包埋液；包埋液脱腥、脱色，得澄清精制液，浓缩后得浓缩液，浓缩液经喷雾干燥或冷冻干燥得牡蛎低聚肽粉；截留液中加入乙醇，下层沉淀；沉淀经乙醇、无水乙醇脱水后，真空干燥得牡蛎多糖。一次投料得到牡蛎中主要活性成分牡蛎低聚肽和牡蛎多糖，使牡蛎资源得到充分利用；产品经包埋和吸附多重处理，没有腥味苦味，口感好。

Description

牡蛎中生物活性成分集成提取方法

技术领域：

本发明涉及牡蛎中生物活性成分集成提取方法，属于生物科技领域。

背景技术：

牡蛎（Concha Ostreae），又称生蚝、海蛎子等，属于牡蛎科（Ostreidae 真牡蛎）或燕蛤科（Aviculidae 珍珠牡蛎）双壳类软体动物，分布于温带和热带各大洋沿岸水域，我国沿海地区均有生长，目前已发现牡蛎有100多种，我国沿海所产牡蛎约20多种，作为主要的养殖种类有近江牡蛎、褶皱牡蛎、长牡蛎、大连湾牡蛎和密鳞牡蛎等（高蒙蒙等，2014；叶盛权等，2009）。

《本草纲目》记载，牡蛎肉多食之，能细活皮肤，补肾壮阳，并能治

虚损，解丹毒。中医认为牡蛎肉具有很好的滋阴和补血功效，适用于虚劳、虚损和阴虚、血亏和气血不足的病患。

牡蛎肉质乳白、细嫩、营养丰富，富含蛋白质、多糖、维生素和微

量元素等，是人体生长和代谢活动所必需的，被认为是人类最接近理想的食品，在古代就已被认为“海族中之最贵者”。（叶盛权等，2009）

现代科学研究发现，每100g牡蛎肉含能量57千卡、蛋白质10.

脂肪1.5g、钾375mg、钠270mg、钙35mg、镁10mg、铁5.5mg、铜11.5mg、磷100mg，以及维生素A、B₁、B₂和其他微生物，其含碘量比牛奶和蛋白高出200倍，其锌含量为其他食物之冠，还有较多的牛磺酸。牡蛎干品含蛋白质50%左右，含多糖20%以上，最高可达40%。（叶盛权等，2009；高蒙蒙等，2014）

叶盛权等（2009）研究牡蛎蛋白质和水分含量分别为9.46%和81.42%,酶解后蛋白质和水分含量分别为7.36%和83.18%，酶解液浓缩后，蛋白质含量高达52.55%，活性炭脱腥效果最优，用量为0.5%，在pH7.0,30℃条件下吸附0.5h，酶解液基本无腥味。

郭玉华等（2008）研究，菠萝蛋白酶比较适合牡蛎蛋白质酶解，条件为pH6.0，温度55℃，料液比为1:3，加酶量为800u/g，酶解时间4h，在此条件下酶解产物水解度为29.86%，蛋白回收率为67.5%，加热处理、超声波和微波处理均不利于牡蛎蛋白的水解。

田振华等（2013）用正交试验提取牡蛎多糖的方法，对多糖提取温

度、pH值、时间、次数、料液比进行了研究，得出提取牡蛎多糖的

最佳条件为pH8.0，温度为65℃，时间4h，次数为3次，料液比为1:15（g/ml）。

黄传贵等（2009）研究采用醇沉法分离牡蛎多糖，凝胶层析法纯

化牡蛎多糖，牡蛎粗提物的多糖含量为36.7%，醇沉法多糖得率为33%，回收率为78%。

张艳军等（2012）根据Lq(3⁴)正交实验对牡蛎多糖提取条件进行

了优化，确定水提多糖的参数为pH6.0、提取时间5h、提取次数为3次、水溶温度为75℃，该条件下多糖得率为2.56%。

高蒙蒙等（2014）将牡蛎鲜肉制成丙酮粉，依次室温水、60℃热

水和稀碱提取牡蛎多糖，对其总糖含量、蛋白质含量和单糖组成进行分析。结果温水提取多糖收率最高达16.1%，而碱液提取蛋白质收率最高达47.7%。从牡蛎肉中提取得到了3种牡蛎粗多糖，单糖组成都只有葡萄糖。

王俊等（2006）用改进工艺分离、纯化东海近江牡蛎得牡蛎粗多

糖，并经动物实验证实牡蛎多糖能增强小鼠细胞免疫，体液免疫功能，并有一定的抗肿瘤和抗氧化作用。

付猛等（2004）研究了双酶水解牡蛎蛋白的工艺条件，分析了酶用

量、pH、温度、双酶比例、反映时间等因素对牡蛎蛋白水解的影响，通过正交试验，确定最佳水解条件为：温度45℃，pH7.5，酶用量5000u/g，双酶活力比（F:D）3:1，时间2h，底物浓度为3%，在此条件下，水解度达28.68%，酶溶肽得率达79.89%。

对上述研究进行仔细分析对比后发现有如下不足

（1）只对牡蛎中一种活性成分蛋白质或多糖进行研究，而另一种成

分就被废弃而浪费，使牡蛎资源没有得到充分利用；

（2）牡蛎中的蛋白质和多糖通常以糖肽键结合在一起。只是将牡蛎

匀浆后温水提取多糖，将影响多糖收率，而且也影响多糖的提取纯度；

（3）对牡蛎蛋白酶解用酶没有系统筛选，因此上述文献中所用蛋白酶不是牡蛎蛋白酶解最佳用酶，因此会影响牡蛎蛋白的酶解收率。

（4）没有对牡蛎蛋白酶解产物分子量进行测定，因此其酶解产物的消化吸收率无法评估。

发明内容：

针对上述问题，本发明要解决的技术问题是提供牡蛎中生物活性成分集成提取方法。

本发明的牡蛎中生物活性成分集成提取方法为：步骤一、将牡蛎

取肉，洗净泥沙、绞碎、匀浆，按1:1-1:5加纯化水搅拌均匀；将料液加热至40-60℃；调料液pH2.0-6.0；加复合蛋白酶，加量为1.0-5.0%（蛋白质总量），搅拌酶解3.5-6.5h；调整酶解液pH5.0-7.0；将料液升温至70-90℃，10-30min灭酶；料液经管式离心机去除油脂和固体微粒，得酶解液；

步骤二、酶解液过陶瓷膜得澄清液体，澄清液体过截留分子量2000Da-4000Da的有机膜，透过液为牡蛎蛋白低聚肽，截留液为牡蛎多糖溶液，用适量纯化水多次稀释截留液再过有机膜，至透过液固含量＜0.1%，合并透过液，合并截留液备用，将合并的透过液入反应釜内，加热至40-70℃，加β-环糊精1-5%，搅拌包埋10-30min得到包埋液；

步骤三、将步骤二得到的包埋液通过颗粒活性炭柱进一步脱腥、脱色，其中所述的过柱液通过陶瓷膜脱碳粒，得澄清精制液，澄清精制液经浓缩后得浓缩液，固含量25-55%；

步骤四、将步骤三制备的浓缩液经喷雾干燥或冷冻干燥得牡蛎低聚

肽粉；将步骤二中合并备用的截留液中加入适量95%乙醇，使牡蛎多糖沉淀下来；经静置过夜后，倾去上层乙醇清液，收集下层沉淀；

沉淀经95%乙醇、无水乙醇脱水后，真空干燥得牡蛎多糖。

本发明的有益效果：（1）一次投料得到牡蛎中主要活性成分牡蛎低

聚肽和牡蛎多糖，使牡蛎资源得到充分利用；

（2）通过单酶筛选，复配后验证，获得酶解牡蛎蛋白的最好复合

蛋白酶；

（3）通过酶解，打断了牡蛎蛋白与多糖的结合键，使牡蛎低聚肽

和牡蛎多糖的收率均有大幅度的提高；

（4）产品中分子量＜4000Da部分占总蛋白的比例超过90%，极易被肠道吸收；

（5）产品经包埋和吸附多重处理，没有腥味和苦味，口感好。

附图说明

图1为本发明的结构示意图。

具体实施方式：

本具体实施方式采用以下实施例对发明进行进一步的详细说明。

实施例

实施例研究用牡蛎是从大连市普兰店区皮口镇农贸市场购得。

步骤一、取肉，洗净泥沙，匀浆后测定蛋白质含量9.81%，水分81.13%，多糖含量5.28%；取牡蛎肉，用绞肉机绞碎；取牡蛎肉糜25kg，按1:2加纯化水搅匀；将料液加热至42±1℃；用料液调节料液pH3.2±0.1；加复合蛋白酶2.6%（蛋白质总量），搅拌酶解5.0h；

调酶解液pH6.0； 将酶解液升温至75±1℃，15min灭酶；灭酶液通过管式离心机离心去除油脂和固相微粒得酶解液；

步骤二、经离心的酶解液通过孔径100nm陶瓷膜过滤得澄清液体；清液通过截留分子量3000Da的有机膜过滤，透过液为牡蛎蛋白低聚肽液，截留液为牡蛎多糖液，每次加5L左右纯化水稀释截留液，继续过滤，重复数次，至透过液固含量＜0.1%为止，合并透过液；合并截留液备用，将透过液入反应釜内，加热至55~60℃，加β-环糊精2.0%（蛋白质总量），搅拌包埋20min；

步骤三、将包埋液过颗粒活性碳柱；过柱液通过孔径100nm陶瓷膜脱碳，得清液；清液蒸发浓缩，得固含量30~50%浓缩液；

步骤四、浓缩液经喷雾干燥（或冷冻干燥）得牡蛎低聚肽粉2.156kg，得率为87.9%，分子量＜1000Da占总蛋白的比例为93.61%；在步骤二中备用的截留液中加入3倍95%乙醇，搅拌均匀，静置过夜；倾去上层乙醇清液，收集下层沉淀；分别用95%乙醇和无水乙醇脱水3-4次；真空干燥得牡蛎多糖粉2.7kg，多糖含量42.3%，得率为86.36%。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (1)

1.牡蛎中生物活性成分集成提取方法，其特征在于：具体的提

取方法为：步骤一、将牡蛎取肉，洗净泥沙、绞碎、匀浆，按1:1-1:5加纯化水搅拌均匀；将料液加热至40-60℃；调料液pH2.0-6.0；加复合蛋白酶，加量为1.0-5.0%（蛋白质总量），搅拌酶解3.5-6.5h；调整酶解液pH5.0-7.0；将料液升温至70-90℃，10-30min灭酶；料液经管式离心机去除油脂和固体微粒，得酶解液；

步骤二、酶解液过陶瓷膜得澄清液体，澄清液体过截留分子量2000Da-4000Da的有机膜，透过液为牡蛎蛋白低聚肽，截留液为牡蛎多糖溶液，用适量纯化水多次稀释截留液再过有机膜，至透过液固含量＜0.1%，合并透过液，合并截留液备用，将合并的透过液入反应釜内，加热至40-70℃，加β-环糊精1-5%，搅拌包埋10-30min得到包埋液；

步骤三、将步骤二得到的包埋液通过颗粒活性炭柱进一步脱腥、脱色，其中所述的过柱液通过陶瓷膜脱碳粒，得澄清精制液，澄清精制液经浓缩后得浓缩液，固含量25-55%；

步骤四、将步骤三制备的浓缩液经喷雾干燥或冷冻干燥得牡蛎低聚

肽粉；将步骤二中合并备用的截留液中加入适量95%乙醇，使牡蛎多糖沉淀下来；经静置过夜后，倾去上层乙醇清液，收集下层沉淀；

沉淀经95%乙醇、无水乙醇脱水后，真空干燥得牡蛎多糖。