CN114917208A - 一种白酒在制备改善肠屏障功能及肠道菌群药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种白酒在制备改善肠屏障功能及肠道菌群药物中的应用,属于医药保健技术领域。本发明通过评测52%vol舍得酒对大鼠肠屏障功能及肠道菌群的影响,发现适量饮用52%vol舍得酒对肠屏障具有一定程度的保护作用,而且可以缓解炎症及调节肠道菌群,为适量饮用52%vol舍得酒对人体的益处提供参考。
Description
技术领域
本发明属于医药保健技术领域,尤其涉及一种白酒在制备改善肠屏障功能及肠道菌群药物中的应用。
背景技术
酒精对健康的影响日益受到人们的关注,已经成为全球第七大导致早死及致残因素,过度饮酒会导致酒精性脂肪肝,肝硬化等疾病的风险。研究发现长期酒精摄入导致肠道通透性增加,肠源性内毒素大量进入肝脏,激活库普弗细胞,促进各种促炎因子、细胞黏附分子及自由基的大量释放导致肝脏炎症。
饮酒成为人们日常生活的一部分,但白酒成分复杂,与人体健康的关系尚不明确,如何科学饮酒值得深入探讨。实验研究表明,适量饮酒能增加高密度脂蛋白活性,降低动脉粥样硬化和糖尿病等疾病的风险,还能提高胰岛素的敏感性,降低普通人群糖尿病的发病率。Yi(2014年)等研究了茅台酒对二乙基亚硝胺引起的小鼠肝癌的影响,结果发现长期适量饮用茅台酒不引起明显的肝功能障碍,对二乙基亚硝胺引起的小鼠肝癌有改善作用。肠道菌群对机体有着重要的生理作用,与肥胖、糖尿病、肝硬化等疾病都有密切联系。还有研究表明肠道菌群失衡能引发肝炎、肝纤维化进而促进肝癌的发生。
鲁蕾等(2014年)研究发现,长期过量饮用酒精会导致肠道益生菌减少,饮用不同品质白酒对大鼠肠道菌群的影响存在差异,高品质白酒对机体肠道菌群影响更小,更利于维护肠道微生态平衡。目前很多研究表明,长期大量的饮酒所致的酒精性肝病(Alcoholicliver disease,ALD)的发生、发展都与肠-肝轴有着密切关系。屏障功能障碍会导致肠黏膜通透性增加,从而导致细菌移位、大量内毒素进入门静脉系统,激活肝脏库普弗细胞,进而释放一系列炎症因子加剧促炎症状态,造成肝脏免疫损伤及炎症反应。
近年来,白酒对肠屏障功能损伤和肠道菌群的影响越来越受到人们的广泛关注,而作为中国高端名酒舍得酒鲜有报道。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种白酒在制备改善肠屏障功能及肠道菌群药物中的应用的应用,52%vol舍得酒能够保护肠屏障功能,并可通过增加肠道菌群丰度及多样性、抑制部分肠道致病菌的生长及增加有益菌,从而起到一定的调节肠道菌群的作用。
为了实现上述发明目的,本发明提供了以下技术方案:
一种白酒在制备改善肠屏障功能及肠道菌群药物中的应用的应用,所述白酒为52%vol舍得酒。
优选的是,所述白酒摄入量为:每天男性0.62ml/kg-1.24ml/kg,女性0.36ml/kg-0.72ml/kg。
优选的是,所述改善肠屏障功能包括提高结肠组织中ZO-1及Occludin的mRNA的表达水平。
优选的是,所述改善肠屏障功能包括降低血清TNF-α浓度,提升IL-10浓度。
优选的是,所述改善肠道菌群包括提升肠道菌群ACE指数和Shannon指数。
优选的是,所述改善肠道菌群包括提升厚壁菌门(Firmicutes)与拟杆菌门(Bacteroides)比值。
优选的是,所述改善肠道菌群包括提升肠道乳酸杆菌属(Lactobacillus)丰度。
相对于现有技术,本发明具有如下有益效果:
本发明提供了一种白酒在制备改善肠屏障功能及肠道菌群药物中的应用的应用,通过评52%vol舍得酒对大鼠肠屏障功能及肠道菌群的影响,发现适量饮用52%vol舍得酒对肠屏障具有一定程度的保护作用,而且可以缓解炎症及调节肠道菌群,为适量饮用52%vol舍得酒对人体的益处提供参考。
附图说明
图1:52%vol舍得酒对大鼠结肠组织紧密连接蛋白mRNA表达水平的影响;
图2:52%vol舍得酒对大鼠血清炎症相关分子的影响;
图3:52%vol舍得酒对大鼠脾脏免疫细胞亚群的影响;
图4:52%vol舍得酒对大鼠肠道菌群影响多样性的影响。
具体实施方式
本发明提供了一种白酒在制备改善肠屏障功能及肠道菌群药物中的应用的应用,所述白酒为52%vol舍得酒。本发明52%vol舍得酒来源于舍得酒业股份有限公司,符合GB/T 21820-2008的地理标志产品舍得白酒。
本发明优选所述52%vol舍得酒摄入量为:每天男性0.62ml/kg-1.24ml/kg,女性0.36ml/kg-0.72ml/kg;进一步优选每天男性0.93ml/kg,女性0.54ml/kg。
本发明优选所述改善肠屏障功能包括提高结肠组织中ZO-1及Occludin的mRNA的表达水平,降低血清TNF-α浓度,提升IL-10浓度。
本发明优选所述改善肠道菌群包括提升肠道菌群ACE指数和Shannon指数,提升厚壁菌门(Firmicutes)与拟杆菌门(Bacteroides)比值(F/B),提升肠道乳酸杆菌属(Lactobacillus)丰度。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1材料与方法
1.1材料
1.1.1实验动物28只健康SPF级雄性SD大鼠(180-220g)购于大连医科大学动物实验中心(SCXK[辽]2018-0002)。
1.1.2实验试剂与药物52%vol舍得酒,来源舍得酒业;CD3-FITC、CD45R-PE、CD4-PE-Cy5、CD8-APC购于美国BD公司;白介素10(IL-10)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)ELISA试剂盒购于江苏酶标生物技术科技有限公司;TRIzol购于美国Bio-Rad;反转录试剂盒及qPCR试剂盒购于TransGen;小鼠粪便提取试剂盒Stool DNA Kit.购于美国Omega公司。
1.2方法
1.2.1动物处理方法28只SPF级180-220g SD雄性大鼠随机分为4组,包括对照组、乙醇(52%)组、舍得酒1组、舍得酒2组,每组7只。对照组灌胃生理盐水;乙醇组灌胃酒精,剂量采用7.6ml/kg;舍得酒1和2组分别采用3.8ml/kg和7.6ml/kg两个剂量。每只大鼠每天灌胃一次,连续灌胃4周。
1.2.2紧密连接蛋白mRNA水平检测解剖大鼠,取结肠组织用TRIzol提取RNA,反转录cDNA后采用荧光定量PCR方法检测紧密连接蛋白ZO-1和OccludinmRNA表达水平。其中引物序列见表1。PCR反应体系总体积为20μL,内含2μL cDNA,10μL PCR 2×PCR MasterMix,0.5μL上下游引物及7μL去离子水。反应条件:94℃变性3min;94℃变性45s,59℃45s,72℃60s,40个循环;72℃延伸7min。
表1引物序列
1.2.3血清中炎症相关分子的检测取各组大鼠的心脏血,离心分离上清,采用ELISA法检测血清中TNF-α和IL-10的浓度,操作严格按照ELISA试剂盒说明书进行。
1.2.4流式细胞术检测取脾脏组织研磨分离淋巴细胞,收集细胞,4℃孵育CD3-FITC、CD45R-PE、CD4-PE-Cy5、CD8-APC抗体60min进行细胞表面蛋白的染色。经PBS洗涤后,在流式细胞仪上分别检测CD3、CD45R、CD4、CD8细胞在淋巴细胞中的比例。
1.2.5肠道菌群检测取各组大鼠粪便于无菌Eppendor管中,按照Stool DNAkit操作说明书进行DNA提取,将提取DNA样本用超微量分光光度计检测浓度(ng/μl)和纯度(A260/A280),-80℃保存备用。由北京诺禾致源生物信息科技有限公司应用Illuminate Hiseq PE25016SrDNA测序分析技术对各组大鼠肠道菌群进行生物分类学上的比较分析。应用有效数据进行OTUs(Operational Taxonomic Units)聚类及相关分析。菌群多样性采用ACE和Shannon指数评价。
1.2.6统计学方法数据分析采用GraphPadPrism Program(Version 7.04)软件,计量资料用均数±标准误(x±SEM)表示,应用单因素方差分析对多组独立样本进行比较。以p<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1紧密连接蛋白mRNA表达水平RT-PCR结果如图1所示,乙醇组结肠组织中ZO-1及Occludin的mRNA水平明显低于其余三组,低1组ZO-1的mRNA水平与正常组无明显变化,低2组ZO-1的mRNA水平明显高于其余三组(低2组VS对照组,p=0.0108;低2组VS乙醇组,p<0.0001;低2组VS低1组,p=0.0196);而低1组的Occludin的mRNA水平与明显高于其余三组(低1组VS对照组,p<0.0001;低1组VS乙醇组,p<0.0001;低2组VS低1组,p=0.0021)。提示52%vol舍得酒低剂量1和2都具有提高肠屏障紧密连接蛋白表达的作用。
2.2血清炎症相关分子水平如图2所示,低1组血清TNF-α水平显著低于乙醇组(p=0.0084)。低1和2组IL-10水平均显著高于乙醇组(低1组VS乙醇组,p<0.0001;低2组VS乙醇组,p=0.014)。提示52%vol舍得酒低剂量1和2都具有肠屏障保护作用。
2.352%vol舍得酒对大鼠脾脏免疫细胞影响CD3标记T细胞,CD45R标记B细胞。如图3所示,乙醇组较对照组T细胞比例显著增加(p=0.0003,图3B),主要表现为CD4+T细胞比例增加(p=0.0045,图3D),而B细胞比例显著减少(p=0.02,图3C)。低2组较乙醇组T细胞比例显著减少(p<0.0001,图3B),主要表现为CD4+T细胞比例减少(p=0.0039,图3D)。提示52%vol舍得酒低剂量2通过减少CD4+T细胞比例而减少炎症的发生。
2.452%vol舍得酒对大鼠肠道菌群影响肠道菌群α多样性如图4A和B所示,低剂量1组ACE指数显著高于其他三组(低1组VS对照组,p<0.0001;低1组VS乙醇组,p<0.0001;低1组VS低2组,p<0.0001;图4A)。乙醇组Shannon指数较对照组明显降低(p=0.029,图4B),而低剂量1组大鼠肠道菌群α多样性Shannon指数显著高于乙醇组和低2组(低1组VS乙醇组,p=0.0003;低1组VS低2组,p=0.0044;图4B)。提示52%vol舍得酒低剂量1有助于提高肠道菌群丰富度及多样性。肠道菌群门水平相对丰度如图4C所示,厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroides)及变形菌门(Proteobacteria)为四组中相对丰度排前3位的优势菌。乙醇组拟杆菌门(Bacteroides)水平较其他组高,厚壁菌门(Firmicutes)与拟杆菌门(Bacteroides)比值(F/B)低于其他三组。结果提示52%vol舍得酒对大鼠肠道菌群结构影响并没有同剂量酒精明显。图4F反映了属水平肠道菌群群落组成情况,瘤胃梭菌属(Ruminiclostridium)、普雷沃氏菌属(Prevotella)及乳酸杆菌属(Lactobacillus)为四组中相对丰度排前3位的优势菌。其中乙醇组Ruminiclostridium_6、Prevotella_9及Lachnospiraceae_NK4A136_group丰度较对照组增加,而Lactobacillus丰度降低。52%vol舍得酒低剂量1组丰度接近对照组,且Lactobacillus丰度增加。提示52%vol舍得酒低剂量1有利于维持肠道菌群结构,增加有益菌数量。
本发明通过灌胃不同剂量的52%vol舍得酒,研究大鼠肠屏障功能指标及肠道菌群结构的变化,探讨一定剂量下52%vol舍得酒是否对大鼠肠屏障功能及肠道菌群有改善作用。本发明研究发现,52%vol舍得酒低1和2组均能不同程度的增加紧密连接蛋白mRNA表达水平,降低血清促炎因子浓度,增加抑炎因子浓度。而乙醇组肠屏障功能指标均显示其肠通透性增加。说明低剂量52%vol舍得酒对肠屏障功能有一定的增强作用。肠道菌群分析结果表明低1组显著提升大鼠肠道菌群α多样性,而乙醇组大鼠肠道菌群α多样性明显降低。在人体肠道微生物组中只有四种主要门类,即厚壁菌、拟杆菌、放线菌和变形菌,其中90%以革兰氏阳性厚壁菌和革兰氏阴性拟杆菌为主。一些研究用两个优势门类(厚壁菌门和拟杆菌门)的比值作为微生物菌群失调的标志。在一些代谢紊乱中也发现了这一比值的变化。乙醇组与其余三组相比拟杆菌门(Bacteroides)水平较高,厚壁菌门(Firmicutes)与拟杆菌门(Bacteroides)比值(F/B)较低。研究显示IBD患者肠道菌群紊乱,主要体现在菌群多样性减少及F/B比值降低。在属水平,乙醇组Ruminiclostridium_6、Prevotella_9及Lachnospiraceae_NK4A136_group丰度较对照组增加,而Lactobacillus丰度降低。52%vol舍得酒低剂量1组丰度接近对照组,且Lactobacillus丰度增加。瘤胃梭菌属Ruminiclostridium、普雷沃氏菌属Prevotella和毛螺菌属Lachnoclostridium均属于促炎菌群。乳酸杆菌Lactobacillus作为主要的益生菌之一,与多种肝脏疾病的发生、发展和预后相关。尤其在酒精性肝脏损伤研究中,乳酸杆菌具有解毒乙醛的作用。本发明研究表明,52%vol舍得酒低剂量1通过减少致病菌,增加有益菌数量来调节肠道菌群。
3剂量说明
通过探索性动物实验,可确定52%vol舍得酒具有保健功效的剂量范围,按照中国成人平均体重值计算(《2000年国民体质监测公报》显示,成年男性平均体重67.7千克,女性59.6千克),平均每人每天饮酒量应不超过0.60g/kg(男性)或0.35g/kg(女性)。
根据《药理实验方法学》对不同性别大鼠的灌胃剂量进行了换算,如:人的临床剂量为X g/kg,换算成大鼠的剂量:雄性大鼠的剂量=X g/kg×67.7kg×0.018/200g=X g/kg×67.7kg×0.018/0.2kg=6.1X g/kg。本发明中动物实验52%vol舍得酒剂量范围为3.8ml/kg和7.6ml/kg两个剂量,换算为人的临床剂量为0.62ml/kg和1.24ml/kg。
本发明52%vol舍得酒对大鼠肠屏障功能及肠道菌群的影响,发现适量饮用52%vol舍得酒对大鼠肠屏障具有一定程度的保护作用,而且可以缓解炎症及调节肠道菌群。为了解适量饮用52%vol舍得酒对人体的益处提供参考,其中,52%vol舍得酒摄入量为:男性0.62ml/kg-1.24ml/kg,女性0.36ml/kg-0.72ml/kg。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种白酒在制备改善肠屏障功能及肠道菌群药物中的应用,其特征在于,所述白酒为52%vol舍得酒。
2.根据权利要求1所述的白酒在制备改善肠屏障功能及肠道菌群药物中的应用,其特征在于,所述白酒摄入量为:每天男性0.62ml/kg-1.24ml/kg,女性0.36ml/kg-0.72ml/kg。
3.根据权利要求1所述的白酒在制备改善肠屏障功能及肠道菌群药物中的应用,其特征在于,所述改善肠屏障功能包括提高结肠组织中ZO-1及Occludin的mRNA表达水平。
4.根据权利要求1所述的白酒在制备改善肠屏障功能及肠道菌群药物中的应用,其特征在于,所述改善肠屏障功能包括降低血清TNF-α浓度,提升IL-10浓度。
5.根据权利要求1所述的白酒在制备改善肠屏障功能及肠道菌群药物中的应用,其特征在于,所述改善肠道菌群包括提升肠道菌群ACE指数和Shannon指数。
6.根据权利要求1所述的白酒在制备改善肠屏障功能及肠道菌群药物中的应用,其特征在于,所述改善肠道菌群包括提升厚壁菌门Firmicutes与拟杆菌门Bacteroides比值。
7.根据权利要求1所述的白酒在制备改善肠屏障功能及肠道菌群药物中的应用,其特征在于,所述改善肠道菌群包括提升肠道乳酸杆菌属Lactobacillus丰度。
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