CN112316100B - 人丹中药组合物用于防醉解酒或治疗酒精性肝损伤的新用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药技术及保健品领域，具体涉及人丹中药组合物用于防醉解酒或治疗酒精性肝损伤的新用途。本发明发现人丹中药组合物具有良好的解酒作用，能够延长醉酒小鼠的酒精耐受时间；本发明还发现人丹中药组合物对酒精性肝损伤具有预防和治疗作用，能够降低急性酒精性肝损伤小鼠的体重和肝脏指数，有效改善酒精性肝损伤小鼠血清的肝损伤和ALT、AST活性；同时可显著下调酒精代谢关键酶细胞色素P4502E1(CYP2E1)蛋白的表达。

Description

人丹中药组合物用于防醉解酒或治疗酒精性肝损伤的新用途
技术领域
本发明属于医药技术及保健品领域，具体涉及人丹中药组合物用于防醉解酒或治疗酒精性肝损伤的新用途。
背景技术
随着经济社会的快速发展，越来越多人将饮酒作为一种常用的社交手段和娱乐方式，酒桌文化深深地植根在人们的社会文化生活中。但长期过量的饮酒习惯往往是引发酒精性肝病的重要因素，对人体健康造成难以逆转的损害。近年来，酒精性肝病的流行病学调查研究表明，全球范围内酒精消费人群有不断壮大的趋势，罹患酒精性肝病的人群也日益增多。
大量研究表明，长期大量饮酒已成为除病毒外引起肝脏疾病的第二大主要的因素。病毒所引起的肝脏疾病通常可以通过接种疫苗等手段而达到有效的防治效果，而与病毒性肝炎不同，而酒精性肝病因其病程发展往往需要相对较长的时，且由于人们的忽视从而无法在疾病初期采取有效的治疗手段控制疾病的发展。由于上述原因，酒精性肝损伤的死亡率接近或者高于肠癌、乳腺癌等癌症疾病的死亡率。并且如不及时采取有效的药物和适宜的治疗手段加以控制，酒精性肝病可进一步发展为酒精性脂肪肝，甚至是酒精性肝炎；若进一步恶化最终可能会导致酒精性肝纤维化和酒精性肝硬化，严重威胁着人体的健康。
现阶段临床上有效治疗酒精性肝损伤的药物相对缺乏，常用的一般有水飞蓟宾、双环醇、谷胱甘肽等。这些药物为广谱的肝损伤治疗药，能够在一定程度上减缓疾病的发展，使得肝脏生物化学指标恢复正常，但逆转酒精性肝损伤恢复肝脏功能的效果有限。而且对于酒精所引起的肝脏疾病一旦发展到晚期，肝移植手术是目前唯一比较有效的治疗手段。因此通过药物研究为人们提供效果更优良的酒精性肝损伤防治药物是非常有必要的。
人丹最早源自于中国古有的成方“诸葛行军散”，几经改进，得到现有的处方，主要由薄荷脑、冰片、丁香、砂仁、八角茴香、肉桂、胡椒、木香、干姜、儿茶、甘草组成，具有开窍醒神，祛暑化浊，和中止呕等功效，主要用于中暑头晕，恶心呕吐，腹泻及晕车，晕船。本发明发现，由丁香，八角茴香，薄荷脑，冰片，肉桂，胡椒，木香，干姜，甘草，儿茶，砂仁组成的人丹中药组合物可用于防醉解酒、预防或治疗酒精性肝损伤。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种人丹中药组合物在制备防醉解酒药物或保健品中的应用，所述人丹中药组合物包括以下质量份的组分：薄荷脑32-48份、冰片24-36份、丁香20-30份、砂仁20-30份、八角茴香12-18份、肉桂32-48份、胡椒12-18份、木香12-18份、干姜20-30份、儿茶160-240份、甘草291.28-436.92份。
优选地，所述人丹中药组合物加入药学上可接受的载体和/或辅料，可制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、丸剂、酊剂、酒剂、煎膏剂、合剂的任一种剂型。
本发明的另一目的在于提供一种人丹中药组合物在制备防治或治疗酒精中毒药物中的应用，所述人丹中药组合物包括以下质量份的组分：薄荷脑32-48份、冰片24-36份、丁香20-30份、砂仁20-30份、八角茴香12-18份、肉桂32-48份、胡椒12-18份、木香12-18份、干姜20-30份、儿茶160-240份、甘草291.28-436.92份。
优选地，所述人丹中药组合物加入药学上可接受的载体和/或辅料，可制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、丸剂、酊剂、酒剂、煎膏剂、合剂的任一种剂型。
本发明的另一目的在于提供一种人丹中药组合物在制备预防酒精性肝损伤保健品中的应用，所述人丹中药组合物包括以下质量份的组分：薄荷脑32-48份、冰片24-36份、丁香20-30份、砂仁20-30份、八角茴香12-18份、肉桂32-48份、胡椒12-18份、木香12-18份、干姜20-30份、儿茶160-240份、甘草291.28-436.92份。
优选地，所述酒精性肝损伤为酒精致急性肝损伤或慢性酒精性肝损伤。
优选地，所述人丹中药组合物加入药学上可接受的载体和/或辅料，可制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、丸剂、酊剂、酒剂、煎膏剂、合剂的任一种剂型。
本发明的另一目的在于提供一种人丹中药组合物在制备预防或治疗酒精性肝损伤药物中的应用，所述人丹中药组合物包括以下质量份的组分：薄荷脑32-48份、冰片24-36份、丁香20-30份、砂仁20-30份、八角茴香12-18份、肉桂32-48份、胡椒12-18份、木香12-18份、干姜20-30份、儿茶160-240份、甘草291.28-436.92份。
优选地，所述酒精性肝损伤为急性酒精性肝损伤或慢性酒精性肝损伤。
优选地，所述人丹中药组合物加入药学上可接受的载体和/或辅料，可制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、丸剂、酊剂、酒剂、煎膏剂、合剂的任一种剂型。
本发明的有益效果是：①本发明发现人丹中药组合物能够延长醉酒小鼠的酒精耐受时间，具有良好的防醉解酒作用；②人丹中药组合物能够显著下调酒精代谢关键酶细胞色素P4502E1(CYP2E1)蛋白的表达，降低急性酒精性肝损伤小鼠的体重和肝脏指数，有效改善小鼠血清的肝损伤和ALT、AST活性，具有防治或治疗酒精中毒及预防或治疗酒精性肝损伤的作用。
附图说明
图1小鼠酒精性肝损伤实验流程示意图；
图2小鼠血清ALT和AST活性检测结果，其中A为ALT活性检测结果，B为AST活性检测结果；
图3小鼠肝组织病理变化结果图，其中A为空白组，B为模型组，C为龙虎人丹低剂量组，D为龙虎人丹中剂量组，E为龙虎人丹高剂量组，F为水飞蓟宾组；
图4小鼠肝组织CYP2E1蛋白表达水平测定结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售购买的常规生化试剂。
实验动物：C57雄性小鼠52只，6～8周龄，体重为22～24g，购于广州中医药大学实验动物中心。置于SPF级标准饲养环境，3只/笼，自由饮食。所有实验程序均经广东药科大学动物研究委员会批准，符合国家卫生研究院实验室动物护理与使用指南。
实验原料：羧甲基纤维素钠(CMC-Na；批号：20190304；生工生物工程，)；水飞蓟宾(批号：750710208；天津天士力圣特制药；国药准字：H20040299)；麦芽糖糊精(批号：M830178；上海麦克林生化)；生理盐水(批号：1120052104；丰原药业；国药准字：H34021876)；Lieber-DeCarli对照液体饲料(批号：F1259SP；上海BioServ)；Lieber-DeCarli酒精液体饲料(批号：F1258SP；上海BioServ)。
试剂：谷丙转氨酶(ALT/GPT)、谷草转氨酶(AST/GOP)检测试剂盒均购于南京建成生物；HE染色液：苏木精染色液(批号：DH0006；北京雷根生物)；伊红染色液(批号：BL703B；美国Biosharp生物)；56％vol，牛栏山二锅头(编号：SC11511130712623，北京牛栏山)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(批号：23225；美国ThermoFisher Scientific)；β-actin抗体(货号：HC201，北京全式金生物)；CYP2E1抗体(批号：BA4717，博士德生物)；组织固定液(10％中性缓冲福尔马林固定液；批号：20072402；广州维格斯生物)。
仪器：多功能酶标仪(MultiskanFC；美国ThermoFisher Scientific)；高度冷冻离心机(MICRO17R；美国ThermoFisher Scientific)；光学显微镜(BX-UCB；日本Olympus)；化学发光仪(3300029-7Q；上海勤翔)。
饲料配制：对照液体饲料(control liquid diet)：称取902.2g干混合物加入3440ml预热蒸馏水剧烈摇晃混匀后获得。
酒精液体饲料(ethanol liquid diet)：称取533.6g干混合物加入3560ml预热蒸馏水剧烈摇晃混匀后再加入268ml 95％乙醇，充分混匀后获得。
按照说明书比例，根据小鼠进食量配制所需液体饲料，现配现用。
在本发明的实施例中，所述人丹中药组合物以龙虎人丹为例，所述龙虎人丹(批号：161006；上海中华药业；0.04g/丸，国药准字：Z20025168)由上海中华药业有限公司提供，其中龙虎人丹中药组分为本发明所述的人丹中药组合物：薄荷脑40份、冰片30份、丁香25份、砂仁25份、八角茴香15份、肉桂40份、白胡椒15份、木香15份、干姜25份、儿茶200份、甘草364.1份。
实施例1防醉解酒实验
取健康C57小鼠16只，随机分为醉酒模型组和龙虎人丹预防组，每组8只。模型组用生理盐水，龙虎人丹预防组用250mg/kg剂量灌胃后，按照15ml/kg剂量灌以56％vol，牛栏山二锅头(此前通过预实验确定的小鼠醉酒剂量)。观察并记录小鼠醉酒的耐受时间(从清醒到翻正反射消失的时间)，计算醉酒率。
结果如下表1所示，与醉酒模型组相比，给予龙虎人丹预处理后，小鼠的醉酒程度有了明显的改善，显著延长小鼠醉酒耐受时间(P<0.01)。说明，龙虎人丹对醉酒小鼠具有一定的防醉和解酒功效。
表1 解酒结果
上述结果表明，本发明所述的人丹中药组合物能够降低小鼠醉酒率，延长小鼠醉酒耐受时间，具有一定的防醉和解酒功效。
实施例2小鼠酒精性肝损伤实验
1.造模
将36只健康雄性C57小鼠随机分为6组：空白组、模型组、龙虎人丹低剂量组(20mg/kg)、龙虎人丹中剂量组(40mg/kg)、龙虎人丹高剂量组(80mg/kg)和水飞蓟宾组(70mg/kg)。每日3:00-5:00pm给予相应药物灌胃，空白组和模型组给予CMC-Na，具体分组如下表2所示，各组按照表2每日更换饲料的同时进行灌胃给药。第11天给药30min后，用9mg/kg麦芽糖糊精溶液对空白组进行灌胃，其余组给予5mg/kg的乙醇溶液。9h后麻醉小鼠取材，收集血清和肝脏组织进行后续检测，具体实验流程如图1所示。
表2 分组及给药
2.小鼠模型体重及肝重的影响
鼠模型体重及肝重结果由表3所示，为了排除饮食量对小鼠体重的影响，本研究记录各组小鼠的摄食量，结果显示并无统计学差异(P>0.05)；与空白组对比，在实验结束时记录的模型组小鼠体重增长具有统计学差异(P<0.05)，肝重及肝脏指数也有明显升高(P<0.01)；对比模型组，龙虎人丹低剂量组和高剂量的肝脏指数具有统计学差异(P<0.05)；其余各组体重变化与肝脏指数均低于模型组，但无统计学差异(P>0.05)；结果证明，龙虎人丹治疗能够降低急性酒精性肝损伤小鼠的体重和肝脏指数，对肝脏起到一定的保护作用。
表3 龙虎人丹对酒精性肝损伤小鼠模型体重及肝重的影响(n＝6)
注：#表示与空白组相比，具有显著性差异，#P<0.05，##P<0.01
*表示与模型组相比有显著性差异，*P<0.05
上述结果表明，本发明所述的人丹中药组合物能够显著降低急性酒精性肝损伤小鼠的体重和肝脏指数，对酒精性肝损伤具有保护作用。
3.血清ALT、AST活性测定
小鼠麻醉后眼球取血，室温放置30min后常温3500rpm离心15min，吸去上层血清储存于-80℃以待检测。按照试剂盒说明书进行操作，检测血清中ALT、AST的活性，其中，ALT、AST活性值需要根据标准曲线计算得出。
小鼠血清ALT和AST的活性测定结果如图2所示，与空白组对比，模型组小鼠血清ALT和AST活性水平显著升高(P<0.01)。与模型组比较，龙虎人丹低、中、高及阳性对照水飞蓟宾组均能降低血清ALT、AST水平(P<0.01)，且跟剂量呈正相关性。结果显示，龙虎人丹能够减轻小鼠急性酒精性肝损伤的血清ALT和AST的活性。即，本发明所述的人丹中药组合物能够显著降低急性酒精性肝损伤小鼠的血清ALT和AST的活性，对酒精性肝损伤具有保护作用。
4.小鼠肝组织病理变化结果
摘取肝脏组织左叶，用组织固定液常温固定24h。随后脱水并进行石蜡包埋。包埋好的蜡块切成约4μm厚度附于载玻片。使用苏木精-伊红试剂对组织进行染色，中性树胶封片。置于倒置显微镜下观察肝脏组织的病理变化。
小鼠肝组织病理变化结果如图3所示，空白组小鼠的肝组织结构清晰，边缘整齐。肝细胞形状完整排列有序，围绕中央静脉呈放射状。未见明显的细胞变性，坏死及炎性细胞浸润的情况。模型组的肝细胞形状变形，炎症细胞浸润，肝小叶结构模糊并受损严重。脂质蓄积于肝细胞内，形成较大空泡(如箭头所示)，证明小鼠酒精性肝损伤诱导成功。与模型组相比，龙虎人丹各剂量组和水飞蓟宾组的小鼠肝组织病理损伤均得到不用程度的改善。积蓄于肝细胞内的空泡明显缩小并减少，炎症细胞浸润程度也明显减轻。证明龙虎人丹对酒精诱导小鼠的肝损伤起到保护作用。即，本发明所述的人丹中药组合物能够显著改善酒精性肝损伤小鼠肝脏组织病理形态和结构，促进小鼠损伤恢复。
5.小鼠肝组织CYP2E1蛋白表达水测定
用Western blot法检测小鼠肝脏组织中CYP2E1蛋白的表达水平。称取肝脏25mg，加入500μl，RIPA蛋白裂解液(含1％蛋白酶抑制剂)。匀浆后置于冰上充分裂解30min，转移至1.5ml EP管至高速冷冻离心机4℃，12000rpm离心30min。小心收集上层液体，采用BCA法测定蛋白浓度。配制SDS-PAGE分离胶及浓缩胶，进行蛋白电泳并转移至PVDF膜。用5％脱脂牛奶在水平摇床上慢速封闭，随后与CYP2E1(1:1000)及β-actin(1:1000)一抗4℃旋转孵育过夜。第二天用二抗室温孵育1h，经ECL化学发光法与全自动化学发光图像分析系统联合检测。使用Image J软件进行灰度值统计并与β-actin对比计算蛋白相对表达量
小鼠肝组织内CYP2E1蛋白的表达结果如图4所示，与正常组对比，模型组小鼠肝组织CYP2E1蛋白的表达量显著升高(P<0.01)。对比模型组，龙虎人丹各剂量组和水飞蓟宾组小鼠肝脏CYP2E1蛋白的表达均有不同程度的下降，且龙虎人丹效果优于水飞蓟宾。说明，本发明所述的人丹中药组合物在酒精诱导的肝脏损伤进程中起到保护作用，且高剂量的效果尤为显著(P<0.05)。
综上，本发明所述中药组合物具有预防醉酒和解酒作用，可显著降低小鼠的醉酒率，显著提高小鼠对酒精的耐受程度，具有优良的防醉解酒作用；并且所述中药组合物能够抑制肝脏CYP2E1的过度表达、减轻酒精诱导的肝损伤，具有预防或治疗酒精中毒及酒精性肝损伤的作用。

Claims (4)

1.人丹中药组合物在制备预防酒精致急性肝损伤保健品中的应用，其特征在于，所述人丹中药组合物由以下质量份的组分组成：薄荷脑32-48份、冰片24-36份、丁香20-30份、砂仁20-30份、八角茴香12-18份、肉桂32-48份、胡椒12-18份、木香12-18份、干姜20-30份、儿茶160-240份、甘草291.28-436.92份。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述人丹中药组合物加入药学上可接受的辅料，可制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、丸剂、酊剂、酒剂、煎膏剂、合剂中的任一种剂型。
3.人丹中药组合物在制备预防或治疗酒精致急性肝损伤药物中的应用，其特征在于，所述人丹中药组合物由以下质量份的组分组成：薄荷脑32-48份、冰片24-36份、丁香20-30份、砂仁20-30份、八角茴香12-18份、肉桂32-48份、胡椒12-18份、木香12-18份、干姜20-30份、儿茶160-240份、甘草291.28-436.92份。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述人丹中药组合物加入药学上可接受的辅料，可制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、丸剂、酊剂、酒剂、煎膏剂、合剂中的任一种剂型。
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