CN116004486B - 一株缓解肠易激综合征及肠道高敏的脆弱拟杆菌bfs17及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株缓解肠易激综合征及肠道高敏的脆弱拟杆菌BFS17及其应用。脆弱拟杆菌BFS17，保藏编号为GDMCC No：63172。本发明的有益效果为：1、本发明的脆弱拟杆菌BFS17可高效合成益生物质GABA。2、在体内、体外均明显降低肠道细胞炎症水平、增强肠道屏障功能。3、与现临床批准应用于IBS治疗的益生菌相比，本发明能更好缓解IBS的症状、肠道高敏及肠道紊乱相关性焦虑抑郁。4、本发明使用方便、安全，在基因、细胞、动物多水平证实均无对人体有潜在的危害，具有安全、高效的优点。5、本发明能调整肠道紊乱的菌株，提高血清中有益代谢物含量。

Description

一株缓解肠易激综合征及肠道高敏的脆弱拟杆菌BFS17及其 应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株高效合成GABA、缓解肠易激综合征及肠道高敏的脆弱拟杆菌BFS17及其应用。

背景技术

肠易激综合征（irritable bowel syndrome，IBS）是一类常见的功能性肠病，该病呈持续性或间歇性发作，以腹痛、腹胀、排便习惯和/或大便性状改变为主要临床表现，同时常合并焦虑、抑郁等精神症状，但检查提示患者缺乏胃肠道结构及生化异常。据统计，IBS在全球的发病率高达11%~20%，其中在20~50岁的中青年及女性中发病率更高。严重的IBS患者生活质量明显受到影响，研究调查显示，IBS患者工作缺勤的天数是正常同龄人的3倍。因此，寻找有效预防和治疗IBS的方法对于提高我国居民生活水平有重要的意义。

IBS的诊断目前主要根据罗马IV标准执行，根据此标准，IBS诊断前需排除患者有早期炎症性肠病（Inflammatory bowel disease，IBD）、乳糖不耐症、药物性腹泻、滥用缓泻剂、乳糜泻、胆汁性腹泻等系列诱因明确或存在器质性病变等其它常见混淆的疾病。根据IBS患者粪便的性状，可以分为以下几个亚型：便秘型IBS（IBS-C）、腹泻型IBS（IBS-D）、混合型IBS（IBS-M）和不确定型IBS（IBS-U）。由此可知，IBS虽然可有多种临床症状表型，但总体而言它是一种功能性而非器质性疾病，而研究指出，肠道动力异常、肠道敏感性增高（或内脏痛觉过敏）、心理社会因素（如幼年时精神受刺激）及不良的饮食习惯是诱发IBS的常见病因。近年来，越来越多的研究指出，肠道菌群的紊乱也是引起IBS的重要原因之一。有研究指出，受病原微生物感染后，部分患者会出现小肠细菌过度生长情况，而这些患者后续罹患IBS的风险明显增高。而多项基于高通量测序的研究也发现，IBS患者的肠道菌群明显有别于正常人群，且其改变与疾病的病情及预后密切相关。

益生菌（Probiotics）是指一类通过定殖在人体内，通过与人体细胞互作，对宿主产生有益作用的活性微生物。目前研究指出，益生菌可以通过分泌有机酸及细菌素等活性代谢产物抑制病原菌的过度生长、防止致病菌入侵宿主、修复肠屏障功能、产生及分泌各类短链脂肪酸及神经递质，从而提升机体健康。在临床实践中，口服某些特定的益生菌可明显缓解IBS患者的症状，改善疾病预后。但目前益生菌缓解IBS症状的确切分子机制仍不清晰。

脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis，B. fragilis）是一种肠道常见的革兰氏阴性杆菌，该菌具有严格厌氧的特性，具有耐受胆汁的特性。脆弱拟杆菌根据其是否携带毒力基因、分泌毒素分为产肠毒素脆弱拟杆菌和不产肠毒素脆弱拟杆菌。在正常情况下，不产肠毒素的脆弱拟杆菌具有免疫调节的作用，能维持消化系统平衡、提高机体抵抗力，是具有广阔应用前景的新一代益生菌。本团队在前期研究中通过临床队列研究发现，IBS患者肠道中脆弱拟杆菌明显减少，且与患者肠道高敏密切相关。因此，寻找有效物质基础明确、具有调节肠道微生态作用的脆弱拟杆菌，可从微生态角度预防和缓解IBS、肠道高敏及肠道紊乱相关性焦虑抑郁，具有广阔的市场发展空间和较高的市场价值。

发明内容

本发明的第一个目的在于公开了一株脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）BFS17。本发明的脆弱拟杆菌BFS17可高效合成γ-氨基丁酸，在体内、体外均明显降低肠道细胞炎症水平、增强肠道屏障功能，有效缓解IBS尤其是腹泻型IBS的症状、肠道高敏及肠道紊乱相关性焦虑抑郁。

本发明的脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）BFS17，其于2023年2月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为GDMCC No：63172。

本发明的第二个目的提供上述脆弱拟杆菌BFS17在制备预防和/或缓解IBS症状、肠道高敏、肠道紊乱相关性焦虑抑郁、调节IBS紊乱的肠道菌群、提升血清有益代谢产物水平的产品中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种预防和/或缓解IBS症状、肠道高敏、肠道紊乱相关性焦虑抑郁、调节IBS紊乱的肠道菌群、提升血清有益代谢产物水平的产品，其含有脆弱拟杆菌BFS17作为活性成分。

优选，所述的脆弱拟杆菌BFS17是以脆弱拟杆菌BFS17的活菌菌体、菌体破碎物、发酵液或发酵上清液的形式使用。

优选，所述的产品为药品。

进一步优选，所述的药品含有脆弱拟杆菌BFS17、药物载体和/或药物辅料。

本发明的第四个目的是提供脆弱拟杆菌BFS17在制备γ-氨基丁酸中的应用。

优选，脆弱拟杆菌BFS17可作为制备含γ-氨基丁酸的药品。

本发明的第五个目的是提供脆弱拟杆菌BFS17在制备升高机体外周血中的凝乳抑素、脂氧素A5、雷公藤内酯类似物，降低机体外周血中的大麻酰胺G、双水杨酸、雷米普利产品中的应用。

本发明与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、本发明中的脆弱拟杆菌BFS17来源于我国的健康青年肠道，为本土来源的优良菌株。

2、与传统治疗IBS的化学药物相比，本发明具有对生态环境无毒副作用、无残留风险，绿色安全。

3、本发明使用方便、安全，在基因、细胞、动物多水平证实均无对人体有潜在的危害，具有安全、高效的优点。

5、本发明的脆弱拟杆菌BFS17是根据临床队列高通量测序结果定向筛选的菌株，作用精准、机制明确，具体体现为：

（1）明显降低肠道细胞炎症水平、提高胃肠道屏障功能；

（2）在体内能显著缓解IBS相关症状、肠道高敏及肠道紊乱相关性焦虑抑郁；

（3）在体内具有调整肠道紊乱的菌群，提高血清中有益代谢物含量的作用；

（4）高效合成益生物质γ-氨基丁酸，缓解肠道高敏及肠道紊乱相关性焦虑抑郁。

因此，脆弱拟杆菌BFS17在制备预防或缓解IBS、肠道高敏及肠道紊乱相关性焦虑抑郁的产品（如药品等）中，具有巨大的应用前景。

Bacteroides fragilis BFS17，其于2023年2月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为GDMCC No：63172。

附图说明

图1是健康对照与IBS患者肠道菌群的差异比较图；

A.采用Chao1指数比较健康对照与IBS患者肠道菌群多样性；B.采用非度量多维测度NMDS比较（non-metric multidimensional scaling）对比健康对照与IBS患者肠道菌群结构的差异；

C.采用线性判别分析明确健康对照与IBS患者肠道特征菌群。

图2是脆弱拟杆菌BFS17的16S rRNA基因序列在NCBI上的比对结果图。

图3是脆弱拟杆菌分离株对LPS诱导的IBS细胞模型的影响图。

A、B、C分别展示了不同脆弱拟杆菌分离株对LPS诱导的IBS细胞模型TNFα、IL-6与IL-10三种炎症因子的影响。

图4是脆弱拟杆菌分离株对IBS大鼠消化道症状、内脏高敏及抑郁程度的影响图；

A.展示了不同脆弱拟杆菌/益生菌治疗和嗜酸乳杆菌对IBS大鼠粪便颗粒的影响；B.展示了不同脆弱拟杆菌/益生菌治疗对IBS大鼠稀便比例的影响；C.展示了不同脆弱拟杆菌/益生菌治疗对IBS大鼠体重的影响；D.展示了不同脆弱拟杆菌/益生菌治疗对IBS大鼠痛阈的影响；E.展示了不同脆弱拟杆菌/益生菌治疗对IBS大鼠AWR评分的影响；F.展示了不同脆弱拟杆菌/益生菌治疗对IBS大鼠蔗糖偏嗜度的影响。其中**代表未建模正常大鼠与IBS模型鼠对比P＜0.01，*代表未建模正常大鼠与IBS模型鼠对比P＜0.05，##代表未治疗的IBS大鼠与应用BFS17或BFS22治疗的IBS大鼠对比P＜0.01，#代表代表未治疗的IBS大鼠与应用BFS17或BFS22治疗的IBS大鼠对比P＜0.05。

图5是脆弱拟杆菌治疗对IBS大鼠粪肠道炎症与屏障功能的影响图；

A.展示了不同脆弱拟杆菌对IBS大鼠肠道炎症因子TNF-α水平的影响；B.展示了不同脆弱拟杆菌对IBS大鼠肠道炎症因子IL-6水平的影响；C.展示了不同脆弱拟杆菌对IBS大鼠肠道炎症因子IL-10水平的影响；D.展示了不同脆弱拟杆菌对IBS大鼠肠道炎症因子IL-17水平的影响；E.展示了不同脆弱拟杆菌对IBS大鼠肠道屏障功能Claudin-1水平的影响；F.展示了不同脆弱拟杆菌对IBS大鼠肠道屏障功能ZO-1水平的影响。其中**代表未建模正常大鼠与IBS模型鼠对比P＜0.01，*代表未建模正常大鼠与IBS模型鼠对比P＜0.05，##代表未治疗的IBS大鼠与应用BFS17或BFS22治疗的IBS大鼠对比P＜0.01，#代表代表未治疗的IBS大鼠与应用BFS17或BFS22治疗的IBS大鼠对比P＜0.05。

图6是展示了脆弱拟杆菌BFS17治疗对IBS大鼠肠道菌群结构的影响图；

A.采用Chao1指数比较BFS17治疗后IBS大鼠肠道菌群多样性的改变；B.采用主成分分析对比BFS17治疗后IBS大鼠肠道菌群的结构差异；C.采用方差分析明确BFS17治疗后IBS大鼠肠道菌群的改变。*为P < 0.05，**为P < 0.01。

图7是展示了脆弱拟杆菌BFS17治疗对IBS大鼠血清代谢物的影响图；

A.展示了BFS17治疗后，采用正离子模式检测IBS大鼠血清改变的代谢物。

B.展示了BFS17治疗后，采用正离子模式检测IBS大鼠血清改变的代谢物。

图8是展示了脆弱拟杆菌BFS17的特异性益生产物挖掘图；

A.为比较基因组分析不同脆弱拟杆菌的氨基酸代谢合成基因；B.动态观察脆弱拟杆菌BFS17与BFS22发酵液上清的γ-氨基丁酸（GABA）水平随着培养时间延长及菌量的增加的变化情况。

具体实施方案

下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。

下述实施例中涉及的培养基如下

拟杆菌分离培养基：脑心浸液液体培养基、L-半胱氨酸盐酸盐 1g/L、氯化血红素0.01g/L、维生素K1 0.002g/L、卡那霉素硫酸盐溶液 5mL/L、万古霉素盐酸盐溶液 2.5ml/L、琼脂20g/L。

拟杆菌液体培养基：采用BHIych培养基，即脑心浸液液体培养基、酵母提取物5.0g/L、盐酸半胱氨酸 1.0g/L，氯化血红素 15mg/L。

DMEM细胞培养基（mg/L）：二水合氯化钙265.00mg/L、九水合硝酸铁0.10mg/L、氯化钾400.00mg/L、无水硫酸镁97.67mg/L、氯化钠6400.00mg/L、无水磷酸二氢钠109.00mg/L、丁二酸75.00mg/L、丁二酸钠100.00mg/L、L-盐酸精氨酸84.00mg/L、L-盐酸胱氨酸63.00mg/L、甘氨酸30.00mg/L、L-盐酸组氨酸42.00mg/L、L-异亮氨酸105.00mg/L、L-亮氨酸105.00mg/L、L-盐酸赖氨酸146.00mg/L、L-甲硫氨酸30.00mg/L、L-苯丙氨酸66.00mg/L、L-丝氨酸42.00mg/L、L-苏氨酸95.00mg/L、L-色氨酸16.00mg/L、L-酪氨酸72.00mg/L、L-缬氨酸94.00mg/L、D-泛酸钙4.00mg/L、酒石酸胆碱7.20mg/L、叶酸4.00mg/L、肌醇7.20mg/L、烟酰胺4.00mg/L、核黄素0.40mg/L、盐酸硫胺4.00mg/L、盐酸吡哆辛4.00mg/L、葡萄糖1000.00mg/L、丙酮酸钠110.00mg/L、酚红 15.00mg/L。加入10%胎牛血清及1%青霉素/链霉素双抗的DMEM细胞培养基为完全培养基。

实施例1 IBS患者肠道菌群特征改变

采集我国广东地区21位IBS患者的粪便样品，对比年龄、性别相仿的21位健康对照粪便样品，使用粪便微生物DNA提取试剂盒（凯杰，德国）进行微生物DNA提取。提取后采用V3-V4高变区引物341F和806R进行16S rRNA基因扩增，后使用QIAseq超低投入量建库试剂盒（凯杰）进行二代测序文库构建。在Miseq平台（因美纳，美国）采用Miseq测序试剂盒V3（因美纳）对文库进行二代测序。测序获得的样本数据采用CLC workbench数据分析平台（凯杰）进行质控，后采用CLC平台的微生物分析模块、比对Greengenes v13.5数据库对每个样品内所含的微生物种类进行分类学分析，生成操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）表格。采用MicrobiomeAnalyst软件（https://www.microbiomeanalyst.ca）对IBS患者及正常对照的肠道微生物群落进行统计分析。

生物信息学分析结果提示，与正常对照相比，IBS患者肠道中微生物物种的α多样性明显下降（P = 0.022）（图1A），而肠道菌群群落结构也发生明显改变（P = 0.002）（图1B）。采用线性判别分析（Linear discriminant analysis Effect Size，LEfSe）发现，IBS患者肠道中的拟杆菌、具核梭杆菌明显减少，而经黏液真杆菌、瘤胃球菌明显增加（图1C）。结果提示，IBS患者存在明显的肠道菌群紊乱，而肠道中拟杆菌的减少可能与疾病发生密切相关。因此，补充拟杆菌在改善IBS症状上具有巨大应用前景。

图1中：A.采用Chao1指数比较健康对照与IBS患者肠道菌群多样性，结果提示IBS肠道菌群的多样性明显少于健康对照；B.采用非度量多维测度NMDS比较（non-metricmultidimensional scaling）对比健康对照与IBS患者肠道菌群结构的差异，结果提示IBS肠道菌群结构与健康对照明显不同；C.采用线性判别分析明确健康对照与IBS患者肠道特征菌群，结果提示与健康对照相比，IBS患者肠道有9个微生物种属丰度明显升高、6个微生物种属丰度明显降低，其中以拟杆菌属的降低最为显著。

实施例2 拟杆菌的分离、保藏、鉴定

2.1 拟杆菌的分离及保藏

采集我国健康青年的肠道样品，共30份。在无菌环境下，取0.1g肠道样本重悬于10mL生理盐水中，吸取0.5mL菌液做梯度稀释。加入生理盐水制成10^-1至10^-9稀释梯度菌悬液，选取10^-7、10^-8、10^-9三个梯度菌悬液，分别吸取100μL至拟杆菌分离培养基，使用涂布棒涂抹均匀，再于37℃厌氧条件下培养48h。挑取平板上形态典型的菌落至拟杆菌分离培养基上进行划线纯化，纯化后挑取单菌落接种至拟杆菌液体培养基上进行扩培，37℃厌氧培养48h，后以30%甘油保藏于-80℃超低温冰箱中。从30份健康青年肠道样品中，共分得82株益生菌。

2.2 拟杆菌的鉴定

采用细菌DNA提取试剂盒（环凯生物，中国）进行细菌DNA提取，后采用2×PCR mix（环凯生物）进行PCR扩增。PCR扩增引物采用16S rRNA基因通用引物（27F和1492R）（GarrityGM, et al, 2016.）。PCR反应条件为：预变性95℃ 5min；95℃ 30s，56℃ 30s，72℃1min30s共35个循环，72℃退火延伸10min。对PCR产物进行切胶回收，后进行一代测序。将获得的16S rRNA基因序列比对NCBI数据库（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov），结果显示与拟杆菌同源性最高。对于比对结果中Identity和Coverage均与已知拟杆菌相似度大于99%的菌株，可确定为拟杆菌。

经鉴定后，82株益生菌中有42株拟杆菌。其中本专利所要求保护的菌株16S rRNA基因序列比对NCBI数据库（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov），如图2所示，结果提示BFS17的16S rRNA基因序列与NCBI数据库中脆弱拟杆菌ATCC 25285及脆弱拟杆菌NCTC9343的16S rRNA基因序列相似度最高，其基因覆盖度均为100%，而相似度均为99.43%，结果提示其与脆弱乳杆菌同源性最高，命名为脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）BFS17。脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）BFS17于2023年2月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为GDMCC No：63172。

实施例3 拟杆菌的培养、菌悬液及发酵上清的制备

将脆弱拟杆菌BFS17从甘油管中接种至拟杆菌分离培养基平板上，于37℃厌氧培养48h，挑取单菌落接入拟杆菌液体培养基中，于37℃厌氧培养48h，获得BSF17活菌培养液。

采用稀释涂布计数，确定BFS17菌液浓度OD₆₀₀ = 0.80时，菌液浓度为1.03 ±0.02 × 10⁹CFU/mL。采用3000g× 4℃离心5min，去除发酵液上清，收集菌体。采用PBS洗涤菌体2次，后将菌体重悬于PBS中，调整菌悬液浓度至OD₆₀₀ 0.80，后根据实验所需菌体量计算所需菌液体积，进行后续实验。其他益生菌的菌悬液制备也参照此方法制作。

挑取BFS17单菌落接入拟杆菌液体培养基中，于37℃厌氧培养48h后，获得BSF17活菌培养液。采用10000g× 4℃离心5min，留取发酵液上清，后用0.22μm无菌滤膜进行过滤进一步去除菌体，后获得BFS17的无菌发酵上清。其他益生菌的发酵制备也参照此方法制作。

实施例4 拟杆菌的安全性评价

4.1 拟杆菌的基因组特征及安全性评价

采用Illumina Nextseq 550二代测序仪（因美纳）对42株拟杆菌进行全基因组测序。细菌基因组DNA提取方法同前。二代测序采用AMT Rapid DNA-Seq Kit for Illumina（CISTRO，中国）)建库，采用高产出芯片v2.5（因美纳）试剂盒在Nextseq测序平台进行测序。下机数据采用Trimmomatic软件进行质控，后采用SPAdes软件进行组装。组装后拟杆菌的基因组采用Quast软件进行基因组质控评估，采用Abricate软件查找并注释毒力基因。

统计发现，42株拟杆菌分离株基因组大小波动于4.67Mb~6.83Mb之间，GC%波动于41.81%~46.38%之间，其中BFS17基因组大小5.18Mb，GC%为43.32%。比对VFDB毒力数据库发现，42株分离株中，有7株拟杆菌存在潜在的毒力基因，包括dddhA、cpd4I、cpsF、cps4K及lgtC，而BFS17未检出毒力基因。

4.2 拟杆菌的溶血性试验

在无菌环境下，用接种环接种待检测于血平板上，37℃厌氧培养48h，观察溶血现象。48h后观察42株乳杆菌中，2株出现了溶血现象，而BFS17菌落周围未出现溶血现象，而阳性对照溶血葡萄球菌ATCC6538菌落周围出现透明溶血环，表明脆弱拟杆菌BFS17不具有溶血风险。

4.3 肠上皮细胞Caco-2的培养与传代

人结直肠腺癌细胞（Caco-2）购自中国科学院细胞库（上海，中国）。采用完全培养基在37℃、5% CO₂培养箱中进行Caco-2细胞培养。待Caco-2细胞在T25培养瓶中生长达到80%的密度时，加入0.25%胰酶（Gibco）室温反应3min进行消化。3min后加入完全培养基终止消化，并用一次性无菌吸管将细胞从培养瓶壁上冲洗下来，将含细胞的培养基混合液转移至15 mL离心管。离心1000r/min 5min收集沉淀的细胞，用PBS洗涤细胞2次后，将细胞重悬于完全培养基中，调整适当细胞浓度，转至新的T25培养瓶进行传代培养。

4.4 拟杆菌对肠上皮细胞Caco-2的毒性作用

按实施例3制备不同拟杆菌分离株的无菌发酵上清。待Caco-2细胞培养至对数期，收集细胞。96孔板内设不做处理的正常对照和无菌发酵上清处理组，每组均设3个实验孔。以1×10⁴个/mL每孔接种100μL Caco-2细胞悬液至96孔板内，待细胞贴壁生长后，每孔加入10μL拟杆菌发酵上清，后96孔板置于5%CO₂，37℃培养箱培养24h。24小时后采用CCK-8法测定加入无菌发酵上清后Caco-2细胞存活率，结果如表1所示。由表1可知，BFS17与BFS22发酵上清不会诱导Caco-2凋亡，对肠上皮细胞安全。

实施例5 拟杆菌缓解IBS细胞炎症及改善肠道屏障功能的效果评估

5.1 IBS细胞模型构建

研究采用脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）诱导Caco-2细胞炎症反应，构建IBS细胞模型。将1×10⁶个Caco-2细胞接种于6孔板板中，加入2mL不含双抗的完全培养基，在37℃、5% CO₂培养箱中培养24h。在不同孔中分别每孔加入200ng的LPS诱导细胞炎症，当细胞与LPS互作3h后，弃去细胞上清，采用PBS清洗2次后重新加入不含双抗的完全培养基进行培养及后续实验。培养结束后采用0.25%胰酶消化收集细胞，提取细胞RNA检测相应炎症因子，以确认模型成功构建。

5.2 脆弱拟杆菌BFS17与IBS细胞互作

按实施例3方案获取BFS17菌体和BFS22菌体，分别重悬于2mL DMEM中。在每孔LPS诱导的IBS细胞中加入1×10⁸CFU BFS17菌体（MOI 1:100），在37℃、5% CO₂培养箱中互作4h。4h后采用PBS清洗细胞2次，后采用0.25%胰酶消化，收集互作后的Caco-2细胞进行后续检测。其他益生菌的互作实验也参照此方法开展，研究设置不加入LPS诱导炎症的control组及仅使用LPS诱导但不使用菌体修复的LPS组作为阴性及阳性对照。

5.3 脆弱拟杆菌BFS17改善IBS细胞炎症及屏障功能的效果评估

使用细胞RNA提取试剂盒提取与BFS17或BFS22互作后的Caco-2细胞的RNA。使用Evo M-MLV逆转录酶（瑞真，中国）将1μg细胞总RNA反转录合成cDNA。采用SYBR Green I进行BFS17互作后的Caco-2炎症因的荧光定量检测。荧光定量检测所用检测TNF-α、IL-6、IL-10、Claudin-1及内参β-actin所用引物均参考Tang HY的方法（Tang HY，2022，Am J TranslRes）。在LightCycler96荧光定量PCR仪（罗氏，美国）使用以下条件进行qPCR反应：95℃30s；95℃ 5s、60℃ 30s共40个循环；95℃ 5s、60℃ 60s、95℃ 1s。 使用LightCycler96 SW软件分析数据得出扩增循环数值（cycle threshold，ct），按照ΔΔct方法计算得到各检测基因的表达水平。

图3是脆弱拟杆菌分离株对LPS诱导的IBS细胞模型的影响图，A、B、C分别展示了不同脆弱拟杆菌分离株对LPS诱导的IBS细胞模型TNFα、IL-6与IL-10三种炎症因子的影响，结果提示LPS刺激后，Caco2细胞的促炎因子TNFα、IL-6明显升高，而抑炎因子IL-10明显降低；脆弱拟杆菌BFS17及BFS22能缓解LPS对Caco2细胞的炎症刺激作用，又以BFS17的作用更为明显。其中**代表未建模正常大鼠与IBS模型鼠对比P＜0.01，*代表未建模正常大鼠与IBS模型鼠对比P＜0.05，##代表未治疗的IBS大鼠与应用BFS17或BFS22治疗的IBS大鼠对比P＜0.01，#代表代表未治疗的IBS大鼠与应用BFS17或BFS22治疗的IBS大鼠对比P＜0.05。从图3可知，LPS诱导的IBS细胞模型促炎因子TNFα和IL-6明显升高（P < 0.001 in TNFα and IL-6）、抑炎因子IL-10明显降低（P = 0.005）。脆弱拟杆菌BFS17及BFS22与IBS细胞模型互作后能明显下调促炎因子TNFα和IL-6的转录水平（P < 0.001 in TNFα & IL-6 in BFS17，P =0.030 in TNFα in BFS22 and P = 0.002 in IL-6 in BFS22），而上调抑炎因子IL-10的水平（P < 0.001 in BFS17 and BFS22）。进一步比较发现，BFS17对IBS细胞模型的炎症调控作用明显优于BFS22（P = 0.048 in TNFα，P = 0.235 in IL-6，P = 0.021 in IL-10）。结果表明，脆弱拟杆菌分离株BFS17及BFS22均有良好缓解IBS细胞炎症的作用，其中又以BFS17效果更佳。

实施例6 脆弱拟杆菌缓解IBS大鼠IBS症状、肠道高敏及肠道紊乱相关性焦虑抑郁的效果评估

6.1 IBS动物模型构建

采用母婴分离联合慢性避水应激方案构建IBS大鼠模型。造模用Sprague-Dawley（SD）大鼠购自百试通生物科技有限公司（珠海，中国）。雄性SD大鼠在出生2天后每日9:00AM-11:00AM与母鼠分离3h，连续分离20天；至22天开始断奶，后正常饲养至49天，完成母婴分离SD大鼠模型。后对经母婴分离处理的SD大鼠进行避水应激刺激：在长41cm×宽38cm×高38cm的透明玻璃水箱中放置一个长10cm×宽8cm×高8cm的玻璃积木，在玻璃水箱中注入25℃纯净水，水面在积木表面下1cm。每日将SD大鼠置于玻璃积木上1h，连续10天，构建避水应激模型。同时构建对照组大鼠，该组大鼠未经母婴分离处理，且在避水应激阶段将对照组大鼠每日放入一个长41cm×宽38cm×高38cm的无水透明玻璃箱中1h，连续处理10天。

6.2 IBS动物模型的肠道症状评估

每日观察SD大鼠在避水应激刺激前后的体重改变，并计数大鼠避水应激1h期间排便颗粒及未成形粪便的比例，以评估IBS模型大鼠的肠道症状。

6.3 IBS动物模型的内脏痛觉过敏评估

在10天避水应激试验造模前后及拟杆菌处理前后对试验用的SD大鼠进行腹部回撤反射（Abdominal withdrawal reflex，AWR）试验，以评定SD大鼠的内脏痛觉过敏程度。

腹部回撤反射试验：采用异氟醚麻醉IBS大鼠，后经肛门置于6F医用外科导尿管，置管深度约5~6cm。后依次使用20mmHg、40mmHg、60mmHg及80mmHg恒定压力进行分级结肠扩张，每次施压持续时间20s、刺激间隔4min，注压速度为20mL/min。注压期间及注压结束后均对大鼠进行评分，评分标准为：①0分：大鼠情绪基本稳定，未出现敏感现象；②1分：大鼠情绪变得不稳定，偶尔扭转头部；③2分：大鼠腹背部肌肉轻微收缩，但腹部未抬离地面；④3分：大鼠腹背部肌肉较强烈收缩，腹部抬离地面；⑤4分：大鼠腹背部肌肉强烈收缩，腹部呈弓形，腹部和会阴部均抬离地面。记录SD大鼠在注压期间首次出现评分为4分的压力值，记为大鼠的AWR压力阈值，压力阈值越低，SD大鼠内脏敏感性越高；记录大鼠在不同压力下的AWR评分，同一压力下AWR评分越高，SD大鼠内脏敏感性越强。

6.4 IBS动物模型的相关抑郁焦虑评估

糖水偏好实验（sucrose preference test）是一个典型的快感缺失经典试验，其根据啮齿类动物对甜味偏好而设计，能检测啮齿类动物抑郁焦虑的情况。研究在10天避水应激试验造模前后及拟杆菌处理前后对试验用的SD大鼠进行糖水偏好试验，以评定SD大鼠的焦虑抑郁情况。

糖水偏好试验：首先，对SD大鼠进行适应训练，在训练中，在SD大鼠饲养笼中放入两瓶1%（w/v）的蔗糖溶液24h，后将其中一瓶蔗糖溶液换成纯水24h，共48h完成糖水偏好适应训练。适应结束后，对SD大鼠禁水24h，后开始糖水偏好测试。在SD大鼠饲养笼中放入一瓶1%（w/v）的蔗糖溶液、一瓶纯水，12h内禁食不禁水，12h后记录SD大鼠的总液体消耗量、蔗糖溶液与纯水消耗的比值。蔗糖偏嗜度（%）=蔗糖溶液饮用量/（蔗糖溶液饮用量+纯水饮用量）×100%。当蔗糖偏嗜度＜0.4或较对照组显著降低（统计检测P < 0.05）时，可以判断SD大鼠出现抑郁焦虑行为。

6.5 拟杆菌对IBS大鼠肠道症状、肠道高敏及肠道紊乱相关性焦虑抑郁疗效评估

动物实验分组与处理如表2。

实验结束后，评估不同益生菌菌株对IBS大鼠体重、肠道症状、肠道高敏及肠道紊乱相关焦虑抑郁情况，结果如图4所示。由结果可知，脆弱拟杆菌BFS17能明显缓解IBS大鼠的肠道症状、改善内脏高敏情况并减轻肠道紊乱所致的焦虑抑郁，而脆弱拟杆菌BFS22及常用于治疗IBS的益生菌嗜酸乳杆菌34106（商品名：益君康）虽然对IBS的腹泻症状、内脏高敏有一定改善作用，但是对于IBS大鼠的体重恢复及焦虑抑郁没有明显的改善作用。

6.6 拟杆菌对IBS大鼠肠道炎症及屏障功能的

实验动物分组及实验方案同上。实验结束后采集大鼠肠道组织，采用组织RNA提取试剂盒（环凯生物）提取大鼠肠道组织的总RNA。使用Evo M-MLV逆转录酶将1μg细胞总RNA反转录合成cDNA。采用SYBR Green I进行拟杆菌对IBS大鼠肠道组织炎症因子及屏障功能的荧光定量检测。

从图5可知，采用母婴分离联合避水应激导处理后IBS大鼠肠道组织的促炎因子TNFα和IL-6明显升高（P = 0.021 and 0.031）、抑炎因子IL-10和IL-17明显降低（P =0.046 and < 0.001），而代表肠道屏障功能的Claudin-1及ZO-1水平明显降低（P = 0.003and 0.001）。灌胃脆弱拟杆菌BFS17治疗能明显下调IBS大鼠肠道促炎因子TNFα和IL-6的转录水平（P = 0.034 and 0.039），上调抑炎因子IL-10和IL-17的水平（P = 0.037 and <0.001），同时提升代表肠道屏障功能的Claudin-1及ZO-1水平（P < 0.001 in bothgroups），而BFS22治疗同样能下调TNFα和IL-6、上调Claudin-1及ZO-1水平（P < 0.05 in 4groups），但对IL-10及IL-17影响未达统计学意义，且BFS22对炎症因子及屏障功能的影响弱于BFS17（P < 0.05 in 4 groups）。结果表明，脆弱拟杆菌分离株BFS17具有良好缓解IBS大鼠肠道炎症、提升肠道屏障功能的作用。

实施例7 拟杆菌对IBS紊乱的肠道菌群的调控及血清有益代谢物产生的影响效果评估

7.1 拟杆菌对IBS紊乱的肠道菌群的调控影响评估

参照实施例6建立IBS动物模型。收集脆弱拟杆菌BFS17治疗后IBS大鼠的粪便，对比未经治疗的IBS大鼠及普通SD大鼠，进行肠道菌群16S rRNA高通量分析。测序及生物信息学分析方案参照实施例1。脆弱拟杆菌BFS17治疗后IBS大鼠肠道菌群改变如图6所示。图6是展示了脆弱拟杆菌BFS17治疗对IBS大鼠肠道菌群结构的影响图；A.采用Chao1指数比较BFS17治疗后IBS大鼠肠道菌群多样性的改变，结果提示BFS17治疗能提高IBS大鼠肠道菌群的多样性；B.采用主成分分析对比BFS17治疗后IBS大鼠肠道菌群的结构差异，结果提示BFS17能调整IBS大鼠肠道菌群结构；C.采用方差分析明确BFS17治疗后IBS大鼠肠道菌群的改变，结果提示BFS17治疗后Aerococcus、Flavonifractor和Frisingicoccus的相对丰度升高， Erysipelatoclostridium、Faecalitalea、Holdemania、Negativibacillus和Trichinella的相对丰度降低。*为P < 0.05，**为P < 0.01。结果提示脆弱拟杆菌BFS17治疗有效提高IBS大鼠肠道菌群丰度（P = 0.008）、恢复肠道菌群构成（P = 0.023），同时提高Aerococcus、Flavonifractor和Frisingicoccus的相对丰度，降低Erysipelatoclostridium、Faecalitalea、Holdemania、Negativibacillus和Trichinella的相对丰度。

7.2 拟杆菌对IBS血清有益代谢物产生的影响

参照实施例6建立IBS动物模型。收集脆弱拟杆菌BFS17治疗后IBS大鼠的血清。样本预处理：采用1mL甲醇与乙腈混合液（1:1，v/v）萃取取200uL大鼠血清，经真空干燥浓缩后，加入50%乙腈复溶后取上清上样。采用Vanquish色谱系统和Thermo scientific QExactivep plus质谱仪进行代谢组分析，通过将3μL的样品吸入到Thermo scientific TMAccucore TM ¹⁸C色谱柱（100×2.1 mm，2.6μm）上进行，柱温35℃，流速0.3 mL/min.。采用0.1%甲酸（正离子模式A）、5mmoL乙酸（负离子模式A）和乙腈（B）作为流动相，洗脱梯度为：0min 2%B；7min 50%B；19 min 80%B；21 min 98%B；23 min 98%B；23.5min 0.2%B。样品分别在正负离子模式下进行全扫描。采集参数设置为：分辨率为70000，自动增益控制目标为1×10⁶，扫描范围为70~1000m/z。使用数据依赖的MS2分析一个汇集的QC样本。正、负模式喷雾电压设置为3.5kV。完整MS/dd-MS2（topN）基于两种电离模式前5个最强m/z获得的全质谱，以获得具有以下设置的每种化合物的MS2光谱：分辨率为17500，自动增益控制目标为1×10⁵，最大IT为50ms，分离窗为1.5m/z，归一化碰撞能量为20、40和60eV。下机数据使用Compound Discoverer 3.1软件进行基线的校正、峰的区分和对齐处理，使用MetaboAnalyst 5.0进行主成分分析（PCA）、偏最小二乘判别分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）。T检验用于计算代谢物之间的统计显著性和倍数变化，并根据其投影（VIP）分数（>1.5）、P值（<0.01）和倍数变化（>2）来筛选差异代谢物。

脆弱拟杆菌BFS17治疗后IBS大鼠血清中小分子代谢产物改变如图7A和7B所示。图7是展示了脆弱拟杆菌BFS17治疗对IBS大鼠血清代谢物的影响图；A.展示了BFS17治疗后，采用正离子模式检测IBS大鼠血清改变的代谢，B.展示了BFS17治疗后，采用正离子模式检测IBS大鼠血清改变的代谢物，代谢组结果提示经脆弱拟杆菌BFS17治疗有效缓解IBS血清代谢物紊乱的情况，升高大鼠外周血如凝乳抑素（chymostatin）、脂氧素A5（LxA5）、雷公藤内酯类似物（Triptolide Analog）LLDT-8等12种小分子代谢物，同时降低大麻酰胺G、双水杨酸（Salsalate）、雷米普利等28种小分子代谢物水平。目前已有研究指出，凝乳抑素具有良好的抑制炎症、修复组织损伤作用（Yang C, et al. Inflammation. 2018；Qiu M, etal. Lipids Health Dis. 2018）；脂氧素A5可以提高机体免疫力（Stahl GL, et al. EurJ Pharmacol. 1989）；雷公藤内酯类似物LLDT-8具有潜在的预防肠道癌症作用（Li H, etal. Int Immunopharmacol. 2020），所以BFS17可以增加血清中这些代谢物的浓度，提升肠道健康。

实施例8 脆弱拟杆菌有益代谢产物的挖掘及验证

8.1 基因组水平的脆弱拟杆菌BFS17有益代谢产物基因组

采用泛基因组分析挖掘脆弱拟杆菌BFS17及BFS22的潜在有益代谢产物合成基因。全基因组测序方案参照实施例4。采用Prokka软件及Roary软件对BFS17、BFS22及其他无改善IBS炎症作用的脆弱拟杆菌分离株进行比较基因组分析。图8是展示了脆弱拟杆菌BFS17的特异性益生产物挖掘图；A.为比较基因组分析不同脆弱拟杆菌的氨基酸代谢合成基因，可见虽然所有脆弱拟杆菌分离株均携带谷氨酸脱羧酶合成基因gadB，但与其它效果欠佳的脆弱拟杆菌相比，对抗炎有良好作用的BFS17及BFS22特异含gadC这一氨基酸合成基因；B.动态观察脆弱拟杆菌BFS17与BFS22发酵液上清的γ-氨基丁酸（GABA）水平随着培养时间延长及菌量的增加而不断升高，而同样的培养条件下，BFS17产GABA水平明显高于BFS22。

比较基因组分析发现，本研究中所有的脆弱拟杆菌均携带gadB基因，而仅有脆弱拟杆菌BFS17及BFS22同时携带有gadB及gadC基因，而无改善炎症作用菌株不携带gadC基因（图8A）。目前研究指出，gadB基因是负责编码细菌体内的谷氨酸脱羧酶，该酶在细菌胞内将谷氨酸催化发生脱羧反应，消耗一个质子生成γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）（De Biase D, Mol Microbiol, 2012）。2012年清华大学施一公教授团队发现，细菌合成的GABA并不能直接转运至胞外，它需要依赖一个反向转运蛋白GadC（由gadC基因负责编码合成）进行GABA从胞内到胞外的转运（Dan Ma，Nature. 2012）。GadC一方面能增加菌株发酵上清GABA的产量，另一方面能协助菌株清除胞内酸性物质如GABA，解除酸性物质对菌株生长的抑制作用。

目前研究指出，GABA尤其是由微生物生产的含脂肽类物质的GABA与IBS的症状如内脏高敏、腹痛及抑郁焦虑均密切相关（Laroute V,et al. Elife, 2022； Petitfils C,et al. Gut. 2022.）。因此，BFS17和BFS22可能通过合成并分泌GABA，从而改善IBS的症状、缓解内脏高敏、减轻抑郁焦虑水平。

8.2 代谢组水平的拟杆菌BFS17有益代谢产物验证

挑取BFS17单克隆菌落至BHIych培养基，于37℃厌氧工作站中进行厌氧发酵，发酵期间采用GABA微量法检测试剂盒（酶联生物，中国）对BFS17发酵代谢产物中的GABA含量进行定量分析，结果如图8B所示。结果显示，随着发酵时间延长，BFS17和BFS22的菌量逐步增多，而发酵上清中的GABA含量亦逐步升高，而BFS17在24小时上清GABA已高于BFS22（521.34mg/L vs 185.85mg/L，P < 0.001）；且随时间延长，差距逐步增大，至48小时，BFS17发酵上清中GABA进一步升高至1089.36mg/L，高于BFS22的发酵上清（515.50mg/L）；到72小时，BFS17发酵上清中GABA高达1221.64 mg/L，高于BFS22的发酵上清（546.43mg/L）（图8B）。结果提示BFS17较BFS22具有更强的GABA合成功能。

虽然本发明已将较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰。因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的内容为准。

Claims (8)

1.脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）BFS17，保藏编号为GDMCC No：63172。

2.权利要求1所述的脆弱拟杆菌BFS17在制备预防和/或缓解IBS症状、肠道高敏、肠道紊乱相关性焦虑抑郁、调节IBS紊乱的肠道菌群的药品中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的脆弱拟杆菌BFS17是以脆弱拟杆菌BFS17的活菌菌体、菌体破碎物、发酵液或发酵上清液的形式使用。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的药品含有脆弱拟杆菌BFS17、药物载体和/或药物辅料。

5.一种预防和/或缓解IBS症状、肠道高敏、肠道紊乱相关性焦虑抑郁、调节IBS紊乱的肠道菌群的药品，其特征在于，含有权利要求1所述的脆弱拟杆菌BFS17作为活性成分。

6.权利要求1所述的脆弱拟杆菌BFS17在制备γ-氨基丁酸中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，是脆弱拟杆菌BFS17用于制备含γ-氨基丁酸的药品。

8.权利要求1所述的脆弱拟杆菌BFS17在制备升高机体外周血中的凝乳抑素、脂氧素A5、雷公藤内酯类似物LLDT-8的含量，降低机体外周血中的大麻酰胺G、双水杨酸、雷米普利的含量药品中的应用。

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