CN114058534A - 一株高产抗肝癌胞外多糖的枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及功能微生物筛选与应用技术领域，具体提供了一株高产抗肝癌胞外多糖的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)及其应用。所述枯草芽孢杆菌是从辽宁省自然发酵豆酱中分离筛选得到，保藏号为CGMCC No.23141，其胞外多糖产量高达3.04g/L，且具有良好的抗氧化能力和保湿功能，并对人肝癌HepG2细胞具有显著的抑制作用，有望开发成新的抗癌天然药物。

Description

一株高产抗肝癌胞外多糖的枯草芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及功能微生物筛选与应用技术领域，具体地涉及一株高产抗肝癌胞外多糖的枯草芽孢杆菌及其应用。

背景技术

肝癌是我国常见的恶性肿瘤和致死病因，是全球致死率第二的癌症。在亚洲国家，肝癌发病率很高，发病率为2％～6％，而在一些欧洲国家，肝癌发病率仅有0.25％，我国是肝癌高发国家，发病率和死亡率均高于世界平均水平，且有将近于全球过半的肝癌病人。肝癌的男性患者比女性患者多很多，且在我国，南方地区肝癌患病率较高、农村发病率高于城市。近十几年来，肝癌发病率急速上升，且越来越年轻化。肝癌形成会促使压迫并破坏周围脏器，出现出血、脏器破裂的现象，生长在肝门部还会引起黄疸，严重发展会致使肝肾功能衰竭，继而引起全身衰竭，直至死亡。

肝癌的最主要治疗方式为手术治疗，但一些患者并不适合手术治疗，也有一些药物能用于癌症晚期诊疗。目前临床用于治疗肝癌的常用药物为仑伐替尼和索拉非尼等分子靶向药物，以及一些免疫药物和其他细胞毒性药物，但细胞毒性药物对肝脏损伤大，可能会加重肝硬化，激活乙肝病毒。临床试验证明，索拉非尼仅能延长大概三个月生存期，且极易产生耐药性，促使肿瘤转移。为改善临床症状，提高药物敏感性，迫切需要天然新型药物来替代传统药物。目前天然药物研究种类较多，中药或植物中含有多种抑制癌症的多糖类、酮类等有效成分，试验研究表明其对癌症治疗明显有效。目前应用于肝癌治疗的天然药物有莪术油、芝麻籽、淫羊藿等，天然药物来源安全，毒副作用小，并且具有广谱活性，抗肿瘤的同时还能提高免疫，抗炎抗病毒。

微生物胞外多糖作为一种新型天然抗癌活性物质，有作为抗癌药物的巨大发展前景，植物来源的天然药物种植周期长，人力物力耗费高，成本大，微生物生产则能完美解决此类问题。微生物生长周期短，安全性高，所需场地小，成本相对较低。且近年来多种微生物胞外多糖关于抑制癌症的研究广泛，研究结果均证明微生物胞外多糖具有良好的抗癌效果。例如肠膜明串球菌SN-8胞外多糖的研究中，对于人肝癌细胞HepG2的最大抑制率达到了68.42％；小球藻胞外多糖对宫颈癌细胞作用，细胞凋亡率最大能达到43.56％；隐球酵母S20所产胞外多糖能诱导非小细胞肺癌细胞自噬，达到抑制肺癌的目的等。

胞外多糖的生产常通过醇沉法先得到粗多糖，再用凝胶色谱柱纯化，干燥后得纯化多糖。微生物胞外多糖是天然抗癌药物的优良选择，但是没有应用于临床的局限主要在菌株产量不高，并且易受到培养基、环境等多种因素影响，如何改善产量问题及提高治疗效果需要进行深入研究。

鉴于癌症治疗的天然药物市场的需求，急需开发新型高效的天然药物，目前大多数天然药物来源于陆地，但土地资源稀缺，耗费人力，微生物来源的天然药物明显更具优势，搜寻更高产、效益更强的胞外多糖生产菌株也迫在眉睫，对癌症治疗天然药物的扩展及微生物资源的利用具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一株高产抗癌胞外多糖的枯草芽孢杆菌及其应用。所述枯草芽孢杆菌是从辽宁省自然发酵豆酱中分离筛选得到，其胞外多糖产量高，且具有良好的抗氧化能力和保湿功能，并对人肝癌HepG2细胞具有显著的抑制作用，有望开发成新的抗癌天然药物。

本发明一方面涉及一种枯草芽孢杆菌，命名为枯草芽孢杆菌SNBS-6(Bacillussubtilis SNBS-6)，已于2021年8月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.23141。

本发明一方面涉及枯草芽孢杆菌SNBS-6在胞外多糖生产中的应用。

本发明还提供一种发酵生产胞外多糖的方法，包括如下步骤：

(1)将枯草芽孢杆菌SNBS-6接种于产糖培养基中进行发酵，得发酵液；

(2)将发酵液离心，得上清液；

(3)将上清液中加入至少3倍体积的无水乙醇，静置；

(4)离心，收集沉淀，即为胞外多糖。

优选地，所述的产糖培养基中各组分及其含量分别为：胰蛋白胨10g/L、5g酵母浸粉5g/L、氯化钠10g/L、蔗糖20g/L。

优选地，所述的发酵条件为：发酵温度32-37℃，发酵时间36-48h，发酵pH7.0，摇床转速160r/min。

本发明还提供了一种胞外多糖，是通过上述方法制备得到的。

所述的胞外多糖包含EPS-1和EPS-2两种多糖。其中，EPS-1包含果糖、葡萄糖和半乳糖；EPS-2包含果糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖。

本发明还提供了所述胞外多糖在化妆品、食品、保健品或药品生产中的应用。

本发明还提供了一种抗肝癌保健益生菌粉，其各组分及重量份数分别为枯草芽孢杆菌SNBS-6冻干菌粉8-10份、低聚果糖25-30份、麦芽糊精15-20份、橘子粉20-25份、木糖醇5-10份、菊粉15-20份。

所述枯草芽孢杆菌SNBS-6冻干菌粉的制备方法，包括如下步骤：

(1)枯草芽孢杆菌SNBS-6菌泥的制备

将枯草芽孢杆菌SNBS-6接种于50mL LB基础培养基中，32-37℃培养12-24h。再按2％的接种量于250mL LB液体培养基中二次活化，32-37℃培养12-24h。最后将活化好的枯草芽孢杆菌SNBS-6以5％接种量于10L发酵罐中进行高密度厌氧培养，于37℃、pH6.0的条件下培养12-24h，得到发酵液；10000xg、4℃离心10-15min，弃上清，收集菌体沉淀，用pH7.0的无菌磷酸盐缓冲液漂洗菌体1次，即得到枯草芽孢杆菌SNBS-6菌泥；

(2)冻干保护剂的制备

冻干保护剂包含质量体积比为10％的脱脂乳粉，5％的乳糖，2％的谷氨酸钠，2％的甘油，以水作为溶剂，于105℃灭菌5min；

(3)冻干菌粉的制备

将枯草芽孢杆菌SNBS-6菌泥以1:5的质量体积比与保护剂溶液充分搅拌混匀；混合液于-80℃条件下预冻5h，使其均匀冻结在容器内壁上；放入真空冷冻干燥箱干燥20h后，得到冻干菌粉。

所述枯草芽孢杆菌冻干菌粉中活菌数至少为10⁸CFU/g。

本发明还提供了一种发酵剂，所述发酵剂的包含枯草芽孢杆菌SNBS-6。

本发明还提供了所述发酵剂在食品加工中的应用。

本发明的有益效果主要体现在：

本发明提供的枯草芽孢杆菌SNBS-6具有优良的产胞外多糖的能力，摇瓶发酵条件下，其胞外多糖产量高达3.04g/L，并且具有产糖周期短、安全无毒副作用的优点。

枯草芽孢杆菌SNBS-6产胞外多糖包含EPS-1和EPS-2两种组分。其中，EPS-1主要由果糖、葡萄糖和半乳糖组成，EPS-2主要由果糖构成，并含有少量甘露糖、葡萄糖和半乳糖。红外光谱结构分析显示EPS-1和EPS-2具有典型多糖结构的基本骨架和官能团，EPS-1主要是由吡喃糖构成，EPS-2主要是由呋喃糖构成。核磁共振法结构分析显示，EPS-1是由葡萄糖、果糖和半乳糖组成的多聚糖链，其中果糖为主要成分；EPS-2是主要由果糖以β-1，6-糖苷键组成果聚糖链，无分支，但含有少量的葡萄糖、甘露糖和半乳糖残基。扫描电镜结果显示，EPS-1和EPS-2两种多糖在结构上存在明显区别，EPS-1在1.00k倍数下呈现许多分支，在5.00k倍数下表面不平；与EPS-1相比，EPS-2在1.00k倍数下较为平整，整体呈现出薄板片状，在5.00k倍数下表面粗糙有凸起。

枯草芽孢杆菌SNBS-6产胞外多糖耐热性强，保湿效果好，且具有很强的抗氧化能力，对DPPH、ABTS·+、·OH和超氧阴离子自由基的清除率达到56.98％-93.55％。

枯草芽孢杆菌SNBS-6产胞外多糖能有效干扰人肝癌HepG2细胞的有丝分裂，提高凋亡蛋白的表达，诱导细胞凋亡，从而显著抑制肝癌细胞的增殖，提高肝癌细胞死亡率，导致肝癌细胞侵袭迁移能力严重丧失。枯草芽孢杆菌SNBS-6产胞外多糖抗癌效果极好，具有应用于治疗肝癌药物开发的潜力。

本发明利用枯草芽孢杆菌SNBS-6制备得到的抗肝癌保健益生菌粉，可通过温水冲服食用，能明显缓解由肝癌引起的脸色发黄，显著提高肝癌患者的免疫力，延长生存期。所述益生菌粉抗氧化活性高，长期食用，还可有效预防肝癌的发生。

本发明提供的枯草芽孢杆菌SNBS-6可用于制备饲料添加剂、食品、保健品或药品，还可用于工业生产胞外多糖以及以胞外多糖为原料的其他原料，如纤维素、藻酸盐、黄原胶、结冷胶等，广泛应用于畜牧业、食品加工业、医药行业，应用前景广阔。

附图说明

图1为枯草芽孢杆菌SNBS-6的革兰氏染色镜检图(A)和菌落形态图(B)；

图2为枯草芽孢杆菌SNBS-6凝胶电泳条带图；

图3为枯草芽孢杆菌SNBS-6基于16S rDNA基因序列的系统进化树；

图4为枯草芽孢杆菌SNBS-6产胞外多糖的DEAE-52阴离子交换柱层析图(A)和G-100凝胶柱层析图(B)；

图5为枯草芽孢杆菌SNBS-6产纯胞外多糖的紫外光谱图；

图6为枯草芽孢杆菌SNBS-6产纯胞外多糖的高效液相色谱图(A、B)和单糖标品高效液相色谱图(C)；

图7为枯草芽孢杆菌SNBS-6产纯胞外多糖的傅里叶红外光谱图A和B；

图8为枯草芽孢杆菌SNBS-6产纯胞外多糖的¹H NMR谱图(A)和¹³C NMR(B)；

图9为枯草芽孢杆菌SNBS-6产纯胞外多糖的扫描电镜图，标尺:100μm(A)；标尺:10μm(B)；

图10为枯草芽孢杆菌SNBS-6产胞外多糖的热力学稳定性分析图；

图11为枯草芽孢杆菌SNBS-6产胞外多糖对HepG2的抑制作用结果；

图12为枯草芽孢杆菌SNBS-6产胞外多糖对HepG2作用的倒置显微镜观察结果图；

图13为结晶紫染色效果图；

图14为划痕试验效果图；

图15为流式细胞仪分选HepG2凋亡率结果图；

图16为HepG2细胞凋亡周期结果图；

图17为Caspase-3和Caspase-9的活性测定结果图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中所使用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明实施例中用到的培养基配方如下：

LB固体培养基：10g胰蛋白胨、5g酵母浸粉、10g氯化钠、1000mL蒸馏水、20g琼脂粉、pH值7.2-7.4。

LB液体培养基：10g胰蛋白胨、5g酵母浸粉、10g氯化钠、1000mL蒸馏水、pH值7.2-7.4。

下面结合实施例，对本发明作进一步阐述。

实施例1菌株的分离筛选

1、筛选样品

实验样品为从辽宁省12个不同地区(锦州、沈阳、庄河、本溪、大连、公主岭、丹东、葫芦岛、铁岭、鞍山、辽中和辽阳)收集的192份自然发酵豆酱样品。

2、芽孢杆菌初筛

无菌条件下，准确称取0.5g豆酱样品至4.5mL灭菌后冷却至常温的生理盐水中，涡旋震荡使其充分混合均匀，置于80℃水浴锅中加热20min，因芽孢具有较好的耐热性，所以80℃可以杀死豆酱中不耐热的微生物。之后取此原液0.5mL至4.5mL生理盐水中，每次稀释十倍，稀释到原溶液的10^-6，取10^-4，10^-5，10^-6稀释度的样品100μL至LB固体培养基中心，用涂布棒涂布均匀。将平板倒放至37℃恒温培养箱中培养20-30h。在平板上挑取具有芽孢杆菌菌落形态的单菌落，平板划线培养。重复挑取3-4次，直至获得单菌落，纯菌株为止。

通过形态观察，革兰氏染色，申请人共筛选获得67株芽孢杆菌。

3、产多糖能力复筛

将初筛获得的67株芽孢杆菌分别加至LB液体培养基中进行活化，30-37℃培养12-24h，之后再次加至LB液体培养基中进行传代培养，培养2代之后，10000xg离心10-15min去除菌体，采用数字粘度计和糖度计分别对上清液进行粘度和糖含量测定。

结果表明，初筛获得的67株芽孢杆菌中有10株产粘能力较强，产糖量较高，分别为：丹东(DD)样品中的3株、辽阳(LY)样品中的3株、辽中(LZ)样品中的2株、本溪(BX)样品中的2株。

申请人进一步利用苯酚硫酸法对上述产粘和产糖能力较强的10株芽孢杆菌分别进行多糖含量检测，根据苯酚硫酸法标准曲线计算得到各个芽孢杆菌菌株发酵液中胞外多糖的含量。

葡萄糖标准曲线的建立：准确称取制作标准曲线的葡萄糖100mg定容至100mL容量瓶；摇匀得到1mg/mL的葡萄糖溶液。再吸取5mL至50mL容量瓶中，定容摇匀后得到0.1mg/mL的葡萄糖标准溶液。取8支洗干净烘干的试管，分别吸取0.1mg/mL的葡萄糖标准溶液0mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL于每支试管中，每支试管再用去离子水补足至1mL。在各个试管中分别加入1mL 6％新制苯酚溶液，摇匀后迅速加入5mL浓硫酸，混匀后，室温下静置30min，在490nm波长下测定各试管中溶液的吸光度值，并以不同稀释液的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线。试验中根据样品的吸光度值，代入标准曲线方程中计算胞外多糖产量。葡萄糖标准曲线方程为y＝0.0059x+0.01，R2＝0.999，R²大于0.9，且接近1，表明线性较好，可以使用此标准方程。

各菌株发酵液中胞外多糖含量见表1。

表1各菌株发酵液中胞外多糖的产量

由表1的结果可以看出，本发明筛选获得的芽孢杆菌中，LZ13-4菌株发酵液中胞外多糖的含量最高，达2.16mg/mL，取得了意料不到的技术效果。

实施例2 LZ13-4菌株的鉴定

1、菌落形态鉴定

本发明所述LZ13-4菌株菌落呈乳白色，不透明，表面有褶皱,粘稠，边缘不整齐；革兰氏染色呈阳性，短杆菌。镜检图和菌落平板形态图如图1和图2所示

2、生理生化特性

对菌株进行生理生化特征试验鉴定：糖发酵试验；过氧化氢酶试验；明胶液化试验；产氨试验；葡萄糖产酸产气试验；硫化氢试验；吲哚试验；运动性检测试验。

3、分子生物学鉴定

(1)细菌DNA提取：

吸取100μL LZ13-4菌株的菌悬液于灭菌后的LB液体培养基中，在37℃振荡培养箱中培养24h。按照细菌基因组试剂盒(Solarbio D1600)上的操作步骤提取该菌株的基因组。

(2)PCR扩增：

设计PCR上游引物27F和下游引物1492R，由上海生工生物工程股份有限公司合成。

27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG(5'---3')；

1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT(5'---3')。

PCR反应条件为：95℃预热5min，94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸1min20s，循环36次；72℃保持8min，4℃保温。

(3)PCR产物的检测：

得到的扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳后检测，得到片段长约为1500bp的条带。电泳条带如图2所示。

(4)16S rDNA测序及序列比对

16S rDNA序列分析经细菌基因组DNA提取，PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳，条带清晰则代表提取的DNA质量较好，可以检测DNA序列，将得到的DNA样品送至上海生工生物股份有限公司进行测序，将返回来的测序结果与NCBI数据库比对，得到菌株的种属结果，16SrDNA基因序列的系统进化树如图3所示。本发明所述LZ13-4菌株与枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的同源性最高。

综上，结合LZ13-4菌株的菌落形态、生理生化性特性以及分子生物学鉴定结果，可以得出结论，LZ13-4菌株为一株新型的枯草芽孢杆菌，将其命名为枯草芽孢杆菌SNBS-6(Bacillus subtilis SNBS-6)。

申请人已于2021年08月12日将所述枯草芽孢杆菌SNBS-6(Bacillus subtilisSNBS-6)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCCNo.23141。

实施例3枯草芽孢杆菌SNBS-6在生产胞外多糖中的应用

1、培养基配方

LB基础培养基：10g胰蛋白胨、5g酵母浸粉、10g氯化钠、1000mL蒸馏水，pH值7.0-7.4。

产糖培养基：10g胰蛋白胨、5g酵母浸粉、10g氯化钠、1000mL蒸馏水、20g蔗糖，pH值7.0-7.4。

2、摇瓶发酵方法

将枯草芽孢杆菌SNBS-6菌株接入50mL LB基础培养基中，32-37℃恒温培养箱中活化16-24h，制备种子液一代；按2％接种量将种子液一代接种于100mL LB基础培养基中制备种子液二代，37℃恒温培养箱中培养16-24h；按2-5％接种量将种子液二代接种于1L产糖培养基中，32-37℃下在摇床中以160r/min转速摇瓶发酵36-48h。之后的发酵液既用于离心提取粗多糖。

枯草芽孢杆菌SNBS-6发酵液含菌量测定结果为1.6×10⁹个/mL，胞外多糖产量为3.04g/L。

实施例4枯草芽孢杆菌SNBS-6产胞外多糖的制备

1、胞外粗多糖的提取分离与纯化

将枯草芽孢杆菌SNBS-6发酵液于4℃，10000-12000xg条件下离心10-15min，沉淀为枯草芽孢杆菌菌体，上清液为发酵产生的代谢产物。去沉淀，向上清液中加入3倍体积的无水乙醇，然后放入4℃冰箱中静置12-24h后，多糖不溶于乙醇，故析出，沉淀在底部。继续以4℃，10000-12000xg离心10-15min，收集多糖沉淀。再利用多糖溶于水的特点，加入适量蒸馏水，使沉淀完全溶解，成为稳定均一的溶液。

加入Sevage溶液，多糖溶液与Sevage溶液体积比为5:1，然后在4℃，10000-12000×g条件下离心10-15min去除蛋白，上清液为所需的较纯的多糖溶液。由于Sevage溶液去除效果不佳，需要多次重复去除蛋白质。将收集到的上清液旋蒸，去除残留的有机溶剂。向得到的溶液中再次加入3倍体积的无水乙醇，12-24h后得到多糖沉淀。进一步采用透析的方法完全去除多糖沉淀中含有的少量小分子杂质。最后通过冷冻干燥机干燥得到枯草芽孢杆菌SNBS-6的胞外粗多糖。

此时的粗多糖可能含有不同的胞外多糖，故还需进一步的分离。首先，将粗多糖样品加到填料为DEAE-Cellulose 52的快速流动色谱柱中并用不同浓度的NaCl进行洗脱。根据峰的个数确定多糖的种类。

结果如图4(A)所示，枯草芽孢杆菌SNBS-6粗多糖在经过DEAE-Cellulose 52分离后，出现两个主要峰，确定为两个多糖组分。按出峰顺序分别命名为EPS-1和EPS-2。EPS-1和EPS-2是在盐浓度0.1mol/L和0.3mol/L下洗脱出来，推测可能是酸性多糖。

将DEAE-Cellulose 52纯化出来的两个组分EPS-1和EPS-2，用Sephadex G100凝胶柱进一步纯化，结果如图4(B)所示，EPS-1和EPS-2均为单一峰，说明枯草芽孢杆菌SNBS-6产的胞外多糖被成功分离纯化。

本发明提供的枯草芽孢杆菌SNBS-6纯化后的胞外多糖EPS-1、EPS-2的得率分别为40.2％和10.3％。

2、多糖纯度测定

称取少量去除蛋白后的多糖粉末溶于水，进行全波长紫外扫描，范围为180-400nm。如果在260-280nm波长范围内没有吸收峰，则证明，此时的多糖里的蛋白质已经完全去除，不必再用Sevage溶液再次去除蛋白质。以此来对多糖纯度进行判定。

结果如图5所示，枯草芽孢杆菌SNBS-6产胞外多糖在260nm、280nm波长处没有紫外特征吸收峰，保证了一定的纯度。

3、多糖的结构表征

采用高效液相色谱方法鉴定上述胞外多糖EPS-1和EPS-2的单糖组成。结果如图6所示，枯草芽孢杆菌产胞外多糖EPS-1和EPS-2含有单糖种类并不相同，其中：EPS-1主要由果糖、葡萄糖和半乳糖组成；EPS-2主要由果糖构成，并含有少量甘露糖、葡萄糖和半乳糖。

红外光谱结构分析结果如图7所示，枯草芽孢杆菌产胞外多糖EPS-1和EPS-2具有典型多糖结构的基本骨架和官能团，并推测EPS-1主要是由吡喃糖构成，EPS-2主要是由呋喃糖构成。

核磁共振法结构分析结果如图7所示，EPS-1是由葡萄糖、果糖和半乳糖组成的多聚糖链，其中果糖为主要成分；EPS-2是主要由果糖以β-1，6-糖苷键组成果聚糖链，无分支，但含有少量的葡萄糖、甘露糖和半乳糖残基。

扫描电镜结果如图9所示，EPS-1和EPS-2两种多糖在结构上存在明显区别。EPS-1在1.00k倍数下呈现许多分支，在5.00k倍数下表面不平；与EPS-1相比，EPS-2在1.00k倍数下较为平整，整体呈现出薄板片状，在5.00k倍数下表面粗糙有凸起。

实施例5枯草芽孢杆菌SNBS-6产胞外多糖的物理性质

1、胞外多糖热力学性能测定

热力学分析是记录随温度升高样品重量降低的过程。它可以探究样品在高温状态下的稳定性。多糖稳定性好能增加其在工业应用的可能性。

测量干燥的胞外多糖样品随温度升高至800℃其质量变化情况。

结果如图10显示，本发明提供的枯草芽孢杆菌SNBS-6产胞外多糖最快降解速率远大于工业加工所需温度，完全可以适应工业热加工。

2、胞外多糖保湿性分析测定

精密称取胞外多糖样品三份，每份约1g，放入到称量瓶中，称量多糖和称量瓶的总质量并记录。然后置于恒湿环境中，相对湿度43％的碳酸钠饱和溶液的密闭环境中。分别在3h、6h、12h、24h、36h、48h、60h、72h称量其质量。以上述同样的操作在相对湿度81％的饱和硫酸铵溶液的密闭环境中处理样品。

吸湿率(％)＝(W_n–W₀)/W₀×100。

其中，W₀为放置前的多糖加上称量瓶的总质量，W_n为吸湿不同时间点的质量。

结果显示，本发明提供的枯草芽孢杆菌SNBS-6产胞外多糖具有良好的保湿效果，具有良好的成膜性从而减少水分蒸发。由于其纯天然，无毒副作用，是良好的化妆护肤品添加成分。

实施例6枯草芽孢杆菌SNBS-6产胞外多糖的抗氧化能力

1、胞外多糖DPPH自由基清除实验

取2mL多糖样品溶液于试管中，加入2mL 0.2mmol/L的DPPH甲醇溶液混合均匀，室温下避光反应1h，517nm处测定吸光值。空白组以等体积甲醇代替DPPH溶液，对照组以等体积无菌水代替样品溶液。以VC作阳性对照。DPPH自由基清除率公式为：

DPPH自由基清除率(％)＝[1－(A₁－A)/A₀]×100％。

式中：A为空白组的吸光度；A₀为对照组的吸光度；A₁为样品组的吸光度。

2、胞外多糖羟自由基(·OH)清除实验

采用Fenton法测定菌株对羟自由基的清除作用。Fenton反应体系：1mL0.435mmol/L的亮绿，2mL 0.5mmol/L的硫酸亚铁，1.5mL 3％(w/v)的过氧化氢。向Fenton反应体系中加入1mL不同浓度的多糖样品，混合均匀后，37℃恒温水浴20min，4℃、8000xg离心10min，取上清液，用分光光度计测定624nm处吸光值。以VC作阳性对照。羟自由基清除率计算公式：

清除率(％)＝[(A₁－A₀)/(A－A₀)]×100。

式中：A₁为Fenton试剂+样品+亮绿溶液体系的吸光度；A₀为Fenton试剂+亮绿的溶液体系吸光度；A为仅含亮绿溶液的吸光度。

3、胞外多糖清除超氧阴离子自由基测定

25℃条件下，取50mmol/L、pH 8.2(含1mmol/L的EDTA)的Tris-HCl缓冲溶液3mL，加入25mmol/L邻苯三酚10μL，迅速混匀，置于石英比色杯中，在325nm处每隔30s测定一次吸光值，反应4.5min结束，控制自氧化速率在吸光值每分钟变换0.07。以吸光值对时间作图，斜率即为邻苯三酚自氧化速率A0。在3mL Tris-HCl缓冲液中入加适量样品，同样方法测样品的邻苯三酚自氧化速率A1。以VC作阳性对照。超氧阴离子清除率计算公式：

清除率(％)＝[(A₀－A₁)/(A₀)]×100。

式中：A₀是以吸光度对时间作图的斜率，即邻苯三酚自氧化速率；A₁是同样方法测得样品的邻苯三酚自氧化速率。

4、胞外多糖还原能力的测定

采用铁氰化钾法。取1mL样品于试管中，加入0.2mol/L pH 6.6的PBS及1％的铁氰化钾溶液各1mL，混匀。50℃水浴反应20min，骤冷。再加入1mL 5％三氯乙酸，4000r/min离心5min，取上清液2.5mL，加入蒸馏水2.5mL、0.1％三氯化铁0.5mL，摇匀，静置反应10min后，于700nm处测定吸光值。A700nm值越大，代表还原能力越强。以VC作阳性对照。

5、胞外多糖清除ABTS·+自由基测定

以7mmol/L的ABTS溶液与2.45mmol/L的过硫酸钾混合溶液配制ABTS自由基的阳离子工作液。准确吸取0.5mL多糖样品溶液与3.9mL工作液，混合后静置，23℃反应6min，然后在734nm波长处测定其吸光值，以蒸馏水作为空白对照。不同多糖清除ABTS自由基的能力以每克干样抗氧化能力相当于Trolox的浓度(TEAC)来计算，单位为μmol/g(TEAC)。

本发明所述枯草芽孢杆菌SNBS-6产胞外多糖EPS-1和EPS-2的抗氧化数据详见表2。

表2胞外多糖EPS-1和EPS-2的抗氧化能力分析

从表2的数据可以看出，本发明提供的枯草芽孢杆菌SNBS-6产胞外多糖EPS-1和EPS-2具有很强的抗氧化能力，对DPPH、ABTS·+、·OH和超氧阴离子自由基的清除率达到56.98％-93.55％，取得了意料不到的技术效果。

实施例7枯草芽孢杆菌SNBS-6产胞外多糖对人肝癌HepG2细胞的抑制作用

1、人肝癌HepG2细胞的复苏及传代

从液氮罐中取出HepG2细胞，37℃快速溶化。离心，去除上清并向细胞沉淀中加入培养基，混匀后转入细胞培养瓶中，置于37℃、5％CO₂下培养，待细胞几乎长满培养瓶，进行传代操作。首先将旧培养基倒掉，PBS溶液清洗两次，然后加入胰酶，细胞松动后，去除胰酶，沿壁加入培养基，自下往上吹打使贴壁的细胞完全脱落，收集细胞，用培养液稀释混匀后转入新的培养瓶进行传代培养。

2、胞外多糖对人肝癌HepG2细胞的抑制作用

胞外多糖对肝癌HepG2细胞的抑制作用试验采用MTT法测定。

对细胞进行消化后，将其稀释为1×10⁵细胞/mL的细胞悬液，然后以100μL/孔的添加量分别加入96孔板中，培养24h。吸除培养液，向其中加入不同浓度的纯化后的多糖溶液(0、50、100、200、400、600、1 000和2 000μg/mL)并用空白组做对照。培养1d、2d、3d后，向其中加入MTT以及DMSO，静置10min后，在570nm处的波长下测定吸光值。

细胞抑制率计算公式如下：

抑制率(％)＝[1-(A_sample-A₀)/(A_blank-A₀)]×100。

式中：A_sample为添加多糖样品EPS 1和EPS 2的吸光度；A_blank为不添加多糖样品EPS1和EPS 2的吸光度；A₀为不添加细胞也不添加多糖样品EPS1和EPS 2的吸光度。

结果如图11显示，胞外多糖EPS-1和EPS-2对HepG2细胞的增殖抑制作用呈正向剂效相关性，EPS-1和EPS-2浓度越高，抑制效果越明显。枯草芽孢杆菌SNBS-6产胞外多糖浓度较低时抑制作用并不明显，当浓度达到800μg/mL，能显著抑制肝癌细胞生长。

3、倒置显微镜观察细胞形态及数量变化

将细胞消化计数后置于24孔板中，细胞贴壁后分别加入相同体积含有不同浓度EPS-1(200、400、800μg/mL)和EPS-2(200、400、800μg/mL)的培养基，置于培养箱中，48h后置于倒置显微镜下观察。

结果如图12显示，经EPS作用48h过后，可以明显观察到细胞随多糖浓度增大，数量逐渐减少，细胞间的距离增大，细胞在高浓度多糖溶液下缩小。这说明枯草芽孢杆菌SNBS-6产胞外多糖伤害了肝癌细胞，均具有明显的抑癌效果，与剂量呈现正相关性。

4、荧光显微镜观察细胞死亡比例

细胞消化计数后转移至6孔板，细胞贴壁后分别加入相同体积含有不同浓度EPS-1(200、400、800μg/mL)和EPS-2(200、400、800μg/mL)的培养基，置于培养箱中培养48h后按照AO/EB染色试剂盒说明书步骤处理细胞。将处理好的细胞置于载玻片上，封片，在荧光显微镜下观察。

结果显示，使用EPS-1，EPS-2培养48h后，观察到表明死亡细胞的颜色开始增多，说明随着枯草芽孢杆菌SNBS-6产胞外多糖浓度的增加，肝癌细胞死亡率增加。

5、细胞克隆试验

细胞消化并计数，以800每孔接种于24孔培养板中然后将孔板放入细胞培养箱中。培养24h后，弃上清，向每孔加入上述含有不同浓度的多糖溶液。然后放入细胞培养箱中继续培养，14天后取出培养板，弃上清，每孔加入1mL预冷的PBS冲洗细胞，再次弃上清后，每孔加入300μL甲醇固定30min。弃上清后，再次加入PBS冲洗细胞。然后每孔加入300μL的结晶紫溶液(0.02g/mL)染色30min。弃去结晶紫溶液后，每孔加入适量的PBS，清洗，重复3次，将培养板放于阴凉避光处晾干。显微镜下进行细胞克隆计数，细胞团内细胞数大于50个记为1个克隆。

结果如图13显示，随着多糖浓度的增加，每个孔中紫色逐渐变淡，说明随着枯草芽孢杆菌SNBS-6产胞外多糖浓度的增加，肝癌细胞活细胞逐渐减少。

6、划痕擦伤迁移试验

细胞消化并计数，调整细胞浓度，以2×10⁴/孔接种于24孔培养板中，然后放入细胞培养箱中继续培养，直到细胞融合度接近90％时，使用1mL无菌枪头在24孔板每个孔中间部分，笔直的刮出划痕。用PBS洗去被刮下的细胞，向每孔加入上述含有不同浓度的多糖溶液。在倒置显微镜下观察，拍照记录。将细胞置于的恒温培养箱中继续培养48h后观察细胞迁移情况并照相记录。

结果如图14显示，第一排空白组经过培养48h后基本保持着良好的迁移能力，划痕缝隙变化显著，划痕几近愈合。与空白对照组相比，样品组宽度较大，随浓度增加，宽度越来越大。划痕48h后与实验前相比变化不大，与空白组48h后的相比差距较大。说明枯草芽孢杆菌SNBS-6产胞外多糖能导致肝癌细胞侵袭迁移能力严重丧失。

7、细胞周期分布检测

细胞培养24小时后，用不同浓度(0，200，400和800μg/mL)EPS-1，EPS-2孵育处理48h，然后按照细胞培养周期与细胞凋亡测试盒操作，采用流式细胞仪进行检测。

结果如图15显示，左下区域细胞占比逐渐减少，说明活细胞随胞外多糖浓度的增加而逐渐减少，死细胞逐渐增加。说明枯草芽孢杆菌SNBS-6产胞外多糖导致了肝癌细胞的凋亡及死亡，具有抑制肝癌细胞增殖的作用。

8、细胞凋亡率检测

细胞培养24小时后，用不同浓度(0，200，400和800μg/mL)EPS-1和EPS-2孵育处理48h，然后按照Annexin V-FITC细胞凋亡试剂盒说明书操作后立即采用流式细胞仪进行检测。

结果如图16显示，随着多糖浓度的增加，处于G2期细胞明显减少，细胞有丝分裂受到干扰，细胞几乎无法正常完成增殖。G2期细胞数目的减少根本原因是由于前期细胞受到了阻滞，也就是细胞在G1或S期受到胞外多糖的干扰，无法完成正常的DNA复制，无法进行正常的有丝分裂。

其中，低浓度EPS-1作用于细胞时S期比例增高，说明主要是S期阻滞导致G2期的细胞减少，细胞无法进行有丝分裂。而高浓度EPS-2作用于细胞时，G1期显著升高，说明主要是G1期发生阻滞。且随着EPS-2浓度增加，G1期明显增多，S期细胞与空白对照组相比变化不大。在800μg/m时，G1期增至73.9％，G2期降低至1.11％，作用效果明显。因此，枯草芽孢杆菌SNBS-6产胞外多糖EPS-2主要作用于G1期。

9、Caspase-3和Caspase-9的测定

细胞培养48h后，用不同浓度(200，400和800μg/mL)EPS-1和EPS-2孵育处理48h，将PBS清洗过的细胞每孔添加200μL RIPA裂解液和20μL蛋白抑制剂，4℃放置15min，按试剂盒说明书操作提取总蛋白，并根据试剂盒利用酶标仪测定405nm处的OD值通过计算OD样品/OD空白对照来计算Caspase活化程度。

结果如图17显示，当胞外多糖作用于HepG2细胞时，Caspase-3和Caspase-9含量与空白实验组相比均显著增加，表明枯草芽孢杆菌SNBS-6产的两种胞外多糖均能显著提高凋亡蛋白的表达，诱导细胞凋亡，实现抑制癌细胞增殖的效果。

综上所述，本发明提供的枯草芽孢杆菌SNBS-6产胞外多糖对人肝癌细胞HepG2具有明显的抑制效果，抗癌效果极好，具有应用于治疗肝癌药物开发的潜力。

实施例8利用枯草芽孢杆菌SNBS-6制备抗肝癌保健益生菌粉

1、枯草芽孢杆菌SNBS-6菌泥的制备

将枯草芽孢杆菌SNBS-6接种于50mL LB基础培养基中，32-37℃培养箱中培养12-24h。再按2％的接种量于250mL LB液体培养基中二次活化，放置32-37℃培养箱中培养12-24h。最后将活化好的枯草芽孢杆菌SNBS-6以5％接种量于10L发酵罐中进行高密度厌氧培养，于37℃、pH6.0的条件下培养12-24h，得到发酵液。10000xg、4℃离心10-15min，弃上清，收集菌体沉淀，用pH7.0的无菌磷酸盐缓冲液漂洗菌体1次，即得到枯草芽孢杆菌SNBS-6菌泥。

2、冻干保护剂的制备

冻干保护剂含有10％的脱脂乳粉，5％的乳糖，2％的谷氨酸钠，2％的甘油，水作为溶剂，于105℃灭菌5min。

3、冻干菌粉的制备

将上述制备的枯草芽孢杆菌SNBS-6菌泥以1:5的比例与保护剂溶液充分搅拌混匀。混合液于-80℃条件下预冻5h，使其均匀冻结在容器内壁上。放入真空冷冻干燥箱干燥20h后，得到冻干菌粉。平板计数得冻干粉中活菌数为3.6×10⁸CFU/g。

4、抗肝癌保健益生菌粉的制备

按重量份分别称取枯草芽孢杆菌SNBS-6冻干菌粉8-10份、低聚果糖25-30份、麦芽糊精15-20份、橘子粉20-25份、木糖醇5-10份、菊粉15-20份，混匀，即得抗肝癌保健益生菌粉。

5、抗肝癌保健益生菌粉的使用效果

本发明所述益生菌粉可通过温水冲服食用，能明显缓解由肝癌引起的脸色发黄，显著提高肝癌患者的免疫力，延长生存期。所述益生菌粉抗氧化活性高，长期食用，还可有效预防肝癌的发生。

本发明所述枯草芽孢杆菌SNBS-6可直接用于制备饲料添加剂、食品、保健品或药品，还可用于工业生产胞外多糖以及以胞外多糖为原料的其他原料，如纤维素、藻酸盐、黄原胶、结冷胶等，广泛应用于畜牧业、食品加工业、医药行业，应用前景广阔。

Claims (10)

1.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌的保藏号为CGMCC No.23141。

2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在胞外多糖生产中的应用。

3.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在制备饲料添加剂、食品、保健品或药品中的应用。

4.一种发酵生产胞外多糖的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：

(1)将权利要求1所述的枯草芽孢杆菌接种于培养基中进行发酵，得发酵液；

(2)将发酵液离心，得上清液；

(3)将上清液中加入至少3倍体积的无水乙醇，静置；

(4)离心，收集沉淀，即为胞外多糖。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的培养基中各组分及其含量分别为：胰蛋白胨10g/L、5g酵母浸粉5g/L、氯化钠10g/L、蔗糖20g/L；所述的发酵条件为：发酵温度32-37℃，发酵pH7.0，摇床转速160r/min，发酵时间36-48h。

6.一种胞外多糖，其特征在于，所述胞外多糖是通过权利要求4或5所述方法制备得到的。

7.权利要求6所述的胞外多糖在化妆品、食品、保健品或药品生产中的应用。

8.一种抗肝癌保健益生菌粉，其特征在于，所述益生菌粉中各组分及重量份数分别为枯草芽孢杆菌冻干菌粉8-10份、低聚果糖25-30份、麦芽糊精15-20份、橘子粉20-25份、木糖醇5-10份、菊粉15-20份。

9.如权利要求8所述的益生菌粉，其特征在于，所述益生菌粉中枯草芽孢杆菌冻干菌粉的制备方法，包括如下步骤：

(1)枯草芽孢杆菌菌泥的制备

将枯草芽孢杆菌接种于50mL LB基础培养基中，32-37℃培养12-24h；再按2％的接种量于250mL LB液体培养基中二次活化，32-37℃培养12-24h；最后将活化好的枯草芽孢杆菌以5％接种量于10L发酵罐中进行高密度厌氧培养，于37℃、pH6.0的条件下培养12-24h，得到发酵液；10000xg、4℃离心10-15min，弃上清，收集菌体沉淀，用pH7.0的无菌磷酸盐缓冲液漂洗菌体1次，即得到枯草芽孢杆菌菌泥；

(2)冻干保护剂的制备

冻干保护剂包含质量体积比为10％的脱脂乳粉，5％的乳糖，2％的谷氨酸钠，2％的甘油，以水作为溶剂，于105℃灭菌5min；

(3)冻干菌粉的制备

将枯草芽孢杆菌菌泥以1:5的质量体积比与保护剂溶液充分搅拌混匀；混合液于-80℃条件下预冻5h，使其均匀冻结在容器内壁上；放入真空冷冻干燥箱干燥20h后，得到冻干菌粉。

10.如权利要求8或9所述的益生菌粉，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌冻干菌粉中活菌数至少为10⁸CFU/g。

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