CN114573727B - 海参岩藻多糖及其制备方法和在制备防治由幽门螺杆菌引起的疾病的药物和保健品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了海参岩藻多糖及其制备方法和在制备防治由幽门螺杆菌引起的疾病的药物和保健品中的应用。所述海参岩藻多糖制备方法简单，其包含95.5%岩藻糖和4.5%葡萄糖两种单糖，具有由(1→3)‑α‑L‑Fucp连接的岩藻糖组成的四糖重复单元。本发明首次验证了多种海参岩藻多糖在体外均具有直接抑制幽门螺杆菌活性，其来源丰富，安全性高，在开发具有根除幽门螺杆菌活性的药物和保健品方面具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及药品和保健品领域，具体涉及海参岩藻多糖及其制备方法和在制备防治由幽门螺杆菌引起的疾病的药物和保健品中的应用。
背景技术
幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）具有广泛的致病因子谱，可以在胃的酸性环境中生存并在胃粘膜上定植。临床表现、慢性胃炎的复发率、消化性溃疡、癌前的发展与其在胃粘膜定植的程度有直接关系。Hp感染率在全球范围内达到50%左右，而我国平均感染率却高达59%。由于Hp对一些用于抗菌药物具有耐药性且抗菌药物往往伴随许多副作用，给医学科学带来了严重的问题。尽管与抗生素相比，天然产品的效果相对较弱，但其相对安全性远高于药物治疗。因此，天然活性产物已成为根除Hp在胃肠道中的定植、降低胃肠道炎症等疾病发病率的重要候选产品。
岩藻多糖是一种海洋中独有的水溶性硫酸多糖，其主要活性基团为硫酸基和岩藻糖，具有抗氧化、抗病毒、抗凝血、抗肿瘤和抗感染等生物活性。研究证实岩藻多糖能抑制Hp与胃黏膜上皮细胞粘附。但目前的产业化研究集中在海带、裙带菜、墨角藻和巨藻等海洋褐藻中的岩藻多糖，针对海洋动物来源的岩藻多糖产业化生产尚处于探索阶段。
海参体壁和内脏富含海参多糖，约占海参总有机物干重的6%，主要为海参岩藻多糖和海参硫酸软骨素。这两种多糖有相似之处，都含有30%左右的硫酸酯基类多糖，这是海参多糖区别于其他多糖独有的结构，与海藻岩藻多糖相比其结构更加独特、功能活性更强大。据报道，用传统的热水方法加工的即食海参中多糖的保留率低于40%，这表明超过60%的多糖在蒸煮液中损失。目前，海参加工过程中产生的蒸煮液、海参肠等副产物含有较多的海参岩藻多糖，尚未得到精深加工和功能性产品开发利用。因此，探讨海参加工副产物中岩藻多糖的制备关键技术及其清除Hp在胃部的定植功能，将有利于充分发掘和利用海参岩藻多糖这一天然多糖宝贵资源，对提高海参养殖和加工行业的附加值，实现我国海参精深加工和综合利用，提升其医用食品、保健品和海洋药物行业水平具有重大意义。
发明内容
本发明为了解决现有技术中的缺陷和不足，提供了海参岩藻多糖及其制备方法和在制备防治由幽门螺杆菌引起的疾病的药物和保健品中的应用。所述的多种海参岩藻多糖经分离纯化后，均在体外有明显抑制幽门螺杆菌活性的作用。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了海参岩藻多糖或其药学上可接受的盐，其化学结构式如式（Ι）所示：
（Ι）；
其中X为羟基、硫酸基团、被取代的或未被取代的具有1-8个碳原子的磺酸基团；Y为羟基、硫酸基团、被取代的或未被取代的具有1-8个碳原子的磺酸基团。
进一步的，所述海参岩藻多糖具体为：
进一步的，所述海参岩藻多糖的分子量为10 KDa -100 KDa；具有由-(1→3)-α-L-Fucp连接的岩藻糖组成的四糖重复单元；所述四糖重复单元为：→3)-α-L-Fucp-(1→3)-α-L-Fucp-(1→3)-α-L-Fucp-(1→3)-α-L-Fucp-(1→。
进一步的，所述海参岩藻多糖中硫酸基团位于→3)-α-L-Fucp-(1→的C-2和/或C-4位。
进一步的，所述海参岩藻多糖中单糖组成包括岩藻糖和葡萄糖，其中岩藻糖的质量比为90%-100%。
进一的，所述海参岩藻多糖的单糖组成包含质量百分比为95.5%的岩藻糖和质量百分比为4.5%的葡萄糖。
本发明还提供了所述的海参岩藻多糖的制备方法，包括以下步骤：
（1）向海参糖肽粉中加入3倍体积的0.1 mol/L乙酸钠缓冲溶、蛋白酶、5 mmol/LEDTA溶液和5 mmol/L半胱氨酸溶液，调节pH=6，置于55 ℃-65 ℃下搅拌反应10-15 h；100℃，15 min灭酶后离心，收集上清和沉淀；
（2）将步骤（1）的沉淀加入蛋白酶进行二次酶解，条件同步骤（1），收集上清；
（3）合并步骤（1）和步骤（2）的上清液，并加入1倍体积的10%十六烷基氯化吡啶溶液混合，室温反应24 h后，将混合物离心弃上清，沉淀溶解于3 mol/L NaCl：乙醇（100:15，v/v）溶液中，加入4倍体积的95%乙醇溶液，4℃放置24 h，离心收集沉淀；将上清加入至终体积60%的乙醇，4℃放置24 h，离心收集沉淀；
（4）利用80%和90%乙醇对步骤（3）的沉淀进行脱水处理，55℃烘干得到固体粉末；
（5）将步骤（4）中的固体粉末溶于纯水置于透析袋进行脱盐处理，透析完成后，溶液经旋蒸、冻干得到海参粗多糖；
（6）将步骤（5）的海参粗多糖利用Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱和Sephacryl S-300凝胶柱进行分离纯化，得到海参岩藻多糖。
进一步的，所述蛋白酶为木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、菠萝蛋白酶的一种或多种。
进一步的，所述步骤（5）中的透析袋的截留分子量为3500 Da-10000 Da。
进一步的，所述步骤（6）中Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱的长度为40 cm，直径为3.5cm，洗脱条件是0 mol/L、0.2 mol/L、0.4 mol/L、0.8 mol/L和1.0 mol/L NaCl溶液。
进一步的，所述步骤（6）中Sephacryl S-300凝胶柱的长度为100 cm，直径为2.5cm，洗脱条件是0.2 mol/L NH4HCO3溶液，流速为0.3 mL/min。
本发明还提供了海参岩藻多糖在制备防治由幽门螺杆菌引起的疾病的药物和保健品中的应用。
进一步的，所述海参岩藻多糖在体外具有抑制幽门螺杆菌的活性，且活性优于海带岩藻多糖。
进一步的，所述海参岩藻多糖抑制幽门螺杆菌的有效剂量≥1.25 mg/mL。
优选的，所述海参岩藻多糖体外抑制幽门螺杆菌活性的最佳有效剂量为0.04 g/mL。
进一步的，所述海参岩藻多糖来源于象牙参、大乌爪参、美国肉参、刺参、石参、赤瓜参、黑参。
进一步的，所述象牙参岩藻多糖和大乌爪参岩藻多糖体外抑制幽门螺杆菌活性的有效剂量≥5 mg/mL；所述美国肉参岩藻多糖体外抑制幽门螺杆菌活性的有效剂量≥1.25mg/mL。
本发明还提供了一种药物或保健品，所述药物或保健品用于抑制、清除或根除幽门螺杆菌，其包含不少于1.25 mg/mL的海参岩藻多糖。
进一步的，所述海参岩藻多糖中包含象牙参岩藻多糖、大乌爪参岩藻多糖和美国肉参岩藻多糖中的一种或多种。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果在于：
（1）本发明所述的海参岩藻多糖提取自海参加工蒸煮液中回收的脱盐脱脂糖肽粉，来源丰富，使用安全，有利于充分发掘和利用海参岩藻多糖这一天然多糖宝贵资源，对提高海参养殖和加工行业的附加值。
（2）本发明所述的海参岩藻多糖通过多重酶解法结合质谱、光谱等技术，阐明了其结构为：→3)-α-L-Fucp-(1→3)-α-L-Fucp-(1→3)-α-L-Fucp-(1→3)-α-L-Fucp-(1→，硫酸基团位于→3)-α-L-Fucp-(1→的C-2和/或C-4位。
（3）本发明首次验证了多种来源于海参的岩藻多糖在体外均具有直接抑制幽门螺杆菌活性的作用，效果优于海带岩藻多糖。
附图说明
图1是葡萄糖标准曲线图。
图2是海参粗多糖Q-Sepharose Fast Flow分离图。
图3是海参岩藻多糖在Shodex OHpak SB-803HQ色谱柱上的高效凝胶渗透色谱图和分子量标准曲线图。
图4是海参岩藻多糖的单糖组成分析图。
图5是幽门螺杆菌的菌落特征和镜检图；(A) 幽门螺杆菌生长情况；(B) 幽门螺杆菌菌落特征；(C) 显微镜下幽门螺杆菌形状。
图6是幽门螺杆菌的扫描电子显微镜图；(A) 放大2000倍；(B) 放大5000倍；(C)放大20000倍。
图7是幽门螺杆菌的生化实验结果图和生长曲线图；(A) 尿素酶实验结果；(B) 氧化酶实验结果；(C) 生长曲线。
图8是海参岩藻多糖和海带岩藻多糖抑菌效果图；(A和B) 海参岩藻多糖抑菌效果图；(C和D) 海带岩藻多糖抑菌效果图。
具体实施方式
结合以下具体实例对本发明的技术方案作进一步详细的说明，但本发明要求保护的范围并不局限于实例表述的范围。
实施例1、海参岩藻多糖的制备
海参岩藻多糖的制备方法如下：
1、海参粗多糖的提取，包括以下步骤：
（1）向海参糖肽粉（100 g）以1：3（W/V）的料液比加入0.1 mol/L乙酸钠缓冲溶、10g木瓜蛋白酶、5 mmol/L EDTA溶液和5 mmol/L半胱氨酸溶液，调节pH=6，置于60℃下搅拌反应12 h，100℃，15 min灭酶后离心，收集上清和沉淀。
（2）将步骤（1）中沉淀加入1%重量的木瓜蛋白酶进行二次酶解，条件同上，收集上清。保存获得的酶解沉淀进行后续小分子肽的分离、纯化以及结构分析与活性研究。
（3）合并步骤（1）和（2）中的上清液，并加入1倍体积的10%十六烷基氯化吡啶溶液（CPC），室温反应24 h后将混合物离心，弃去上清，沉淀溶解于适量3 mol/L NaCl：乙醇（100:15，v/v）溶液中，加入4倍体积的95%乙醇溶液，4℃放置24 h，离心收集沉淀。上清加入至终体积60%的乙醇，4℃放置24 h，离心收集沉淀。
（4）利用80%和90%乙醇对步骤（3）中的沉淀进行脱水处理，55℃烘干得到固体粉末。
（5）将步骤（4）中沉淀溶于纯水中透析（10000 Da）脱盐处理，透析完成后，溶液经旋蒸、冻干得到海参粗多糖。
表1：海参粗多糖和海参糖肽粉的总糖含量
| y = 5.8651x + 0.0454 | 海参粗多糖 0.1mg/ml | 海参糖肽粉 0.1mg/ml |
| 样品OD (490 nm) | 0.5574 | 0.2795 |
| 葡萄糖含量 (mg/ml) | 0.087296039 | 0.039914068 |
| 糖含量 | 0.785664354 | 0.359226612 |
| 糖含量百分比 | 78.57% | 35.92% |
结果如图1和表1所示，海参多糖经提取后总糖含量明显上升至78.57%。
2、海参岩藻多糖的分离纯化
利用Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱和Sephacryl S-300凝胶柱对海参粗多糖进行分离纯化，得到海参岩藻多糖。经Q-Sepharose Fast Flow柱（4.6×20 cm）阴离子交换色谱分离，以0 mol/L、0.2 mol/L、0.4 mol/L、0.8mol/L和1.0 mol/L NaCl 对海参粗多糖进行分级洗脱，自动收集器收集洗脱组分。苯酚-硫酸法检测糖含量并绘制洗脱体积-吸光度曲线。根据洗脱曲线确定合适的NaCl洗脱浓度，进行大量制备，收集合并洗脱液。洗脱液浓缩后经透析，冻干得到电荷密度均一的海参岩藻多糖。将电荷密度均一的海参岩藻多糖用Sephacryl S-300凝胶柱进一步纯化，以0.2 mol/L NH4HCO3为洗脱液，流速为0.3mL/min经自动收集齐收集洗脱液，苯酚-硫酸法检测糖含量，并绘制洗脱曲线，收集曲线峰尖部分，浓缩、减压除氨、冻干得分子量均一精制海参岩藻多糖。
结果如图2所示，采用浓度为0.2 mol/L NaCl对海参岩藻多糖进行大量制备。
实施例2、 海参岩藻多糖的结构鉴定
1、高效凝胶渗透液相色谱法（HPGP）测定纯度及分子量
（1）多糖样品的测定：准确称取实施例1制备的海参岩藻多糖 2mg，加入400 μL0.1mol/L Na2SO4溶液得到5 mg/mL多糖样品，经0.22 μm滤膜过滤。标准品以不同分子量质量的葡聚糖标准品（Mw：5.9、9.6、21.1、47.7、107、200、344、708 kDa）2 mg，加入400 μLNa2SO4溶液配置，得到5 mg/mL的不同分子量标准溶液，经0.22 μm滤膜过滤备用。
（2）色谱条件：分析柱为Shodex Ohpak SB-804HQ；柱流动相：0.1 mol/L Na2SO4溶液；流速：0.5 mL/min；柱温：35℃；进样量：20 μL；检测器：示差检测器。
（3）标准曲线的绘制：以标准品的重均分子量的对数值（log Mw）为纵坐标和保留时间（RT）为横坐标作图，绘制标准曲线并得线形回归方程，根据线形回归方程计算得出样品的重均分子量。
结果如图3所示，海参岩藻多糖显示单一对称峰，说明其分子量分布均一，经计算其分子量为23.36 KDa。
2、高效液相色谱测定海参岩藻多糖的单糖组成
（1）准确称取实施例1制备的海参岩藻多糖2 mg，加400 μL 2mol/L三氟乙酸（TFA）溶液于安瓿瓶内，在105℃密封条件下降解6 h。降解完成后，反复加甲醇除去多余三氟乙酸。
（2）100 μL蒸馏水充分溶解海参岩藻多糖降解产物及单糖标准品，加入100 μL的0.3 mol/L NaOH和120 μL 0.5mol/L的PMP甲醇溶液，70℃水浴60 min。冷却至室温后加入100 μL的0.3 mol/L HCl溶液进行中和反应，用二氯甲烷萃取3次除去未反应的PMP，0.22 μm微孔滤膜过滤上清备用。
（3）利用HPLC测定海参岩藻多糖单糖组成。色谱条件：色谱柱：Eclipse XDB-C18（5μm，4.6 μm×25.0 cm)；流动相：乙腈：磷酸盐缓冲液（pH 6.7）＝17:83 (v/v)；进样体积：10μL；柱温：35℃；检测器：紫外检测器（254 nm）；流速：1.0 mL/min。
结果如图4所示，海参岩藻多糖单糖组成主要为岩藻糖和葡萄糖，二者的百分比分别为95.5%和4.5%。
实施例3、 幽门螺杆菌的复苏培养及特征检测
1、幽门螺杆菌的复苏与培养
将冻存的幽门螺杆菌（Helicobacter pylori SS1，Hp SS1）从-80℃超低温冰箱取出，在室温下溶解后，复苏于含有10%脱纤维羊血的哥伦比亚血琼脂培养基中，在三气培养箱（5% O2、10% CO2、85% N2）培养72 h。
结果如图5所示：在细菌培养3天时观察培养皿上Hp SS1菌落特点（图5A）。典型幽门螺杆菌菌落主要性状特征为直径1～2 mm边缘整齐、圆形、隆起的灰白半透明小菌落，当菌量较多时可形成一层半透明菌苔(图5B)。镜下观察见典型的幽门螺杆菌形态特点为革兰染色阴性、染色深浅不一、大小不均、S形、弧形或短杆状、弯曲样细菌(图5C)。
2、扫描电子显微镜对幽门螺杆菌的形貌表征
样品在2.5%的戊二醛溶液中4℃固定过夜，然后按下列步骤处理样品：
（1）倒掉固定液，用0.1M，pH 7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15 min；
（2）用1%的锇酸溶液固定样品1-2 h；
（3）倒掉固定液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品3次，每次15min；
（4）用梯度浓度（包括30%，50%，70%，80%，90%和95%六种浓度）的乙醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理15 min，再用100%的乙醇处理一次20 min。
（5）制备的样品经冻干处理后放置在带有双面胶的载物台上，通过离子溅射镀膜在其表面镀金，置于SEM扫描观察，电压：5Kv，放大倍数：1000×~20000×。
结果如图6所示，幽门螺杆菌呈短杆状和球状，以球形体为主，并可见U形和不规则形。
3、 幽门螺杆菌的生化鉴定及生长曲线测定
通过氧化酶试验、快速尿素酶试验、过氧化氢酶试验对Hp SS1进行生化试验鉴定。
（1）尿素酶试验：刮取细菌Hp SS1涂抹在尿素酶试纸上，在接触部位出现红色反应即为阳性。
（2）氧化酶试验：刮取细菌Hp SS1涂抹在氧化酶试纸上，在接触部位出现蓝或黑色反应为阳性。
（3）触酶试验：在1张载玻片上滴加1滴5%过氧化氢溶液，刮取些许细菌Hp SS1置入后，有连续的气泡生成即为阳性。
（4）生长曲线测定：挑取鉴定合格的单菌落接种至含有10%胎牛血清的布氏肉汤培养基中，于5% O2、10% CO2、85% N2微需氧条件下培养，测定其生长曲线。
结果如图7所示，Hp SS1尿素酶、氧化酶均呈阳性；此外，触酶试验中，滴加过氧化氢溶液至Hp SS1菌落，有连续的气泡生成，证明其触酶实验为阳性。生长曲线显示（图 7C），Hp SS1在在液体培养基中12-36 h呈对数生长期，后续在该时间段取样进行抑菌实验。
实施例4、 海参岩藻多糖体外抑制幽门螺杆菌实验
通过抑菌圈实验观察海参岩藻多糖体外抑制Hp SS1的效果，以海带岩藻多糖为对照。
用无菌去离子水将实施例1制备的海参岩藻多糖、海带岩藻多糖制成浓度分别为0.02g/mL、0.04g/mL、0.08 g/mL的溶液并过微孔过滤膜，将灭菌后空白药敏纸片分别置于不同浓度的岩藻多糖溶液中充分浸透。以无菌水作为空白对照，阿莫西林（AMO，25 μg/片）、克拉霉素（CLR，15 μg/片）药敏纸片为阳性对照。
利用比浊法调整菌悬液浓度为1.5×108 CFU/mL，取200 μL的菌液接种到哥伦比亚血琼脂平板后，用涂布棒涂布均匀。无菌镊子将不同浓度药敏纸片贴于平板上，轻轻按压。每个平板放6个药敏纸片（空白对照、AMO和CLR阳性对照及3个不同浓度岩藻多糖药敏纸片）。将培养皿反转，放入三气培养箱中，37℃恒温培养48-72 h后取出。抑菌圈实验重复2次。
参照文献药物敏感度判定标准：抑菌圈直径≥15 mm为高度敏感；10 mm≤抑菌圈直径＜15 mm为中度敏感；6 mm≤抑菌圈直径＜10 mm为低度敏感；抑菌圈直径＜5 mm或无明显抑菌圈则为不敏感。
表2： 海参岩藻多糖和海带岩藻多糖对Hp SS1的体外抑菌效果
| 组别 | 抑菌圈直径/mm |
| 空白对照组 | — |
| 阿莫西林组 | 39.00±1.00 |
| 克拉霉素组 | 15.33±0.58 |
| 0.02g/mL海参岩藻多糖组 | 9.33±0.58 |
| 0.04g/mL海参岩藻多糖组 | 13.33±0.58 |
| 0.08g/mL海参岩藻多糖组 | 8.67±0.58 |
| 0.02g/mL海带岩藻多糖组 | — |
| 0.04g/mL海带岩藻多糖组 | — |
| 0.08g/mL海带岩藻多糖组 | — |
结果如表2，图8所示。实验结果表明在本实验剂量及限定时间范围内，空白对照组水滤纸片周围没有抑菌环存在；样品试验组海参岩藻多糖有明显抑菌环存在，特别是0.04g/mL浓度下抑菌效果更好，其抑菌圈直径为13.33±0.58 mm，证明体外海参岩藻多糖具有直接抑制Hp SS1活性（图8A和8B）；相同浓度海带岩藻多糖没有抑菌环存在，说明体外海带岩藻多糖没有直接抑制Hp SS1活性，即Hp SS1对其不敏感（图8C和8D）；阳性药物对照组阿莫西林滤纸片周围抑菌圈直径≥15 mm，显示阿莫西林具有很强直接抑制Hp SS1作用。其中，图8A和8B为海参岩藻多糖抑菌重复实验结果；图8C和8D为海带岩藻多糖抑菌重复实验结果。
实施例5、海参岩藻多糖最低抑菌浓度（MIC50）的测定
用含有10%胎牛血清的布氏肉汤培养基以2倍法稀释海参岩藻多糖至40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156 mg/mL一系列给定浓度的储备溶液。100 𝜇L这些溶液和100𝜇L新鲜的Hp SS1菌悬浮液（约1.5×108 CFU/mL）加入96孔板中。用200 𝜇L培养基做阴性对照，200 𝜇L菌悬液做阳性对照，阿莫西林（0.01 mg/mL）、克拉霉素（0.01 mg/mL）、奥美拉唑（0.01 mg/mL）做药物对照组。在微需氧条件下于37℃孵育72 h。酶标仪检测各孔吸光值（OD=600 nm），测定细菌抑菌率（%）=［（阳性对照孔OD－阴性对照孔OD）－（药物孔OD－阴性对照孔OD）］/（阳性对照孔OD－阴性对照孔OD）。当抑菌率大于50%，可认定MIC值可靠，若抑菌率小于50%，则重新判定MIC值（初判定浓度的上一个稀释梯度），直至抑菌率符合判定标准。
表3 ：海参岩藻多糖最低抑菌浓度（MIC50）结果
| 组别 | OD 600 nm | 抑菌率% |
| 阴性对照组 | 0.0543±0.0027 | — |
| 阳性对照组 | 0.2069±0.0044 | — |
| 阿莫西林组 | 0.0713±0.0020 | 90.10% |
| 克拉霉素组 | 0.0896±0.0249 | 77.94% |
| 奥美拉唑组 | 0.1260±0.0105 | 87.77% |
| 40mg/mL海参岩藻多糖组 | 0.0909±0.0024 | 77.10% |
| 20mg/mL海参岩藻多糖组 | 0.0941±0.0054 | 74.99% |
| 10mg/mL海参岩藻多糖组 | 0.0951±0.0025 | 74.29% |
| 5mg/mL海参岩藻多糖组 | 0.0092±0.0009 | 71.61% |
| 2.5mg/mL海参岩藻多糖组 | 0.1063±0.0014 | 66.89% |
| 1.25mg/mL海参岩藻多糖组 | 0.1344±0.0061 | 48.22% |
| 0.625mg/mL海参岩藻多糖组 | 0.1453±0.0249 | 40.97% |
| 0.313 mg/mL海参岩藻多糖组 | 0.1804±0.0172 | 17.63% |
| 0.156 mg/mL海参岩藻多糖组 | 0.1901±0.0088 | 11.18% |
结果如表3所示，在对照组中，布氏肉汤对照组（阴性对照）液体澄清，细菌生长对照（阳性对照）有菌生长，OD值最大；阿莫西林组、克拉霉素组和奥美拉唑组均能抑制Hp SS1生长，且抑菌率：阿莫西林>奥美拉唑>克拉霉素。各浓度梯度下，海参岩藻多糖抑菌率结果显示，药物浓度为2.5 mg/mL时，抑菌率为66.89%，达到抑菌率判定药物MIC50的标准（≥50%），因此，海参岩藻多糖对Hp SS1 MIC50值为2.5 mg/mL。
实施例6、各类海参岩藻多糖（Hf-Fuc、Ht-Fuc、Ib--Fuc）最低抑菌浓度（MIC50）测定
以实施例5的海参岩藻多糖的MIC50结果为依据，检测其他3种已知海参岩藻多糖抑制幽门螺杆菌活性及其最低抑菌浓度。
用含有10%胎牛血清的布氏肉汤培养基以2倍法稀释象牙参（Holothuriafuscopunctata, Hf）岩藻多糖（Hf-Fuc）、大乌爪参（Holothuria tubulosa, Ht）岩藻多糖（Ht-Fuc）和美国肉参（Isostichopus badionotus, Ib）岩藻多糖（Ib--Fuc）至40、20、10、5、2.5、1.25、0.625 mg/mL一系列给定浓度的储备溶液。100 𝜇L这些溶液和100 𝜇L新鲜的HpSS1菌悬浮液（约1.5×108 CFU/mL）加入96孔板中。用200 𝜇L培养基做阴性对照，200 𝜇L菌悬液做阳性对照，阿莫西林（0.01 mg/mL）、克拉霉素（0.01 mg/mL）、奥美拉唑（0.01 mg/mL）做药物对照组。在微需氧条件下于37℃孵育72 h。酶标仪检测各孔吸光值（OD=600 nm），测定细菌抑菌率（%）=［（阳性对照孔OD－阴性对照孔OD）－（药物孔OD－阴性对照孔OD）］/（阳性对照孔OD－阴性对照孔OD）。其中，Hf-Fuc的结构为[→4-α-L-Fucp(3OSO3 –)-1→]n；Ht-Fuc的结构为[→3-α-L-Fucp (2OSO3 –)-1→3-α-L-Fucp (2 OSO3 –, 4OSO3 –)-1→3-α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp (2OSO3 –)-1→]n；Ib-Fuc的结构为[→3-α-L-Fucp (2OSO3 –, 4OSO3 –)-1→3-α-L-Fucp (2OSO3 –)-1→3-α-L-Fucp (2OSO3 –)-1→3-α-L-Fucp-1→]n。
表4 ：各类海参岩藻多糖最低抑菌浓度（MIC50）结果
| 组别 | OD 600 nm | 抑菌率% |
| 阴性对照组 | 0.0543±0.0027 | — |
| 阳性对照组 | 0.2069±0.0044 | — |
| 阿莫西林组 | 0.0713±0.0020 | 90.10% |
| 克拉霉素组 | 0.0896±0.0249 | 77.94% |
| 奥美拉唑组 | 0.1260±0.0105 | 87.77% |
| 40mg/mL Hf-Fuc组 | 0.0980±0.0019 | 72.38% |
| 20mg/mL Hf-Fuc组 | 0.1018±0.0057 | 70.55% |
| 10mg/mL Hf-Fuc组 | 0.1011±0.0007 | 70.32% |
| 5mg/mL Hf-Fuc组 | 0.1052±0.0010 | 67.60% |
| 2.5mg/mL Hf-Fuc组 | 0.1344±0.0061 | 48.22% |
| 1.25mg/mL Hf-Fuc组 | 0.1477±0.0056 | 39.35% |
| 0.625 mg/mL Hf-Fuc组 | 0.1610±0.0010 | 30.50% |
| 40mg/mL Ht-Fuc组 | 0.1021±0.0003 | 69.68% |
| 20mg/mL Ht-Fuc组 | 0.1043±0.0006 | 68.23% |
| 10mg/mL Ht-Fuc组 | 0.1127±0.0016 | 61.61% |
| 5mg/mL Ht-Fuc组 | 0.1283±0.0012 | 52.24% |
| 2.5mg/mL Ht-Fuc组 | 0.1378±0.0013 | 45.91% |
| 1.25mg/mL Ht-Fuc组 | 0.1663±0.0034 | 27.02% |
| 0.625mg/mL Ht-Fuc组 | 0.1951±0.0017 | 7.80% |
| 40mg/mL Ib-Fuc组 | 0.0880±0.0019 | 79.03% |
| 20mg/mL Ib-Fuc组 | 0.0975±0.0021 | 72.71% |
| 10mg/mL Ib-Fuc组 | 0.1072±0.0006 | 66.23% |
| 5mg/mL Ib-Fuc组 | 0.1082±0.0004 | 65.60% |
| 2.5mg/mL Ib-Fuc组 | 0.1173±0.0008 | 59.56% |
| 1.25mg/mL Ib-Fuc组 | 0.1301±0.0082 | 51.07% |
| 0.625mg/mL Ib-Fuc组 | 0.1491±0.0043 | 38.45% |
结果如表4所示，各浓度梯度下，3种海参岩藻多糖抑菌率结果显示，Hf-Fuc和Ht-Fuc对Hp SS1 MIC50值为5 mg/mL，而Ib-Fuc对Hp SS1 MIC50值为1.25 mg/mL。说明不同来源不同结构的海参岩藻多糖对Hp的抑菌程度不尽相同，但总体结果表明不同海参来源的岩藻多糖对Hp有较好的抑制作用。
以上实施例仅说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.海参岩藻多糖或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述海参岩藻多糖的制备方法包括以下步骤：
（1）向海参糖肽粉中加入乙酸钠缓冲溶液、蛋白酶、EDTA溶液和半胱氨酸溶液，置于55℃-65 ℃下搅拌反应10 h-15 h，灭酶后离心，收集上清和沉淀；所述海参为象牙参、大乌爪参和美国肉参中的至少一种；
（2）将步骤（1）的沉淀加入蛋白酶进行二次酶解，收集上清；
（3）合并步骤（1）和步骤（2）的上清液，并加入十六烷基氯化吡啶溶液混合，室温反应22h-24 h后，离心弃上清，将沉淀溶解于NaCl：乙醇混合溶液中，加入95%乙醇溶液，4℃放置22h-24 h，离心收集沉淀，将上清加入至终体积为60%的乙醇，4℃放置22 h-24 h，离心收集沉淀；
（4）利用梯度浓度的乙醇对步骤（3）的沉淀进行脱水处理，烘干得到固体粉末；
（5）将步骤（4）中的固体粉末溶于纯水中透析脱盐处理，透析完成后，溶液经旋蒸、冻干得到海参粗多糖；
（6）利用Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱和Sephacryl S-300凝胶柱对所述海参粗多糖进行分离纯化，根据绘制的洗脱曲线确定阴离子交换柱洗脱的NaCl洗脱浓度为0.2mol/L，收集合并洗脱液，浓缩后经透析冻干得到海参岩藻多糖；
将所述海参岩藻多糖用Sephacryl S-300凝胶柱进一步纯化，以0.2 mol/L NH4HCO3为洗脱液，流速为0.3 mL/min收集洗脱液，根据洗脱曲线收集曲线峰尖部分，浓缩、减压除氨、冻干得所述海参岩藻多糖。
2.根据权利要求1所述的海参岩藻多糖，其特征在于，所述海参岩藻多糖具体为：
3.根据权利要求2所述的海参岩藻多糖，其特征在于，所述海参岩藻多糖的分子量为10KDa -100 KDa；具有由-(1→3)-α-L-Fucp连接的岩藻糖组成的四糖重复单元；所述四糖重复单元为：→3)-α-L-Fucp-(1→3)-α-L-Fucp-(1→3)-α-L-Fucp-(1→3)-α-L-Fucp-(1→。
4.根据权利要求2所述的海参岩藻多糖，其特征在于，所述海参岩藻多糖中单糖组成包括岩藻糖和葡萄糖，其中岩藻糖的质量比为90%-100%。
5.根据权利要求1所述的海参岩藻多糖，其特征在于，所述步骤（1）中乙酸钠缓冲溶液为0.1 mol/L，其与海参糖肽粉的液料比为3:1；所述蛋白酶为木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、菠萝蛋白酶的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的海参岩藻多糖，其特征在于，所述步骤（5）中的透析袋的截留分子量为3500 Da-10000 Da。
7.权利要求1-6任一项所述的海参岩藻多糖在制备防治由幽门螺杆菌引起的疾病的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述海参岩藻多糖在体外具有抑制幽门螺杆菌的活性，且活性优于海带岩藻多糖。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，象牙参岩藻多糖和大乌爪参岩藻多糖抑制幽门螺杆菌的有效剂量≥5 mg/mL，美国肉参岩藻多糖抑制幽门螺杆菌的有效剂量≥1.25mg/mL。
10.一种药物，其特征在于，所述药物用于抑制、清除或根除幽门螺杆菌，其包含象牙参岩藻多糖、大乌爪参岩藻多糖和美国肉参岩藻多糖中的至少一种，所述象牙参岩藻多糖和大乌爪参岩藻多糖抑制幽门螺杆菌的有效剂量≥5 mg/mL，美国肉参岩藻多糖抑制幽门螺杆菌的有效剂量≥1.25 mg/mL。
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| GR01 | Patent grant | ||
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