CN118085025A - 一种玉米活性肽及其制备方法和应用 - Google Patents

一种玉米活性肽及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN118085025A
CN118085025A CN202410273325.0A CN202410273325A CN118085025A CN 118085025 A CN118085025 A CN 118085025A CN 202410273325 A CN202410273325 A CN 202410273325A CN 118085025 A CN118085025 A CN 118085025A
Authority
CN
China
Prior art keywords
active peptide
corn
corn active
helicobacter pylori
ion exchange
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202410273325.0A
Other languages
English (en)
Inventor
李冠龙
刘晓兰
郑喜群
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qiqihar University
Original Assignee
Qiqihar University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qiqihar University filed Critical Qiqihar University
Priority to CN202410273325.0A priority Critical patent/CN118085025A/zh
Publication of CN118085025A publication Critical patent/CN118085025A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A23L33/18—Peptides; Protein hydrolysates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明属于活性肽制备技术领域，具体涉及一种玉米活性肽及其制备方法和应用。本发明提供了一种玉米活性肽，所述玉米活性肽的氨基酸序列包括EFFAEY。本发明从玉米蛋白粉中分离得到了所述玉米活性肽，其可以同时具有抑制幽门螺旋杆菌粘附和抗氧化的双重功能，可以用于制备具备抑制幽门螺旋杆菌粘附和/或抗氧化功能的产品。

Description

一种玉米活性肽及其制备方法和应用
本申请是申请日为2022年08月18日、申请号为202210989986.4、发明名称为《一种玉米活性肽及其制备方法和应用》的分案申请。
技术领域
本发明属于活性肽制备技术领域，具体涉及一种玉米活性肽及其制备方法和应用。
背景技术
幽门螺旋杆菌是一种螺旋形、微厌氧、对生长条件要求十分苛刻的革兰氏阴性菌。1983年首次从慢性活动性胃炎患者的胃粘膜活检组织中分离成功，是现所知能够在人胃中生存的惟一微生物种类。幽门螺旋杆菌病包括由幽门螺旋杆菌感染引起的胃炎、消化道溃疡、淋巴增生性胃淋巴瘤等。幽门螺旋杆菌病的不良预后是胃癌。目前，总疗程为10到14天的PPI和铋剂加两种抗生素的四联疗法是当前首选推荐方，但抗生素的选择和疗程必须根据患者幽门螺杆菌耐药情况，因人因地而异，且由于幽门螺旋杆菌对抗生素耐药性的逐年增强，现有治疗方法对幽门螺旋杆菌的根除率也在逐年下降。因此，开发抗生素的替代疗法对于防治幽门螺旋杆菌感染意义重大。
近年来，一些包括蔓越莓中的黄酮类物质、多糖、豌豆肽和小麦胚芽蛋白肽等在内的能够抑制幽门螺旋杆菌粘附作用的天然来源的食源性组分被逐渐报道，但总体种类依旧较少。本领域对天然、安全、价格低廉且更高效的用于幽门螺旋杆菌感染防治的食源性组分的研发需求更加迫切。
玉米蛋白粉(corn gluten meal，CGM)是玉米湿法生产淀粉中产量最大、蛋白质含量最高的副产物(约占60％)，但是其溶解性差、疏水性强，在食品行业中并不易得到有效利用，致使玉米蛋白粉大多被当作饲料使用，造成了粮食资源的浪费。因此，倘若能够对玉米蛋白进行改性，开发具有抑制幽门螺旋杆菌粘附和抗氧化的双功能食品，提高其附加值，对玉米蛋白的精深加工具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种玉米活性肽及其制备方法和应用，所述玉米活性肽同时具备抑制幽门螺旋杆菌粘附和抗氧化的功能，是一种新发现的具有双功能的玉米活性肽。
本发明提供了一种玉米活性肽，所述玉米活性肽的氨基酸序列包括TIFPQC和/或EFFAEY。
优选的，所述玉米活性肽的氨基酸序列为TIFPQC和/或EFFAEY。
本发明还提供了上述技术方案所述的玉米活性肽的制备方法，将玉米蛋白粉与中性蛋白酶混合，酶解，得到包括所述玉米活性肽的酶解液。
优选的，所述中性蛋白酶的用量为400U/g蛋白；所述酶解的温度为45℃，时间为150min，pH为7.0。
优选的，所述酶解前，将所述玉米蛋白粉制备成悬浊液，所述悬浊液中玉米蛋白粉的质量浓度为15％(w/v)。
优选的，所述酶解后，对所述酶解液进行分离纯化，收集得到分子量小于1000Da的组分中含有所述玉米活性肽。
优选的，所述分离纯化包括凝胶色谱分离和离子交换色谱分离。
优选的，用于所述凝胶色谱分离的凝胶色谱的预装柱为Superdex Peptide10/300GL；用于所述离子交换色谱分离的离子交换色谱包括依次进行的Q-Sepharose HighPerformance离子交换色谱和Mono Q离子交换色谱。
本发明还提供了上述技术方案所述的玉米活性肽或所述的制备方法得到的玉米活性肽在制备具备抑制幽门螺旋杆菌粘附和/或抗氧化功能的产品中的应用。
本发明还提供了一种具备抑制幽门螺旋杆菌粘附和/或抗氧化功能的产品，所述产品中的活性成分包括上述技术方案所述的玉米活性肽或所述的制备方法得到的玉米活性肽。
有益效果：
本发明提供了一种玉米活性肽，所述玉米活性肽的氨基酸序列包括TIFPQC和/或EFFAEY。本发明从玉米蛋白粉中分离得到了所述玉米活性肽，其可以同时具有抑制幽门螺旋杆菌粘附和抗氧化的双重功能，可以用于制备具备抑制幽门螺旋杆菌粘附和/或抗氧化功能的产品；尤其兼具抑制幽门螺旋杆菌粘附和抗氧化功能的产品可以在预防幽门螺旋杆菌感染的同时，还能缓解缓解机体被幽门螺旋杆菌感染后产生的氧化应激反应和炎症反应。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例1中玉米活性肽制备的技术路线图；
图2为玉米活性肽(TIFPQC)的质谱检测图；
图3为玉米活性肽(EFFAEY)的质谱检测图；
图4为菌落浓度与OD600的标准曲线；
图5为FITC荧光强度值和OD600的标准曲线。
具体实施方式
本发明提供了一种玉米活性肽，所述玉米活性肽的氨基酸序列包括TIFPQC和/或EFFAEY。
本发明所述玉米活性肽的氨基酸序列为TIFPQC(SEQ ID NO.1)和/或EFFAEY(SEQID NO.2)。本发明从玉米蛋白粉中分离得到所述玉米活性肽，所述玉米活性肽具备抑制幽门螺旋杆菌粘附和抗氧化的双重功能。
本发明还提供了上述技术方案所述的玉米活性肽的制备方法，将玉米蛋白粉与中性蛋白酶混合，酶解，得到包括所述玉米活性肽的酶解液。
进行所述酶解前，本发明优选将所述玉米蛋白粉与水混合，制备成悬浊液。本发明所述悬浊液中玉米蛋白粉的质量浓度优选为15％(w/v)。本发明对所述混合的方式没有特殊限定，采用本领域中常规混合方式即可。本发明所述玉米蛋白粉优选为经挤压膨化后去淀粉的玉米蛋白粉。本发明对所述玉米蛋白粉的来源没有特殊限定，采用本发明中常规购买的玉米蛋白粉均可。本发明所述经挤压膨化后去淀粉的玉米蛋白粉可以充分的去掉与蛋白质紧密结合的淀粉物质，有利于蛋白质的酶解。
得所述悬浊液后，本发明优选将所述悬浊液与中性蛋白酶混合，酶解，得到酶解产物。本发明所述中性蛋白酶的用量优选为400U/g蛋白，所述蛋白质量优选以玉米蛋白粉中的蛋白计算。本发明所述酶解的温度优选为45℃，酶解的时间优选为150min，酶解的pH优选为7.0。酶解完成后，本发明优选还包括对所述酶解产物进行灭酶处理，得到灭酶后的酶解产物。本发明所述所述灭酶处理的温度优选为100℃；所述灭酶处理的时间优选为10min。灭酶处理完成后，本发明优选还包括对所述灭酶后的酶解产物离心，得到的上清液即为包括所述玉米活性肽的酶解液。本发明所述离心的转速优选为4000r/min，时间优选为10min。
得所述酶解液后，本发明优选对所述酶解液进行分离纯化，收集得到分子量小于1000Da的组分中含有所述玉米活性肽。本发明优选对所述酶解液剂型凝胶色谱分离，收集抑制幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性相对更强且分子量小于1000Da的组分。本发明用于所述凝胶色谱分离的凝胶色谱预装柱优选为Superdex Peptide 10/300GL。本发明进行所述凝胶色谱分离的条件优选包括：上样浓度为50mg/L，上样量为1mL；洗脱液为pH 7.0的含0.15mol/LNaCl的20mM PBS缓冲液；洗脱液的流速为0.25mL/min；检测波长为214nm。本发明优选还包括测定收集得到的各组分的抑制幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性，得到抑制幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性相对更强且分子量小于1000Da的组分。本发明优选采用实施例1中所述的方法测定所述抑制幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性，下同，不再赘述。
得到所述抑制幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性相对更强且分子量小于1000Da的组分后，本发明优选对所述抑制幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性相对更强且分子量小于1000Da的组分进行离子交换色谱分离。本发明用于所述离子交换色谱分离的色谱优选包括Q-Sepharose High Performance离子交换色谱和Mono Q离子交换色谱。本发明采用所述Q-Sepharose High Performance离子交换色谱进行分离的条件优选包括：上样量为50mL；洗脱液A优选为Tris-HCl缓冲液，所述Tris-HCl缓冲液的浓度优选为20mM，pH值优选为7.5；洗脱液B为pH 7.5的含1mol/LNaCl的20mM Tris-HCl缓冲液；洗脱液的流速为2mL/min，检测波长为214nm，梯洗体积60mL，峰组分收集的体积为6mL/管。本发明优选还包括测定收集得到的各组分的抑制幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性，得到抑制幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性相对更强的组分，即为组分一。本发明所述组分一中的蛋白浓度优选为2mg/mL。
得到所述组分一后，本发明优选采用Mono Q离子交换色谱对所述组分一进行分离。本发明采用所述Mono Q离子交换色谱进行分离的条件优选包括上样量为10mL；洗脱液A优选为Tris-HCl缓冲液，所述Tris-HCl缓冲液的浓度优选为20mM，pH值优选为7.0；洗脱液B优选为pH 7.0含1mol/LNaCl的20mM Tris-HCl缓冲液；洗脱液的流速优选为1mL/min，检测波长优选为214nm，梯洗体积优选为20mL，峰组分收集的体积优选为1mL/管。本发明优选还包括测定收集得到的各组分的抑制幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性，得到抑制幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性相对更强的组分，即为组分二。
得到所述组分二后，本发明优选对所述组分二进行质谱测序，得到所述玉米活性肽。本发明所述玉米活性肽的氨基酸序列为TIFPQC和EFFAEY。
本发明进行所述优选质谱测序采用的是LC-MS/MS。本发明对所述质谱测序的过程和步骤没有特殊限定，采用本领域中常规质谱测序步骤即可。进行所述质谱测序前，本发明还包括对所述组分二进行脱盐冻干。本发明对所述脱盐冻干的过程、步骤以及脱盐后的状态均没有特殊限定，采用本领域中常规脱盐冻干的过程和步骤即可。
本发明还提供了上述技术方案所述的玉米活性肽或所述的制备方法得到的玉米活性肽在制备具备抑制幽门螺旋杆菌粘附和/或抗氧化功能的产品中的应用。本发明所述产品优选包括药物和/或食品；所述食品优选包括功能性食品。
本发明还提供了一种具备抑制幽门螺旋杆菌粘附和/或抗氧化功能的产品，所述产品中的活性成分包括上述技术方案所述的玉米活性肽或所述的制备方法得到的玉米活性肽。本发明所述产品优选包括药品和/或食品；所述食品优选包括功能性食品。本发明所述产品优选还包括辅料和/或其他活性成分。当所述产品中还包括其他活性成分时，本发明对所述其他活性成分的类型和功效均没有特殊限定，依据制备的产品合理添加即可。本发明对所述产品中玉米活性肽的用量没有特殊限定，根据制备的产品合理调整即可。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
在下述实施例中所使用的方法，如无特殊说明，采用的均为本领域中的常规试验方法；所使用的生物材料和试验材料，如无特殊说明，均可通过本领域中常规购买渠道获得。
实施例1
玉米活性肽，由以下步骤组成(技术路线图见图1)：
1、玉米蛋白酶解液的制备
取一定量经挤压膨化并去除淀粉的玉米蛋白粉(购自齐齐哈尔龙江阜丰生物科技有限公司)，加水配制成底物浓度为15％(w/v)的悬浊液，然后用中性蛋白酶进行酶解，酶解条件为：加酶量400U/g蛋白，酶解温度45℃，酶解时间150min，酶解pH 7.0，酶解结束后100℃加热灭酶10min，酶解物在4000r/min离心10min并弃去沉淀，所得上清液为玉米蛋白酶解液，通过测定其拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性，确认其为具有高抑制幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性的多肽混合物。抑制幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性测定的方法均参照步骤5中进行，下同，不再赘述。
2、玉米蛋白酶解液的凝胶色谱分离
所使用的凝胶色谱柱为Superdex Peptide 10/300GL预装柱，将步骤1中具有高拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性的多肽混合物采用凝胶色谱分离得到不同分子量组分的多肽混合物，上样浓度50mg/mL，上样量1mL，洗脱液为pH 7.0含0.15mol/LNaCl的20mM PBS缓冲溶液，流速为0.25mL/min，检测波长为214nm；测定各分子量组分的抑制幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性，收集分子量小于1000Da且拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性均相对较高的组分用于离子交换色谱分离。
3、离子交换色谱分离
3.1Q-Sepharose HighPerformance强阴离子交换色谱分离
将凝胶色谱所得分子量小于1000Da且抑制幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性均相对较高的组分过0.22μm的微孔滤膜，所得样品蛋白浓度为4mg/mL，使用强阴离子交换剂为Q-Sepharose HighPerformance分离。上样量为50mL，所述强阴离子交换色谱的洗脱液A：pH 7.5的20mM的Tris-HCl缓冲液，洗脱液B：pH7.5含1mol/LNaCl的的20mM Tris-HCl缓冲液，流速为2mL/min，检测波长214nm，梯洗体积为60mL，峰组分每管收集6mL；测定各管收集液的抑制幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性，收集抑制幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性均相对较高的组分(第7管)用于Mono Q离子交换色谱分离。
3.2Mono Q离子交换色谱
步骤3.1中分离得到的高活性组分使用Mono Q离子交换色谱进一步分离。将上一步离子交换色谱所得高活性组分过0.22μm的微孔滤膜，所得样品蛋白浓度为2mg/mL，上样量10mL，所述Mono Q离子交换色谱的洗脱液A：pH 7.0的20mM的Tris-HCl缓冲液，洗脱液B：pH 7.0含1mol/L NaCl的的20mM Tris-HCl缓冲液，流速为1mL/min，检测波长214nm，梯洗体积为20mL，峰组分每管收集1mL；测定各管收集液的抑制幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性，收集抑制幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性均较高的组分(第15管)备用。
4、LC-MS/MS质谱测序
将步骤3.2中得到的组分脱盐冻干后进行质谱测序，得到氨基酸序列为TIFPQC(下称多肽Ⅰ)和EFFAEY(下称多肽Ⅱ)的玉米活性肽，结果如图2和3所示。
5、玉米活性肽的抑制幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性的测定将步骤4中得到的玉米活性肽化学合成后(委托上海强耀生物科技有限公司合成)，测定其抑制幽门螺旋杆菌粘附活性和对DPPH和ABTS自由基的清除能力。
5.1玉米活性肽抑制幽门螺旋杆菌粘附活性的测定：
1)利用H.pyloriATCC43504菌株作为抗粘附活性试验测定菌株。在37℃条件下将经过冻存的H.pyloriATCC43504菌株解冻，先与液体培养基(3g大豆蛋白胨、2.5g K2HPO4、17g胰蛋白胨和5g NaCl，加入1L去离子水，混合摇匀溶解后调节pH值至7.2，121℃、0.1Mpa灭菌1h)混合，随后将其接种于斜面培养基(15g胰蛋白胨、5g大豆蛋白胨、15g琼脂、5gNaCl和950mL去离子水，搅拌溶解调节pH值至7.2，121℃、0.1Mpa灭菌1h，在培养基冷却至45℃左右，加入50mL无菌的脱纤维羊血，混匀后，倒入试管制作斜面培养基)上，在37℃微需氧(5％O2，85％N2，10％CO2)条件下，培养48～72h，得到的菌液可进行菌种传代和抗粘附活性检测。
将传代的H.pyloriATCC43504的菌液，进行四次10倍梯度稀释获得五种不同浓度的菌液，在600nm条件下测定幽门螺旋杆菌菌液的OD值，同时通过平板涂布法计算菌落浓度，建立菌落浓度与OD600的标准曲线，如图4所示。
2)冻存人胃粘膜上皮细胞(GES-1)解冻后移入细胞培养瓶中，细胞培养基组成为1％青链霉素混合液、10％胎牛血清和89％DMEM培养基。在37℃，5％CO2条件下孵育至单层细胞形成，胰蛋白酶-EDTA消化传代，离心，用不含抗生素的细胞培养基重悬，调整细胞浓度为3×105cells/mL。将细胞悬液接种到96孔板中，每孔100μL，在37℃，5％CO2培养箱中培养孵育24h，用于拮抗H.pylori粘附活性的测定实验。
3)异硫氰酸荧光素(FITC)标记幽门螺旋杆菌
制备FITC浓度为2mg/mL的DMSO溶液，无菌滤膜过滤处理。按照1：1的体积比将步骤1)中制备得到的传代的H.pyloriATCC43504的菌液与其混匀，在避免光照的条件下，生化摇摆台上混合30min后，在4500r/min的转速下离心处理3min，除去上清液，经过1×PBS缓冲液洗涤3次，除去多余的FITC，最后将菌液在液体培养基(3g大豆蛋白胨、2.5g K2HPO4、17g胰蛋白胨和5g NaCl，加入1L去离子水，混合摇匀溶解后调节pH值至7.2，121℃、0.1Mpa灭菌1h)上稀释至OD600值在0.1左右(108cfu/mL)，备用。
4)FITC荧光强度值与OD600标准曲线的构建
将上步中经过FITC标记处理的幽门螺旋杆菌菌液，按照四次10倍梯度稀释，在激发波长485nm和发射波长530nm条件下，测量其荧光强度值，与此同时在600nm条件下测OD值，建立FITC荧光强度值和OD600的标准曲线，如图5所示。
5)玉米活性肽抑制幽门螺旋杆菌粘附活性试验
将实施例1中制备得到的多肽Ⅰ使用100％DMEM培养基，配制一定蛋白浓度的多肽Ⅰ溶液，按照1：1(v/v)的比例与步骤3)中经过FITC标记过的菌液在室温避光条件下进行混合30min，使实施例1所得多肽Ⅰ的终浓度为4mg/mL，得到混合后的菌液。
向带有胃粘膜上皮细胞(GES-1)的96孔板中分别加入100μL混合后的菌液，以加入100μL100％DMEM培养基为阴性对照组，在培养箱中放置90min。然后将溶液去除，用PBS缓冲液清洗3次，随即，将PBS缓冲液按照每孔100μL量加入，在发射波长530nm、激发波长485nm条件下进行荧光强度值的测定，根据实施例1中5.1的步骤3)和4)，计算出阴性对照组和试验组的菌落浓度，采用以下公式计算粘附抑制率：
结果为：当多肽Ⅰ(TIFPQC)的浓度为4mg/mL时，其抑制幽门螺旋杆菌粘附活性为51.39％。
采用相同的方法测定多肽Ⅱ(EFFAEY)的抑制幽门螺旋杆菌粘附活性，当多肽Ⅱ(EFFAEY)的浓度为4mg/mL时，其抑制幽门螺旋杆菌粘附活性为40.77％。
5.2玉米活性肽抗氧化活性的测定：
(1)玉米活性肽清除DPPH自由基能力的测定：取2mL不同浓度的多肽Ⅰ溶液(以水溶解多肽Ⅰ制备多肽Ⅰ溶液)，加入2mL 0.1mmol/L DPPH无水乙醇溶液，混合均匀，避光反应30min，在517nm处测其吸光值(Ai)；取2mL多肽Ⅰ溶液于试管中，加入2mL无水乙醇，在517nm处测其吸光值(Aj)；取2mL 0.1mmol/L DPPH无水乙醇溶液(0.1mmol/L)和2mL无水乙醇反应作为参比，在517nm处测其吸光值(A0)。样品对DPPH自由基的清除率K按式(1)计算：
式中：
K-对DPPH自由基的清除率，％；
A0-2mL 0.1mmol/L DPPH无水乙醇溶液与2mL无水乙醇在517nm下的吸光值；
Ai-2mL 0.1mmol/L DPPH无水乙醇溶液与2mL样品溶液反应在517nm下的吸光值；
Aj-2mL无水乙醇与2mL样品溶液在517nm下的吸光值。
由以上DPPH自由基清除活性测定结果可以得出，多肽Ⅰ(TIFPQC)对DPPH自由基清除能力的IC50值为0.123mg/mL。
采用相同的方法测定多肽Ⅱ(EFFAEY)对DPPH自由基清除能力，多肽Ⅱ(EFFAEY)对DPPH自由基清除能力的IC50值为1.811mg/mL。
(2)玉米活性肽清除ABTS自由基能力的测定：准确配制7.0mmol/LABTS溶液及2.45mmol/L过硫酸钾水溶液，混匀，室温避光条件下静置12～16h后，即得ABTS+母液。将ABTS+母液用去离子水稀释，使其在734nm处的吸光值为0.70±0.023，并在30℃下平衡30min，即得ABTS+工作液。分别取2.0mL不同浓度的多肽I溶液和2.0mLABTS+工作液加入试管中，混匀，室温下避光放置20min，于734nm处测定吸光值。以去离子水替代多肽I溶液同体积的反应混合液为对照，设3个重复，求平均值。根据下列公式计算多肽I溶液对ABTS自由基的清除率。
清除率(％)＝(1-A样品/A空白)×100，其中，A样品为添加样品后溶液的吸光值；A空白为未添加样品溶液的吸光值。
由以上ABTS测定结果可以得出，多肽Ⅰ(TIFPQC)对ABTS自由基清除能力的IC50值分别为0.011mg/mL。
采用相同的方法测定多肽Ⅱ(EFFAEY)对ABTS自由基清除能力，多肽Ⅱ(EFFAEY)对ABTS自由基清除能力的IC50值为0.021mg/mL。
由以上实施例可以得出，本发明提供的玉米活性肽具备同时抑制幽门螺旋杆菌粘附和抗氧化的双活性。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种玉米活性肽，其特征在于，所述玉米活性肽的氨基酸序列包括EFFAEY。
2.如权利要求1所述的玉米活性肽，其特征在于，所述玉米活性肽的氨基酸序列为EFFAEY，或为EFFAEY和TIFPQC。
3.权利要求1或2所述的玉米活性肽的制备方法，其特征在于，将玉米蛋白粉与中性蛋白酶混合，酶解，得到包括所述玉米活性肽的酶解液。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述中性蛋白酶的用量为400U/g蛋白；所述酶解的温度为45℃，时间为150min，pH为7.0。
5.如权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，所述酶解前，将所述玉米蛋白粉制备成悬浊液，所述悬浊液中玉米蛋白粉的质量浓度为15％w/v。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述酶解后，对所述酶解液进行分离纯化，收集得到分子量小于1000Da的组分中含有所述玉米活性肽。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述分离纯化包括凝胶色谱分离和离子交换色谱分离。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，用于所述凝胶色谱分离的凝胶色谱的预装柱为Superdex Peptide 10/300GL；用于所述离子交换色谱分离的离子交换色谱包括依次进行的Q-Sepharose High Performance离子交换色谱和Mono Q离子交换色谱。
9.权利要求1或2所述的玉米活性肽或权利要求3～8任一项所述的制备方法得到的玉米活性肽在制备具备抑制幽门螺旋杆菌粘附和/或抗氧化功能的产品中的应用。
10.一种具备抑制幽门螺旋杆菌粘附和/或抗氧化功能的产品，其特征在于，所述产品中的活性成分包括权利要求1或2所述的玉米活性肽或权利要求3～8任一项所述的制备方法得到的玉米活性肽。
CN202410273325.0A 2022-08-18 2022-08-18 一种玉米活性肽及其制备方法和应用 Pending CN118085025A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410273325.0A CN118085025A (zh) 2022-08-18 2022-08-18 一种玉米活性肽及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410273325.0A CN118085025A (zh) 2022-08-18 2022-08-18 一种玉米活性肽及其制备方法和应用
CN202210989986.4A CN116023433B (zh) 2022-08-18 2022-08-18 一种玉米活性肽及其制备方法和应用

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210989986.4A Division CN116023433B (zh) 2022-08-18 2022-08-18 一种玉米活性肽及其制备方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN118085025A true CN118085025A (zh) 2024-05-28

Family

ID=86076503

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202410273325.0A Pending CN118085025A (zh) 2022-08-18 2022-08-18 一种玉米活性肽及其制备方法和应用
CN202210989986.4A Active CN116023433B (zh) 2022-08-18 2022-08-18 一种玉米活性肽及其制备方法和应用

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210989986.4A Active CN116023433B (zh) 2022-08-18 2022-08-18 一种玉米活性肽及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (2) CN118085025A (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117247430B (zh) * 2023-11-17 2024-01-30 齐齐哈尔大学 一种玉米抗氧化肽及其制备方法与应用
CN117586349B (zh) * 2024-01-19 2024-04-05 齐齐哈尔大学 玉米谷蛋白源抗氧化活性肽及其制备方法与应用

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101096696B (zh) * 2007-07-06 2010-08-25 山东天久生物技术有限公司 从玉米蛋白粉中酶法制取玉米蛋白多肽的工业生产方法
CN101284872B (zh) * 2008-04-09 2012-06-06 齐齐哈尔大学 一种抗氧化活性肽及其制备方法
CN102864201A (zh) * 2012-10-09 2013-01-09 陕西同正科技有限公司 玉米活性肽的一种制备方法
JP6190999B2 (ja) * 2013-06-05 2017-09-06 日本食品ペプチド研究所株式会社 アルコール代謝促進剤として有効なオリゴペプチドの製造方法
US9534026B2 (en) * 2013-10-31 2017-01-03 China National Research Institute Of Food & Fermentation Industries Corn active peptide additive for cell culture medium
CN105237622B (zh) * 2015-09-09 2018-11-30 齐齐哈尔大学 玉米抗氧化活性肽及其制备方法
CN115247197B (zh) * 2021-11-29 2023-05-12 齐齐哈尔大学 一种具有拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性的玉米蛋白水解物及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN116023433B (zh) 2024-05-14
CN116023433A (zh) 2023-04-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN116023433B (zh) 一种玉米活性肽及其制备方法和应用
CN115960167B (zh) 一种玉米抗粘附肽及其制备方法和应用
CN116041426B (zh) 玉米蛋白源抗粘附肽及其制备方法和应用
CN116063378A (zh) 具有拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性的双功能玉米肽及其制备方法和应用
CN116041425A (zh) 双功能玉米蛋白源活性肽及其制备方法和应用
CN107779489B (zh) 一种具有抗氧化和ace抑制功能的蚕蛹蛋白肽
AU666531B2 (en) Processes for the preparation of amylase inhibitor
CN111961617B (zh) 一株高产免疫多糖和细菌素的多效枯草芽孢杆菌及应用
CN115247197B (zh) 一种具有拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性的玉米蛋白水解物及其制备方法和应用
CN117603308B (zh) 一种抗幽门螺旋杆菌粘附的玉米肽及其制备方法与应用
CN116063386B (zh) 一种鹿角盘免疫活性肽及其制备方法和应用
CN104558115A (zh) 一种孔鳐鱼肉蛋白抗氧化多肽及其制备方法和用途
CN108048518B (zh) 鸡血球抗氧化肽及其酶解制备方法
CN114213512B (zh) 增强藻胆蛋白光热稳定性的组合物及其制备方法与应用
CN116715724A (zh) 来源于草菇子实体的抗氧化肽及其应用
CN115124591A (zh) 钝顶螺旋藻藻蓝蛋白血管紧张素转化酶抑制肽及其制备方法和应用
CN110256529B (zh) 一种抗氧化肽及其应用
CN117903248A (zh) 一种双功能玉米肽及其应用
CN118108798B (zh) 一种米糠蛋白肽及其筛选方法与应用
CN116355063A (zh) 一种具有免疫增强活性的姬松茸多肽提取物及其制备方法和应用
CN110256530B (zh) 一种抗氧化肽及其应用
CN107502644A (zh) 一种菜籽抗炎肽的分离纯化方法
CN108059652A (zh) 一种利用蛋白酶解法制备的灰树花硒螯合肽
JP4224313B2 (ja) アミラーゼ阻害物質の調製方法
CN114249804A (zh) 一种利用双水相体系分离纯化α-淀粉酶抑制剂的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination