CN115247197B - 一种具有拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性的玉米蛋白水解物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种具有拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性的玉米蛋白水解物及其制备方法和应用，属于生物活性肽技术领域。本发明提供的玉米蛋白水解物经由如下步骤制备所得：将预处理后的玉米黄粉用蛋白酶水解，得酶解物，将酶解物进行灭酶处理后取上清液，纳滤、干燥得玉米蛋白水解物。本发明提供的玉米蛋白水解物具有拮抗幽门螺旋杆菌粘附人胃粘膜上皮细胞功能，能够显著抑制幽门螺旋杆菌释放的脲酶活性，减少幽门螺旋杆菌在人胃部的定植量。体内动物试验表明，本发明玉米蛋白水解物不仅可有效降低小鼠胃部幽门螺旋杆菌的定植数量，还能降低胃部氧化应激水平、减少炎症因子产生，同时可减缓由幽门螺旋杆菌感染产生的胃部炎症反应。

Description

一种具有拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性的玉米蛋白水解物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物活性肽技术领域，尤其涉及一种具有拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性的玉米蛋白水解物及其制备方法和应用。

背景技术

幽门螺旋杆菌(Helibactor pylori)是一种革兰氏阴性菌，长度2～4μm，宽度0.5～1μm，通常呈螺旋形，有时也会呈杆状出现，长时间体外培养或抗生素处理后会呈球状。该细菌有2～6个鞭毛，鞭毛赋予细菌运动能力，使其在胃上皮细胞的粘液层快速运动。H.pylori的生长具有微需氧的特性，在5％的O₂、10％的CO₂、37℃和高湿度的条件下具有最佳生长环境。尽管H.pylori可以定植在酸性胃粘膜上，但仅在pH 5.5～8.0的范围内才能生长。

H.pylori是一种特殊的病原体，机体感染H.pylori后，一般难以自行清除，若不采取根除治疗，将终生携带。H.pylori特异性地与胃粘膜上皮细胞粘附，是公认的慢性胃炎与溃疡性疾病的重要致病因子之一，也可能与胃癌、胃粘膜相关性淋巴瘤的发病密切相关，世界卫生组织将其列为I类致癌因子。H.pylori首先粘附在胃上皮细胞的粘膜层，并通过分泌脲酶调节胃中酸性环境，随后，H.pylori穿透黏液层，通过鞭毛向上皮细胞移动。细菌表面的粘附素可以特异性识别宿主细胞表面的受体，从而实现H.pylori对胃粘膜上皮细胞的粘附。H.pylori一旦粘附在胃上皮表面，便可以抵抗胃蠕动和排空所施加的力，进而获得生长所需的养分，输送毒素破坏宿主细胞并引起感染。

现阶段，最常采用的根除H.pylori的方法是抗生素治疗，常用质子泵抑制剂和两种抗生素的三联疗法以及铋剂、质子泵抑制剂和两种抗生素联合使用的四联疗法。但随着H.pylori对抗生素的耐药性逐年上升，其根除率也在下降，并且服用抗生素具有很多副作用，如肠道不适、过敏等。因此，开发抗生素的替代疗法对于防治H.pylori感染、保持人类胃肠道菌群健康具有重要意义。

抗粘附疗法的基本原理为抑制H.pylori粘附GES-1细胞进而达到拮抗H.pylori感染的目的，是最具有潜力的替代抗生素方法之一。具体为，抗粘附成分作为受体类似物或粘附素类似物阻断H.pylori表面粘附素与GES-1细胞受体之间的粘附作用。受体类似物具有与GES-1细胞表面受体类似的结构，阻断H.pylori粘附GES-1细胞，与受体竞争结合H.pylori表面粘附素。粘附素类似物具有与H.pylori表面粘附素相类似的结构，从而可以竞争性的与GES-1细胞表面的受体结合，从而阻止H.pylori粘附。

近年来，关于食源性组分拮抗H.pylori粘附人胃粘膜上皮GES-1细胞取得了一定的进展，但大部分均处于体外研究阶段。研究表明酪蛋白、蔓越莓中的黄酮类物质、苹果多酚、植物多糖、植物源生物活性肽(豌豆肽、小麦肽等)等在体外试验具有拮抗H.pylori粘附活性。因此，进一步研发更高效的具有拮抗H.pylori粘附活性的食源性组分仍然十分必要。

玉米是我国主要的粮食作物，产量超过水稻。由于其产量高，增产潜力大，因此在工农业中占有重要地位。玉米蛋白粉(corn gluten meal,CGM)是玉米湿法生产淀粉中产量最大、蛋白质含量最高的副产物(约占60％)，CGM中醇溶蛋白约占65％，谷蛋白约占22％。玉米醇溶蛋白含有高比例的谷氨酸(Glu，21.4～31.3％)、亮氨酸(Leu，19.3～21.1％)、丙氨酸(Ala，8.3～10.5％)和脯氨酸(Pro，9.0～10.5％)；玉米谷蛋白中谷氨酰胺(Gln)含量约占氨基酸总量的1/3。玉米蛋白粉具有很多限制其在食品行业应用的不利因素，如溶解性差、疏水性强等，但是与其他谷物蛋白相比，玉米蛋白中含有较多的必需氨基酸，且含有抗氧化、抗高血压、促酒精代谢等功能序列区。现阶段，针对玉米蛋白水解物研究主要集中在抗氧化活性、促进酒精代谢活性以及降压活性等，但目前对于玉米蛋白水解物拮抗H.pylori粘附活性研究未见报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种具有拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性的玉米蛋白水解物，可有效降低胃部幽门螺旋杆菌的定植数量，降低由幽门螺旋杆菌感染产生的胃部氧化应激水平、减少炎症因子产生，减缓胃部炎症反应。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种具有拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性的玉米蛋白水解物，所述玉米蛋白水解物的制备方法包括如下步骤：将预处理后的玉米黄粉用蛋白酶水解，得酶解物，将酶解物进行灭酶处理后取上清液，纳滤、干燥得玉米蛋白水解物。

优选的，所述蛋白酶包括中性蛋白酶、碱性蛋白酶、复合蛋白酶或蛋白酶P。

优选的，所述蛋白酶的添加量为400～800U/g玉米黄粉。

优选的，采用中性蛋白酶时，所述水解的温度为40℃～50℃，所述水解的时间为2h～3h，所述水解的pH值为6.5～7.5。

优选的，所述预处理包括如下步骤：将玉米黄粉膨化、去淀粉、去纤维素、蒸煮即得预处理后的玉米黄粉。

优选的，所述去淀粉包括如下步骤：向玉米黄粉悬浮液中加入α-淀粉酶后，60℃～70℃水解1.5h～2.5h；所述α-淀粉酶的添加量为玉米黄粉质量的0.8％～1.2％。

优选的，所述去纤维素包括如下步骤：向去淀粉后的玉米黄粉悬浮液中加入纤维素酶后，45℃～55℃水解1.5h～2.5h；所述纤维素酶的添加量为玉米黄粉质量的0.8％～1.2％。

优选的，所述灭酶的温度为90℃～110℃，所述灭酶的时间为5min～15min。

本发明还提供了一种上述玉米蛋白水解物在制备拮抗幽门螺旋杆菌感染产品中的应用。

本发明还提供了一种上述玉米蛋白水解物在制备防治胃部炎症产品中的应用。

本发明的有益效果：

采用本发明制备方法所得的玉米蛋白水解物具有显著拮抗幽门螺旋杆菌粘附人胃粘膜上皮细胞功能，同时还具有抑制脲酶活性、降低幽门螺旋杆菌定植量和降低由幽门螺旋杆菌感染引起的炎症反应作用，成功解决了现阶段抗生素治疗幽门螺旋杆菌毒副作用大、耐药性逐年上升等问题，同时对幽门螺旋杆菌的感染起到预防作用。

本发明玉米蛋白水解物能够显著降低胃部MDA、MPO、SOD和GSH-Px的含量(P＜0.05)，从而降低胃部氧化应激水平。显著降低胃部组织IL-6、IL-1β、TNF-α和KC等细胞因子含量(P＜0.05)，从而降低由幽门螺旋杆菌感染引起的胃部炎症反应。同时，本发明玉米蛋白水解物通过降低由幽门螺旋杆菌感染引起的TLR4、MyD88和NF-κB含量的增加，从而达到有效拮抗幽门螺旋杆菌感染后胃粘膜损伤的效果。

附图说明

图1为菌落浓度与菌悬液光密度值(OD₆₀₀)标准曲线；

图2为FITC荧光强度值与OD₆₀₀标准曲线；

图3为不同浓度的中性蛋白酶玉米蛋白水解物对脲酶的抑制作用；

图4为不同组别小鼠尿素酶反应结果，其中A为对照组；B为模型组；C为200mg/kg·bw玉米蛋白水解物组；D为400mg/kg·bw玉米蛋白水解物组；E为600mg/kg·bw玉米蛋白水解物组；F为阳性对照组。

具体实施方式

本发明提供了一种具有拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性的玉米蛋白水解物，所述玉米蛋白水解物的制备方法包括如下步骤：将预处理后的玉米黄粉用蛋白酶水解，得酶解物，将酶解物进行灭酶处理后取上清液，纳滤、干燥得玉米蛋白水解物。

在本发明中，所述预处理优选的包括如下步骤：将玉米黄粉膨化、去淀粉、去纤维素、蒸煮即得预处理后的玉米黄粉。

本发明对于玉米黄粉的具体来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品均可。在本发明中，所述玉米黄粉优选的采用物料含水量为16％～18％的玉米黄粉。本发明所述膨化优选的采用三段式升温膨化，第一段膨化温度优选为60℃、第二段膨化温度优选为110℃，第三段膨化温度优选为160℃。

在本发明中，对玉米黄粉进行去淀粉工艺时，所述去淀粉优选的包括如下步骤：配制浓度为10％(w/v)的玉米黄粉悬液，向其中加入α-淀粉酶，60℃～70℃水解1.5h～2.5h；所述α-淀粉酶的添加量为玉米黄粉质量的0.8％～1.2％。本发明对于α-淀粉酶的具体来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品均可。所述α-淀粉酶的添加量优选为玉米黄粉质量的0.9％～1.1％，更优选为玉米黄粉质量的1.0％。加入α-淀粉酶后，所述水解的温度优选为65℃～68℃，所述水解的时间优选为1.8h～2.0h。

去除玉米黄粉中的淀粉后，需要去纤维素，所述去纤维素优选的包括如下步骤：将去淀粉后的玉米黄粉与纤维素酶混合后，45℃～55℃水解1.5h～2.5h；所述纤维素酶的添加量为玉米黄粉质量的0.8％～1.2％。本发明对于纤维素酶的具体来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品均可。所述纤维素酶的添加量优选为玉米黄粉质量的0.9％～1.1％，更优选为玉米黄粉质量的1.0％，添加纤维素酶后，所述水解的温度优选为48℃～52℃，更优选为49℃～51℃，所述水解的时间优选为1.8h～2.2h，更优选为1.9h～2.1h。本发明对于蒸煮的具体条件没有特殊限定，采用本领域常规蒸煮条件均可。

获得预处理后的玉米黄粉后，优选的先配制成底物浓度15％(w/v)的悬液，再加入蛋白酶水解，所述蛋白酶优选的包括中性蛋白酶、碱性蛋白酶、复合蛋白酶或蛋白酶P，本发明对于上述四种酶的具体来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品均可，在本发明具体实施例中，中性蛋白酶、碱性蛋白酶和复合蛋白酶均购自丹麦诺维信酶制剂公司，蛋白酶P购自Amano酶制剂公司。采用蛋白酶对玉米黄粉进行水解时，所述蛋白酶的添加量优选为400～800U/g玉米黄粉，更优选为500～600U/g玉米黄粉。在本发明中，所述蛋白酶为中性蛋白酶时，所述水解的温度优选为40℃～50℃，更优选为45℃～48℃，所述水解的时间优选为2h～3h，更优选为2.5h～2.8h，所述水解的pH值优选为6.5～7.5，更优选为7.0～7.2。所述蛋白酶为碱性蛋白酶时，所述水解的温度优选为55℃～75℃，更优选为60℃～65℃，所述水解的时间优选为2h～3h，更优选为2.5h～2.8h，所述水解的pH值优选为6.5～9，更优选为7.0～8.5。所述蛋白酶为复合蛋白酶时，所述水解的温度优选为45℃～65℃，更优选为50℃～60℃，所述水解的时间优选为2h～3h，更优选为2.5h～2.8h，所述水解的pH值优选为6.0-8.0，更优选为6.5-7.5。所述蛋白酶为蛋白酶P时，所述水解的温度优选为40℃～50℃，更优选为45℃～48℃，所述水解的时间优选为2h～3h，更优选为2.5h～2.8h，所述水解的pH值优选为6.0-8.0，更优选为6.5-7.5。

在本发明中，获得酶解物后，需进行灭酶处理。所述灭酶的温度优选为90℃～110℃，更优选为95℃～105℃，所述灭酶的时间优选为5min～15min，更优选为8min～10min。灭酶后，离心，所述离心的转速优选为3000r/min～5000r/min，更优选为3500r/min～4500r/min，所述离心的时间优选为5min～15min，更优选为8min～12min。离心后，取上清液进行纳滤处理，所述纳滤的压力优选为15～25Bar，更优选为18～22Bar，所述纳滤的温度优选为15℃～25℃，更优选为18℃～22℃，纳滤后的溶液体积优选为纳滤前溶液体积的1/3～2/3止。纳滤去除钠离子，防止影响活性肽品质。纳滤结束后收集溶液，干燥得玉米蛋白水解物，在本发明中，所述干燥优选的为冷冻干燥或喷雾干燥。

本发明还提供了一种上述玉米蛋白水解物在制备拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性产品或在制备防治胃部炎症产品中的应用。

本发明对于所述产品的具体类型没有特殊限定，比如所述产品可为药品、食品或保健品等。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

将玉米黄粉进行三段式膨化处理，第一段膨化温度为60℃、第二段膨化温度为110℃，第三段膨化温度为160℃，膨化结束后，用去离子水配置成浓度为10％(w/v)的悬液，加入玉米黄粉质量1％的α-淀粉酶(购自北京奥博星公司)，65℃反应2h去除淀粉。向去淀粉后的溶液中加入玉米黄粉质量1％的纤维素酶(购自南宁东恒华道酶制剂公司)，50℃反应2h去除纤维素。在100℃的条件下灭酶10min，10000rpm离心15min，取沉淀蒸煮后烘干得玉米黄粉；

按照600U/g玉米黄粉的添加量取中性蛋白酶(购自丹麦诺维信)，与玉米黄粉混合，45℃、pH7.0条件下水解2.5h，得酶解物，所得玉米蛋白源抗粘附肽的回收率为总蛋白的22.3％；

将酶解物加热至100℃灭酶10min，冷却，3000r/min离心5min，得上清液；将上清液在压力为15Bar，温度为15℃的条件下纳滤脱盐，至纳滤后溶液体积为纳滤前溶液体积的1/3止，将纳滤后的溶液冷冻干燥，得到玉米蛋白水解物。

实施例2

将玉米黄粉膨化后(膨化处理同实施例1)用去离子水配置成浓度为10％(w/v)的悬液，加入玉米黄粉质量1.2％的α-淀粉酶(购自北京奥博星公司)，60℃反应1.5h去除淀粉。向去淀粉后的溶液中加入玉米黄粉质量0.8％的纤维素酶(购自南宁东恒华道酶制剂公司)，45℃反应1.5h去除纤维素。在100℃的条件下灭酶10min，10000rpm离心15min，取沉淀蒸煮后烘干得玉米黄粉；

按照400U/g玉米黄粉的添加量取中性蛋白酶(购自丹麦诺维信)，与玉米黄粉混合，40℃、pH6.5条件下水解2h，得酶解物，所得玉米蛋白源抗粘附肽的回收率为总蛋白的18.6％；

将酶解物加热至90℃灭酶5min，冷却，5000r/min离心15min，得上清液；将上清液在压力为25Bar，温度为25℃的条件下纳滤脱盐，至纳滤后溶液体积为纳滤前溶液体积的2/3止，将纳滤后的溶液冷冻干燥，得到玉米蛋白水解物。

实施例3

将玉米黄粉膨化后(膨化处理同实施例1)用去离子水配置成浓度为10％(w/v)的悬液，加入玉米黄粉质量0.8％的α-淀粉酶(购自北京奥博星公司)，70℃反应2.5h去除淀粉。向去淀粉后的溶液中加入玉米黄粉质量1.2％的纤维素酶(购自南宁东恒华道酶制剂公司)，55℃反应2.5h去除纤维素。在100℃的条件下灭酶10min，10000rpm离心15min，取沉淀蒸煮后烘干得玉米黄粉；

按照800U/g玉米黄粉的添加量取中性蛋白酶(购自丹麦诺维信)，与玉米黄粉混合，50℃、pH7.5条件下水解3h，得酶解物，所得玉米蛋白源抗粘附肽的回收率为总蛋白的17.4％；

将酶解物加热至110℃灭酶15min，冷却，3500r/min离心8min，得上清液；将上清液在压力为18Bar，温度为22℃的条件下纳滤脱盐，至纳滤后溶液体积为纳滤前溶液体积的2/3止，将纳滤后的溶液冷冻干燥，得到玉米蛋白水解物。

实施例4

与实施例1的区别在于在玉米黄粉中添加的蛋白酶为碱性蛋白酶，水解pH为8.5，水解温度为60℃，其余均同实施例1，所得玉米蛋白源抗粘附肽的回收率为总蛋白的32.6％。

实施例5

与实施例1的区别在于在玉米黄粉中添加的蛋白酶为蛋白酶P(购自于Amano酶制剂公司)，水解pH为7.0，水解温度为45℃，其余均同实施例1，所得玉米蛋白源抗粘附肽的回收率为总蛋白的8.7％。

实施例6

利用H.pylori ATCC43504菌株作为抗粘附活性试验测定菌株。在37℃条件下将经过冻存的幽门螺旋杆菌菌株解冻，先与液体培养基(3g大豆蛋白胨、2.5g K₂HPO₄、17g胰蛋白胨和5g NaCl，加入1L去离子水，混合摇匀溶解后调节pH值至7.2，121℃、0.1Mpa灭菌1h)混合，随后将其接种于斜面培养基(15g胰蛋白胨、5g大豆蛋白胨、15g琼脂、5g NaCl和950mL去离子水，搅拌溶解调节pH至7.2，121℃、0.1Mpa灭菌1h，在培养基冷却至45℃左右，加入50mL无菌的脱纤维羊血，混匀后，倒入试管制作斜面培养基)上，在37℃微需氧(5％O₂，85％N₂，10％CO₂)条件下，培养48～72h，得到的菌液可进行菌种传代和抗粘附活性检测。

将传代的幽门螺旋杆菌的菌液，进行四次10倍梯度稀释获得五种不同浓度的菌液，在600nm条件下测定幽门螺旋杆菌菌液的OD值，同时通过平板涂布法计算菌落浓度，建立菌落浓度与OD₆₀₀的标准曲线，如图1所示。

冻存人胃粘膜上皮细胞(GES-1)解冻后移入细胞培养瓶中，细胞培养基组成包括1％青链霉素混合液、10％胎牛血清和90％DMEM培养基。在37℃，5％CO₂条件下孵育至单层细胞形成，胰蛋白酶-EDTA消化传代，离心，用不含抗生素的细胞培养基重悬，调整细胞浓度为3×10⁵cells/mL。将细胞悬液接种到96孔板中，每孔100μL，在37℃，5％CO₂培养箱中培养孵育24h，用于拮抗H.pylori粘附活性的测定实验。

异硫氰酸荧光素(FITC)标记幽门螺旋杆菌

制备FITC浓度为2mg/mL的DMSO溶液，无菌滤膜过滤处理。按照1:1的比例将幽门螺旋杆菌菌液与其混匀，在避免光照的条件下，生化摇摆台上混合30min后，在4500r/min的转速下离心处理3min，除去上清液，经过1×PBS缓冲液洗涤3次，除去多余的FITC，最后将菌液在液体培养基(3g大豆蛋白胨、2.5g K₂HPO₄、17g胰蛋白胨和5g NaCl，加入1L去离子水，混合摇匀溶解后调节pH值至7.2，121℃、0.1Mpa灭菌1h)上稀释至OD₆₀₀值在0.1左右(10⁸cfu/mL)，备用。

FITC荧光强度值与OD₆₀₀标准曲线的构建

将上步经过FITC标记处理的幽门螺旋杆菌菌液，按照梯度稀释成六个浓度，在激发波长485nm和发射波长530nm条件下，测量其荧光强度值，与此同时在600nm条件下测OD值，建立FITC荧光强度值和OD₆₀₀的标准曲线，如图2所示。

玉米蛋白水解物拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性试验

使用无抗生素的细胞培养基，配制一定蛋白浓度的玉米蛋白水解物(实施例1所得)溶液，按照1:1(v/v)的比例与经过FITC标记过的菌液在室温避光条件下进行混合30min，使实施例1所得玉米蛋白水解物终蛋白浓度分别为0.5、1、2、3、4、5mg/mL，测定不同浓度的中性蛋白酶玉米蛋白水解物拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性。向带有胃粘膜上皮细胞(GES-1)的96孔板中加入100μL混合后的菌液，在培养箱中放置90min。然后将溶液去除，用PBS缓冲液清洗3次，随即，将PBS缓冲液按照每孔100μL量加入，在发射波长530nm、激发波长485nm条件下进行荧光强度值的测定。依据荧光强度计算粘附抑制率。粘附抑制率采用以下公式计算：

结果如表1所示。

表1不同浓度中性蛋白酶水解物拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性

实施例7

与实施例6的区别在于将实施例1、4和5所得的玉米蛋白水解物稀释至浓度为4mg/mL的水解物，以100μg/mL瑞巴派特作为阳性对照，其余均同实施例6，测定不同蛋白酶水解物拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性，结果如表2所示。

表2不同蛋白酶水解物拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性

实施例8

玉米蛋白水解物对脲酶的抑制作用

配制A(水杨酸和亚硝基铁氰化钠溶液)液，使用PBS-EDTA溶液将700mM的水杨酸钠和9.73mM的亚硝基铁氰化钠溶解，得到所需的显色A液，放置在4℃条件下保存。B(碱性次氯酸盐溶液)液：通过PBS-EDTA将18g氢氧化钠溶解，取24mL的次氯酸钠(有效氯≧7.5％)进行混合，加入去离子水定容至100mL容量瓶中，同样在4℃环境下保存。将脲酶溶液(10U/mL)与不同浓度的实施例1玉米蛋白水解物(将实施例1所得玉米蛋白水解物分别用蒸馏水稀释至0.125、0.25、0.5、1、2、4、6、8、10mg/mL)样品按照各100μL进行混合，在37℃避光条件下反应20min，在室温和避光环境中，加入50mM尿素100μL，反应20min，随后加入贝洛特显色液显色200μL并进行充分的摇匀(先加100μL的A液，后加入100μLB液)，反应10min。在595nm条件下，使用PBS-EDTA溶液来替换样品作为对照组，加入指定溶液的溶剂作为空白组，吸取200μL上一步处理的溶液加入到96孔板上，使用酶标仪进行OD值的测量。按照下列公式计算抑制率：

结果如图3所示，表明不同浓度的本发明中性蛋白酶玉米蛋白水解物对脲酶均具有抑制作用。

实施例9

实施例1所得玉米蛋白水解物拮抗幽门螺旋杆菌粘附感染昆明小鼠试验

雄性昆明小鼠48只，分为6组，每组8只，分组如下：

①对照组：一直灌胃生理盐水5周；

②模型组：1-2周灌胃生理盐水，3-4周灌胃生理盐水+H.pylori菌液，5周灌胃生理盐水；

③200mg/kg·bw玉米蛋白水解物组：1-2周灌胃玉米蛋白水解物，3-4周灌胃玉米蛋白水解物+H.pylori菌液，5周灌胃玉米蛋白水解物；

④400mg/kg·bw玉米蛋白水解物组：1-2周灌胃玉米蛋白水解物，3-4周灌胃玉米蛋白水解物+H.pylori菌液，5周灌胃玉米蛋白水解物；

⑤600mg/kg·bw玉米蛋白水解物组：1-2周灌胃玉米蛋白水解物，3-4周灌胃玉米蛋白水解物+H.pylori菌液，5周灌胃玉米蛋白水解物；

⑥阳性对照组：1-2周灌胃三联抗生素，3-4周灌胃三联抗生素+H.pylori菌液，5周灌胃三联抗生素。

注：每次灌胃菌液前，禁食12h，灌胃后禁食禁水4h；菌液隔天灌胃，共灌胃5次。

于末次灌胃后禁食12h，取出小鼠胃部组织用于快速尿素酶反应、匀浆检测相关指标。

快速尿素酶反应

将小鼠胃部组织加入快速尿素酶反应溶液当中，快速尿素酶反应溶液本身为黄色，当有尿素酶存在时，尿素酶将溶液中的尿素分解产生氨气，使溶液的pH值升高，溶液由黄色变为红色，红色的深浅与尿素酶含量高低成正比。结果如图4所示。

由图4可以看出，对照组(A)溶液全部为黄色，表明均未感染H.pylori。模型组(B)溶液全部为深红色，表明8只小鼠均感染H.pylori，造模成功。低中高3个剂量的实施例1玉米蛋白水解物试验组表现出不同程度拮抗H.pylori感染功效，其中以中剂量组的效果最好，8只小鼠中仅有2只小鼠感染H.pylori，溶液呈红色，其余均为黄色。

小鼠胃组织中幽门螺旋杆菌含量分析

取一定质量的小鼠胃组织，按1:9加入PBS溶液匀浆，将匀浆液稀释系列浓度进行稀释涂布平板，计算小鼠胃组织中H.pylori含量。结果如表3所示。

表3各试验组小鼠胃组织H.pylori含量

注：各小写字母代表P＜0.05。

由表3可以看出，对照组不含有H.pylori，低中高三个剂量的玉米蛋白水解物组H.pylori含量在1.63～2.08×10⁵cfu/g胃组织，显著低于模型组(P＜0.05)，其中以400mg/kg·bw玉米蛋白水解物组H.pylori定植量最少，增大玉米蛋白水解物的剂量后，H.pylori的定植量并没有显著性改变(P＞0.05)。以上结果表明，通过一定剂量的玉米蛋白水解物干预，能够有效降低H.pylori在胃部的定植量。

取一定质量的小鼠胃组织匀浆，检测不同组别小鼠胃组织中氧化应激指标、炎症因子、TLR4/NF-κB通路的相关指标含量，结果如表4-6所示。

表4玉米蛋白水解物对幽门螺旋杆菌感染小鼠胃组织中氧化应激的影响

*代表与正常组相比有显著性差异(P＜0.05)；#代表与模型组相比有显著性差异(P＜0.05)

表5玉米蛋白水解物对幽门螺旋杆菌感染小鼠胃组织中细胞因子含量的影响

*代表与正常组相比有显著性差异(P＜0.05)；#代表与模型组相比有显著性差异(P＜0.05)；

表6玉米蛋白水解物对幽门螺旋杆菌感染小鼠胃组织中TLR4/NF-κB通路的影响

*代表与正常组相比有显著性差异(P＜0.05)；#代表与模型组相比有显著性差异(P＜0.05)

当幽门螺旋杆菌感染小鼠后，会刺激小鼠胃部氧化应激，产生炎症反应。由表4可知，与对照组相比，模型组MDA和MPO含量显著增加(P＜0.05)，分别增加了44.88％和31.69％，SOD和GSH-Px的含量显著降低(P＜0.05)，分别降低了40.48％和35.62％。与模型组相比，通过不同剂量的玉米蛋白水解物干预后，小鼠胃部组织中的氧化应激水平均显著降低(P＜0.05)，600mg/kg·bw玉米蛋白水解物组的效果最好，MDA、MPO、SOD和GSH-Px的含量与正常组相比无显著性差异(P＞0.05)，表明通过玉米蛋白水解物干预后，可以显著降低由幽门螺旋杆菌感染定植引起的胃部氧化应激水平(P＜0.05)。

由表5可知，通过不同剂量的玉米蛋白水解物干预后，与模型组相比，小鼠胃部组织的IL-6、IL-1β、TNF-α和KC含量均显著降低(P＜0.05)，高浓度玉米蛋白水解物干预组的效果最好，与正常组无显著性差异(P＞0.05)，表明通过玉米蛋白水解物干预后，能够通过降低细胞内促炎因子和趋化因子含量，减轻炎症反应，从而保护胃细胞免受由幽门螺旋杆菌感染带来的炎症反应。

由表6可知，与正常组相比，模型组中TLR4、MyD88和NF-κB含量显著增加(P＜0.05)，表明幽门螺旋杆菌可能是通过TLR4/NF-κB通路的激活，导致幽门螺旋杆菌感染胃粘膜上皮细胞后产生炎症反应。与模型组相比，通过不同剂量的玉米蛋白水解物干预后，可以有效降低由幽门螺旋杆菌感染引起的TLR4、MyD88和NF-κB含量的增加，表明玉米蛋白水解物可能是通过抑制TLR4/NF-κB通路的激活，达到有效遏制幽门螺旋杆菌感染后胃粘膜损伤机制。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种玉米蛋白水解物在制备拮抗幽门螺旋杆菌感染产品中的应用，其特征在于，所述玉米蛋白水解物的制备方法包括如下步骤：将预处理后的玉米黄粉用蛋白酶水解，得酶解物，将酶解物进行灭酶处理后取上清液，纳滤、干燥得玉米蛋白水解物；

所述蛋白酶选自中性蛋白酶、碱性蛋白酶或蛋白酶P；

所述蛋白酶的添加量为400～800U/g玉米黄粉；

采用中性蛋白酶时，所述水解的温度为40℃～50℃，所述水解的时间为2h～3h，所述水解的pH值为6.5～7.5；

所述预处理包括如下步骤：将玉米黄粉膨化、去淀粉、去纤维素、蒸煮即得预处理后的玉米黄粉；

所述去淀粉包括如下步骤：向玉米黄粉悬浮液中加入α-淀粉酶后，60℃～70℃水解1.5h～2.5h；所述α-淀粉酶的添加量为玉米黄粉质量的0.8％～1.2％；

所述去纤维素包括如下步骤：向去淀粉后的玉米黄粉悬浮液中加入纤维素酶后，45℃～55℃水解1.5h～2.5h；所述纤维素酶的添加量为玉米黄粉质量的0.8％～1.2％；

所述灭酶的温度为90℃～110℃，所述灭酶的时间为5min～15min。

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