CN116355982B - 一种米糠蛋白水解物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种米糠蛋白水解物及其制备方法与应用，属于生物活性肽制备技术领域。本发明提供的米糠蛋白水解物的制备方法，包括如下步骤：将米糠蛋白粉与蛋白酶混合水解，得水解物，将水解物进行灭酶处理后取上清液，纳滤、干燥得米糠蛋白水解物。采用本发明制备方法制备所得的米糠蛋白水解物具有显著抑制幽门螺旋杆菌粘附人胃粘膜上皮细胞的功能，可用于制备幽门螺旋杆菌粘附抑制剂，预防幽门螺旋杆菌感染。另外，本发明原料安全、价格低廉，成功解决了现阶段抗生素治疗幽门螺旋杆菌感染副作用大、耐药性逐年上升等问题，同时本发明米糠蛋白水解物能够对幽门螺旋杆菌的感染起到预防作用。
Description
技术领域
本发明属于生物活性肽制备技术领域，尤其涉及一种米糠蛋白水解物及其制备方法与应用。
背景技术
幽门螺旋杆菌（Helicobacter pylori, H. pylori）是一种致病性极强的病原菌，在1994年H. pylori被世界卫生组织认定为Ⅰ类致癌因子。H. pylori具有免疫逃逸机制，感染者很难依靠自身的免疫系统来清除病原体。如果不进行治疗，患胃癌的可能性较大。目前治疗H. pylori感染的主流方案为抗生素疗法，包括标准的基于克拉霉素的三联疗法以及基于铋剂的四联疗法等。但长期以来，抗生素的大量使用也导致H. pylori耐药菌株的出现，使抗生素的疗效持续下降。抗生素的使用也会带来一些副作用，如腹泻、腹痛以及胃肠道微生物群紊乱等。显然抗生素疗法存在很大弊端，因此，积极寻找其他应对H. pylori感染的策略是十分必要的。
国内外学者已经发现了许多种具有抑制H. pylori感染活性的天然来源物质，如秋葵多糖、岩藻多糖、豌豆肽和卵粘蛋白肽等，这些物质都具有拮抗H. pylori感染活性。相比于抗生素，这些天然来源物质更加安全温和，且没有耐药的问题。因此，选择天然来源物质来预防H. pylori感染是十分理想的。
米糠是稻谷加工的主要副产物之一，产量巨大且价格低廉。我国每年米糠产量可达千万吨级，但只有少量用于生产米糠油等高附加值产品，大部分用作饲料原料或丢弃，造成了资源的浪费。因此，加大对米糠的开发和应用力度具有重要的社会和经济意义。目前对米糠蛋白的研究主要为米糠蛋白水解物的生物活性研究，已报道的米糠蛋白水解物具有抗氧化、降压等活性，但对于米糠蛋白水解物拮抗H. pylori感染活性的研究未见报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种米糠蛋白水解物的制备方法，经本发明制备方法制备所得的米糠蛋白水解物具有显著抑制胃部幽门螺旋杆菌粘附作用。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种米糠蛋白水解物的制备方法，包括如下步骤：将米糠蛋白粉与蛋白酶混合水解，得水解物，将水解物进行灭酶处理后取上清液，纳滤、干燥得米糠蛋白水解物。
优选的，所述蛋白酶包括中性蛋白酶、碱性蛋白酶、蛋白酶N或蛋白酶P。
优选的，所述蛋白酶的添加量为400~800U/g米糠蛋白粉。
优选的，所述水解的温度为45℃~60℃，所述水解的时间为100min~140min，所述水解的pH值为6.5~8.5。
本发明还提供了一种上述任意一项所述制备方法制备所得的米糠蛋白水解物。
本发明还提供了一种上述米糠蛋白水解物在制备抑制胃部幽门螺旋杆菌粘附产品中的应用。
本发明的有益效果：
采用本发明制备方法制备所得的米糠蛋白水解物具有显著抑制幽门螺旋杆菌粘附人胃粘膜上皮细胞的功能，可用于制备幽门螺旋杆菌粘附抑制剂，预防幽门螺旋杆菌感染。另外，本发明原料安全、价格低廉，成功解决了现阶段抗生素治疗幽门螺旋杆菌感染副作用大、耐药性逐年上升等问题，同时本发明米糠蛋白水解物能够对幽门螺旋杆菌的感染起到预防作用。
附图说明
图1为米糠蛋白水解物抑制幽门螺旋杆菌粘附人胃粘膜上皮细胞机理图；
图2为菌落浓度与菌悬液光密度值（OD600）标准曲线图；
图3为异硫氰酸荧光素荧光强度值与菌悬液光密度值（OD600）标准曲线图。
具体实施方式
本发明提供了一种米糠蛋白水解物的制备方法，包括如下步骤：将米糠蛋白粉与蛋白酶混合水解，得水解物，将水解物进行灭酶处理后取上清液，纳滤、干燥得米糠蛋白水解物。
在本发明中，所述米糠蛋白粉优选的为购自于陕西帕尼尔有限公司的米糠蛋白粉。在本发明中，优选的需将米糠蛋白粉配制成悬液后再与蛋白酶混合，所述悬液中米糠蛋白粉的浓度优选的为11%（w/v）~13%（w/v），更优选的为12%（w/v），所述悬液中的液体优选的为水。在本发明中，所述蛋白酶优选的包括中性蛋白酶、碱性蛋白酶、蛋白酶N或蛋白酶P，本发明对于上述各种蛋白酶的具体来源没有特殊限定。
将米糠蛋白粉与蛋白酶混合时，所述蛋白酶的添加量以每g米糠蛋白粉计，优选的为400~800U，更优选的为500~700U。混合后，进行水解，所述水解的温度优选为45℃~60℃，更优选为50℃~58℃，所述水解的时间优选为100min~140min，更优选为110min~130min，所述水解的pH值优选为6.5~8.5，更优选为6.8~8.0。
在本发明中，获得水解物后，需进行灭酶处理。所述灭酶的温度优选为90℃~110℃，更优选为100℃，所述灭酶的时间优选为5min~15min，更优选为10min。灭酶后，离心，所述离心的转速优选为3000r/min~5000r/min，更优选为4000r/min，所述离心的时间优选为5min~15min，更优选为10min。离心后，取上清液进行纳滤处理，所述纳滤的压力优选为15～25Bar，更优选为20Bar，所述纳滤的温度优选为15℃~25℃，更优选为20℃，纳滤后的溶液体积优选为纳滤前溶液体积的1/3~2/3。本发明纳滤能够去除钠离子，防止影响活性肽品质。纳滤结束后收集溶液，干燥得米糠蛋白水解物，在本发明中，所述干燥优选的为冷冻干燥或喷雾干燥，本发明对于冷冻干燥或喷雾干燥的具体条件没有特殊限定，采用本领域常规冷冻干燥或喷雾干燥条件即可。
本发明还提供了一种上述任意一项所述制备方法制备所得的米糠蛋白水解物。
本发明还提供了一种上述米糠蛋白水解物在制备抑制胃部幽门螺旋杆菌粘附产品中的应用。
在本发明中，所述产品优选的包括药物、食品和保健品。采用本发明制备方法制备所得的米糠蛋白水解物抑制幽门螺旋杆菌粘附人胃粘膜上皮细胞的机理图如图1所示。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
以米糠蛋白粉（购买自陕西帕尼尔有限公司）为原料，将米糠蛋白粉先用水配制成底物浓度12%（w/v）的悬液，按照600U/g米糠蛋白粉的添加量加入中性蛋白酶（购自丹麦诺维信），与米糠蛋白粉混合，在45℃、pH7.5条件下水解100min，得水解物；将水解物加热至100℃灭酶10min，冷却，3000r/min离心5min，得上清液；将上清液在压力为20Bar，温度为20℃的条件下纳滤脱盐，至纳滤后溶液体积为纳滤前溶液体积的1/3，将纳滤后的溶液冷冻干燥，得到米糠蛋白水解物。
实施例2
与实施例1的区别在于添加的蛋白酶为碱性蛋白酶（购自丹麦诺维信），水解条件为：60℃、pH8.5、水解120min，其余均同于实施例1。
实施例3
与实施例1的区别在于添加的蛋白酶为蛋白酶N（购自Amano酶制剂公司），水解温度50℃、pH7.0条件下水解120min，其余均同于实施例1。
实施例4
与实施例1的区别在于添加的蛋白酶为蛋白酶P（购自Amano酶制剂公司），水解温度45℃、pH7.0条件下水解140min，其余均同于实施例1。
实施例5
与实施例3的区别在于蛋白酶N添加量为800U/g米糠蛋白粉的添加量，其余均同于实施例3。
对比例1
与实施例2的区别在于碱性蛋白酶添加量为1200U/g米糠蛋白粉的添加量，其余均同于实施例2。
对比例2
与实施例1的区别在于添加的蛋白酶为木瓜蛋白酶（购自南宁东恒华道生物科技有限责任公司），水解条件为：50℃、pH8.0、水解120min，其余均同于实施例1。
对比例3
与实施例1的区别在于添加的蛋白酶为风味蛋白酶（购自丹麦诺维信），水解条件为：50℃、pH7.0、水解130min，其余均同于实施例1。
实施例6
分别对实施例1~5、对比例1~3所得的米糠蛋白水解物进行抗幽门螺旋杆菌粘附活性的测定，具体方法如下：
（1）幽门螺旋杆菌和人胃粘膜上皮细胞的传代培养
利用H.pylori ATCC43504菌株作为抗粘附活性试验测定菌株。在37℃条件下将经过冻存的幽门螺旋杆菌菌株解冻，先与液体培养基（3 g大豆蛋白胨、2.5 g K2HPO4、17 g胰蛋白胨和5 g NaCl，加入1L去离子水，混合摇匀溶解后调节pH值至7.2，121℃、0.1Mpa灭菌1h）混合，随后将其接种于斜面培养基（15 g胰蛋白胨、5 g大豆蛋白胨、15 g琼脂、5 g NaCl和950 mL去离子水，搅拌溶解调节pH至7.2，121℃、0.1Mpa灭菌1 h，在培养基冷却至45℃左右，加入50 mL无菌的脱纤维羊血，混匀后，倒入试管制作斜面培养基）上，在37℃微需氧（5%O2，85% N2，10% CO2）条件下，培养48 ~ 72 h，得到的菌液可进行菌种传代和抗粘附活性检测。
将传代的幽门螺旋杆菌的菌液，进行四次10倍梯度稀释获得五种不同浓度的菌液，在600 nm条件下测定幽门螺旋杆菌菌液的OD值，同时通过平板涂布法计算菌落浓度，建立菌落浓度与OD600的标准曲线，如图2所示。
冻存人胃粘膜上皮细胞（GES-1）解冻后移入细胞培养瓶中，细胞培养基组成包括1%青链霉素混合液、10%胎牛血清和90% DMEM培养基。在37℃，5% CO2条件下孵育至单层细胞形成，胰蛋白酶-EDTA消化传代，离心，用不含抗生素的细胞培养基重悬，调整细胞浓度为3×105cells/mL。将细胞悬液接种到96孔板中，每孔100μL，在37℃，5% CO2培养箱中培养孵育24 h，用于拮抗H. pylori粘附活性的测定实验。
（2）异硫氰酸荧光素（FITC）标记幽门螺旋杆菌
制备FITC浓度为2 mg/mL的DMSO溶液，无菌滤膜过滤处理。按照1:1的比例将幽门螺旋杆菌菌液与其混匀，在避免光照的条件下，生化摇摆台上混合30 min后，在4500 r/min的转速下离心处理3 min，除去上清液，经过1×PBS缓冲液洗涤3次，除去多余的FITC，最后将菌液在液体培养基（3 g大豆蛋白胨、2.5 g K2HPO4、17 g胰蛋白胨和5 g NaCl，加入1L去离子水，混合摇匀溶解后调节pH值至7.2，121℃、0.1Mpa灭菌1 h）上稀释至OD600值在0.1左右（108 cfu/mL），备用。
（3）FITC荧光强度值与OD600标准曲线的构建
将上步经过FITC标记处理的幽门螺旋杆菌菌液，按照梯度稀释成六个浓度，在激发波长485 nm和发射波长530 nm条件下，测量其荧光强度值，与此同时在600 nm条件下测OD值，建立FITC荧光强度值和OD600的标准曲线，如图3所示。
（4）米糠蛋白水解物抗粘附活性试验
使用无抗生素的细胞培养基，配制一定蛋白浓度的米糠蛋白水解物（分别为实施例1~5、对比例1~3所得）溶液，按照1:1(v/v)的比例与经过FITC标记过的菌液在室温避光条件下进行混合30 min，使实施例1~5、对比例1~3所得米糠蛋白水解物终蛋白浓度分别为4mg/mL，测定该浓度的复合蛋白酶米糠蛋白水解物拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性，以不添加米糠蛋白水解物的细胞培养基作为阴性对照。向带有胃粘膜上皮细胞（GES-1）的96孔板中加入100μL混合后的菌液，在培养箱中放置90 min。然后将溶液去除，用PBS缓冲液清洗3次，随即，将PBS缓冲液按照每孔100μL量加入，在发射波长530 nm、激发波长485 nm条件下进行荧光强度值的测定，每一个组别均进行五次重复试验，依据荧光强度计算粘附抑制率。粘附抑制率采用以下公式计算：
实施例1~5、对比例1~3所得的米糠蛋白水解物在蛋白浓度为4mg/mL时的抗粘附活性结果如表1所示，采用平均数±标准差表示。
表1 不同组别米糠蛋白水解物的抗幽门螺旋杆菌粘附活性
| 组别 | 粘附抑制率（%） |
| 实施例1 | 17.64±2.57% |
| 实施例2 | 13.55±2.85% |
| 实施例3 | 22.21±1.81% |
| 实施例4 | 5.42±1.17% |
| 实施例5 | 8.74±0.79% |
| 对比例1 | 3.42±1.63% |
| 对比例2 | 0% |
| 对比例3 | 0% |
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种米糠蛋白水解物在制备抑制胃部幽门螺旋杆菌粘附产品中的应用，其特征在于，所述米糠蛋白水解物的制备方法，包括如下步骤：将米糠蛋白粉与蛋白酶混合水解，得水解物，将水解物进行灭酶处理后取上清液，纳滤脱盐、干燥得米糠蛋白水解物；
所述蛋白酶包括中性蛋白酶、碱性蛋白酶、蛋白酶N或蛋白酶P；
所述蛋白酶的添加量为600~800U/g米糠蛋白粉；
所述水解的温度为45℃~60℃，所述水解的时间为100min~140min，所述水解的pH值为7.0~8.5。
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