CN104450839A - 具有ace抑制活性的米糠蛋白肽的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有ACE抑制活性的米糠蛋白肽的制备方法，该方法以米糠为原料，首先提取米糠蛋白，然后采用酶解法制备米糠蛋白水解物，再采用超滤法、葡聚糖凝胶Sephadex G-15、RP-HPLC法对米糠ACE抑制肽进行分离纯化。本发明有效利用了现有丰富且廉价的米糠资源，加工制备出了具有高ACE抑制活性的米糠蛋白肽。本发明将米糠ACE抑制肽的降压功能得到最大化利用，一方面增加了米糠的附加值，创造出好的经济效益和市场价值；另一方面，有效缓解高血压的发病率、控制高发病率，保卫人类免受高血压的危害，具有良好的应用价值和社会效益，同时也为研究米糠蛋白ACE抑制肽结构和降血压机理提供了一定的理论基础和实验依据。

Description

具有ACE抑制活性的米糠蛋白肽的制备方法

技术领域

本发明属于食品技术领域，涉及一种具有ACE抑制活性的米糠蛋白肽的制备方法。

背景技术

稻谷是我国第一大粮食品种，年总产量1.8～2.0亿吨左右，占全国粮食总产量的42％、世界稻谷总产量35％左右。米糠是稻谷的副产品之一，目前我国拥有量在1000万吨左右，是一种量大面广的可再生资源。然而我国对于米糠的深度开发利用及相应理论研究尚处于低水平阶段，大部分作为畜禽饲料被浪费了，仅有10％～15％用来榨油或提取植酸钙、肌醇、谷维素等较高价值的再生产品。

米糠是一种具有很大开发潜力的食品、化工和药物原料，据估计米糠经综合利用后其经济效益可提高10倍以上。联合国工业发展组织(UNIDD)把米糠称为一种未能充分利用的宝贵资源，我国也将米糠综合利用作为“九五”、“十五”期间粮食深加工研究和开发的重点。米糠重量虽只占稻米重量的6％～8％，但却含有90％以上人体必需元素，其主要成分为14％～24％油脂、12％～18％蛋白质、33％～53％无氮浸出物、8％～12％灰分、7％～14％水分；除此之外，米糠还含有抗癌及其他促进人体健康的功能型物质，如膳食纤维、维生素、矿物质、谷维素、植酸、蛋白酶抑制剂等；同时还可以从廉价的米糠资源中获得高价值的营养物质或生物活性物质，如蛋白质、蛋白活性肽、生育酚、二十八碳烷醇、角鲨烯、神经酰胺等，对人体健康和现代文明病的预防及治疗具有重要作用。

近年来随着科学研究的不断深入，生物活性肽由于具有品种多、应用范围广、无毒副作用、吸收快、效率高和被吸收的氨基酸组成平衡等优点，正广泛应用于食品、医药和饲料等行业。经研究表明，活性肽都以非活性状态存在于蛋白质长链中，当采用适当的水解方法得 到这些低肽时，其活性就会释放出来。生物活性肽的功能特性及生理活性与其分子量大小及氨基酸链长短、组成结构密切相关。与游离氨基酸相比，寡肽转运系统速度更快，并且具有耗能低、不易饱和的特点。许多活性肽具有原蛋白质或其组成氨基酸所没有的功能，它们与机体的各种功能调节、疾病的发生以及免疫、内分泌、衰老、代谢等有着非常紧密的联系，在生命活动中起着显著作用，可广泛用作药物、疫苗和食品营养制剂等。如今已证实了，米糠蛋白肽更易于被人体吸收利用，同时兼具低过敏性、溶解性好等特点。并且米糠蛋白肽在抗氧化、降血压血脂、血管紧张素转换酶抑制活性、阿片样拮抗活性、免疫调节等生物功能活性方面都已有相关报道，是一种非常有实用前途的功能活性肽。其中米糠蛋白血管紧张素转换酶抑制肽越来越受到研究者的重视，它通过抑制血管紧张素转换酶(ACE)活性，从而起到缓解血压升高的作用，其生物保健功能及药用功能不可小视。

生物活性肽具有品种多、应用范围广、无毒副作用、吸收快、效率高和被吸收的氨基酸组成平衡等优点，目前正广泛应用于食品、医药等行业。ACE抑制肽是对现代常见病-高血压具有良好生理调节功效的一类生物活性肽。与化学合成ACE抑制剂或药物相比，从天然食源性物质中获取的ACE抑制剂虽见效相对较慢，但更易被人体吸收利用，同时调节血压时效更长、相对温和持久，尤为关键的是对人体肾脏、肝脏等器官无毒副作用。尽管如此，我国目前对于ACE抑制肽等降压肽的研究尚属于起步阶段，且大多集中在大豆肽和玉米肽等的研究^[21]，仅有极少量报道米糠蛋白降压肽；并且对于分离纯化ACE抑制肽并无系统的方法，一级结构鉴定、分析其与ACE抑制活性的关系等相关研究也尚处于空白状态；仅仅处于实验室基础研究阶段，并没有扩展工业化生产。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有ACE抑制活性的米糠蛋白肽的制备方法，该方法有效利用了现有丰富且廉价的米糠资源，加工制备出了具有高ACE抑制活性的米糠蛋白肽。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一、以米糠为原料，采用碱法提取米糠蛋白；

二、向米糠蛋白中加入蒸馏水，控制底物浓度为1.0～6.0mg/mL，充分搅拌溶解后，调节pH值为7.5～10。再添加一定比例的蛋白酶后放于恒温水浴中，使其发生酶解反应，控制酶添加量为500～5000u/g，酶解温度为30～55℃，水解时间为0.5～10h；反应结束后，迅速升温至94～96℃保持10～15min，对蛋白酶进行充分的灭活处理；离心分离酶解液，即得米糠蛋白水解液；

三、采用超滤法初级分离米糠蛋白水解液，控制超滤操作温度为20～25℃，超滤操作压力在0.1～0.4MPa范围内，截留分子量＜6KDa。

四、采用葡聚糖凝胶Sephadex G-15纯化步骤三获得的米糠ACE抑制肽；

五、采用RP-HPLC法分离纯化步骤四获得的米糠ACE抑制肽，得到纯化的米糠ACE抑制肽。

本发明有效利用了现有丰富且廉价的米糠资源，加工制备出了具有高ACE抑制活性的米糠蛋白肽，探索出一种实用、高效的分离纯化米糠ACE抑制肽的连续色谱，并测定其氨基酸组成及氨基酸序列，得到其一级结构，进而将纯化后的米糠ACE抑制肽添加到原料中，加工制得有降血压功效的功能性保健食品、药品等。本发明将米糠ACE抑制肽的降压功能得到最大化利用，一方面增加了米糠的附加值，创造出好的经济效益和市场价值；另一方面，有效缓解高血压的发病率、控制高发病率，保卫人类免受高血压的危害，具有良好的应用价值和社会效益，同时也为研究米糠蛋白ACE抑制肽结构和降血压机理提供了一定的理论基础和实验依据。

附图说明

图1为米糠ACE抑制肽的制备、分离纯化及结构表征、其他相关性质研究的实验技术流程图；

图2为酶解法制备米糠ACE抑制肽实验流程图；

图3为超滤法初步分离米糠蛋白肽的实验装置流程图；

图4为测定蛋白酶活力的酪氨酸标准曲线；

图5为经各蛋白酶酶解后米糠蛋白水解物的NSI、DH及ACE抑制活性；

图6为底物浓度对制备具有ACE抑制活性的水解物的影响；

图7为酶添加量对制备ACE抑制肽的影响；

图8为pH对制备ACE抑制肽的影响；

图9为酶解温度对制备ACE抑制肽的影响；

图10为底物浓度与酶添加量对ACE抑制率影响的响应面；

图11为底物浓度与酶添加量对ACE抑制率影响的等高线；

图12为底物浓度与pH对ACE抑制率影响的响应面；

图13为底物浓度与pH对ACE抑制率影响的等高线；

图14为底物浓度与酶解温度对ACE抑制率影响的响应面；

图15为底物浓度与酶解温度对ACE抑制率影响的等高线；

图16为酶添加量与pH对ACE抑制率影响的响应面；

图17为酶添加量与pH对ACE抑制率影响的等高线；

图18为酶添加量与酶解温度对ACE抑制率影响的响应面；

图19为酶添加量与酶解温度对ACE抑制率影响的等高线；

图20为pH与酶解温度对ACE抑制率影响的响应面；

图21为pH与酶解温度对ACE抑制率影响的等高线；

图22为酶解时间对制备ACE抑制肽的影响；

图23为超滤分离纯化得到的三个组分的IC₅₀值；

图24为米糠ACE抑制肽的分离纯化与结构表征分析实验流程；

图25为洗脱液为0.01M HCl时对Sephadex G-15柱层析分离纯化米糠ACE抑制肽的影响；

图26为洗脱液为1.0M HAc时对Sephadex G-15柱层析分离纯化米糠ACE抑制肽的影响；

图27为洗脱液为0.1M乙酸铵时对Sephadex G-15柱层析分离纯化米糠ACE抑制肽的影响；

图28为洗脱液为0.2M pH＝4.0，HAc-NaAc缓冲液时对Sephadex  G-15柱层析分离纯化米糠ACE抑制肽的影响；

图29为径高比为16mm∶250mm时对Sephadex G-15柱层析分离纯化米糠ACE抑制肽的影响；

图30为径高比为16mm∶300mm时对Sephadex G-15柱层析分离纯化米糠ACE抑制肽的影响；

图31为径高比对为16mm∶350mm时Sephadex G-15柱层析分离纯化米糠ACE抑制肽的影响；

图32为洗脱流速为0.2mL/min时对Sephadex G-15柱层析分离纯化米糠ACE抑制肽的影响；

图33为洗脱流速为0.8mL/min时对Sephadex G-15柱层析分离纯化米糠ACE抑制肽的影响；

图34为洗脱流速为0.5mL/min时对Sephadex G-15柱层析分离纯化米糠ACE抑制肽的影响；

图35为经Sephadex G-15分离纯化得到的5个组分的IC₅₀值；

图36为组分E的制备型RP-HPLC分离图谱；

图37为制备型RP-HPLC分离纯化组分E得到11个组分的IC₅₀值；

图38为组分E-9的RP-HPLC分析图谱；

图39为米糠ACE抑制肽E-9的氨基酸图谱；

图40为肽链骨架断裂及其碎片命名；

图41为米糠ACE抑制肽E-9的一级质谱图；

图42为米糠ACE抑制肽E-9的氨基酸碎片二级质谱图；

图43为米糠ACE抑制肽与目前市场上常见的降压药物进行了抑制ACE活性的比较实验流程；

图44为模拟体内消化对ACE抑制肽IC₅₀的影响；

图45为经ACE处理后对ACE抑制肽活性的影响；

图46为温度对ACE抑制肽活性的影响；

图47为pH对ACE抑制肽活性的影响。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。

本发明提供了一种具有ACE抑制活性的米糠蛋白肽的制备方法，包括以下内容：

(1)制备具有ACE抑制活性的米糠蛋白肽：

以米糠为原料，首先提取米糠蛋白，然后以ACE抑制率为主要的考察指标，用筛选出来的最优蛋白酶酶解米糠蛋白，制备具有ACE抑制活性的米糠蛋白水解物。

(2)分离纯化米糠ACE抑制肽及其结构的表征：

①超滤法分离米糠蛋白活性肽；

②葡聚糖凝胶Sephadex G-15分离纯化步骤①获得的米糠蛋白肽；

③RP-HPLC法分离纯化步骤②获得的米糠ACE抑制肽；

④氨基酸自动检测仪法检测步骤③获得的米糠蛋白ACE抑制肽的氨基酸组成；

⑤质谱测定米糠ACE抑制肽分子量，分析一级结构。

(3)米糠ACE抑制肽的模拟体内消化试验及其耐热性、耐酸碱性、耐ACE性等稳定性研究，并在体外与常见的化学合成类降压药物比较抑制ACE活性的效果。

关于米糠ACE抑制肽的制备、分离纯化及结构表征、其他相关性质研究的实验技术流程如图1所示。

1、酶解法制备米糠ACE抑制肽研究 

以ACE抑制率为主要的考察指标，采用米糠蛋白为原料，比较四种不同蛋白酶对其酶解的影响效果，筛选出制备具有ACE抑制活性的米糠蛋白肽的最佳制备酶，并利用Box-Behnken响应曲面分析方法对酶解法制备米糠ACE抑制肽反应进行了优化试验。然后采用中空纤维超滤膜对米糠蛋白水解物进行了初级分离纯化，为后续实验进一步分离纯化ACE抑制肽奠定研究基础。

实验流程见图2。

1.1米糠蛋白水解物的制备

1.1.1制备脱脂米糠 

向实验米糠中按1∶10(V∶V)比例加入正己烷，在室温条件下，充分搅拌30min，3000r/min离心10min，离心沉淀在室温下晾干后，再次粉碎即得实验用脱脂米糠，冷藏于4℃冰箱，备用。

1.1.2碱法制备米糠蛋白

脱脂米糠→加水混合(1∶10(V∶V))→NaOH调节pH值至9.45，碱溶→恒温水浴加热(50℃、3h，每10min调节pH保持在9.45)→离心(3500r/min，15min)，取上清液→HCL调pH至4.1～4.5，蛋白酸沉→离心(3000r/min，10min)→水洗沉淀三次→收集沉淀，冷冻干燥→米糠蛋白，于-12℃冰箱保存备用。

1.1.3酶法制备米糠蛋白水解液

准确称取米糠蛋白置于100mL烧杯中，加入蒸馏水，充分搅拌溶解后，用0.25M的NaOH调节pH值至所需值。再添加一定比例的蛋白酶后放于恒温水浴中，使其发生酶解反应，酶解时间根据实验需要来确定。反应结束后，迅速升温至95℃保持10min，对蛋白酶进行充分的灭活处理。酶解液以3500r/min离心10min，留取上清液。吸取少量上清液测定ACE抑制率及水解度后，将剩余上清液冷冻干燥，-12℃冰箱保存备用。

1.2制备米糠ACE抑制肽蛋白酶的筛选

1.2.1蛋白酶活力的测定

参照GB/T23527-2009中描述的蛋白酶活性的测定方法。

酶活性定义：1.00g固体酶粉(或1mL液体酶)，在40℃(酸性pH＝3.0、中性pH＝7.5、碱性pH＝10.5)条件下，1min水解酪素产生1.0μg酪氨酸为一个酶活力单位。

1.2.2制备米糠ACE抑制肽蛋白酶的筛选

称取一定量米糠蛋白置于100mL烧杯中，加入蒸馏水后恒温搅拌20min，水浴保温10min。分别调节pH值、温度至中性蛋白酶、碱性蛋白酶、复合风味蛋白酶、木瓜蛋白酶的最佳酶解pH及最佳酶解温度，添加蛋白酶，恒温水浴酶解反应4h，酶解过程每10min用1.0M的NaOH调节溶液保持最佳pH恒定。95℃灭酶10min，3500r/min离心10min，取上清液，测定其氮溶解指数(NSI)、水解度(DH)及ACE抑制活性，筛选出酶解米糠蛋白制备ACE抑制肽的最佳蛋白酶种类。

1.3制备米糠ACE抑制肽的单因素实验

1.3.1底物浓度对制备米糠ACE抑制肽的影响 

配制底物浓度分别为1.0mg/mL、2.0mg/mL、3.0mg/mL、4.0mg/mL、5.0mg/mL、6.0mg/mL，酶添加量3000u/g，pH＝8.5，45℃酶解4h，测定米糠蛋白酶解产物的ACE抑制率、水解度。

1.3.2酶添加量对制备米糠ACE抑制肽的影响 

底物浓度3.0mg/mL，酶添加量分别为500u/g、1000u/g、2000u/g、3000u/g、4000u/g、5000u/g，pH＝8.5，45℃酶解4h，测定米糠蛋白酶解产物的ACE抑制率、水解度。

1.3.3pH对制备米糠ACE抑制肽的影响 

底物浓度3.0mg/mL，酶添加量3000u/g，调节pH值分别至7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0，45℃酶解4h，测定米糠蛋白酶解产物的ACE抑制率、水解度。

1.3.4酶解温度对制备米糠ACE抑制肽的影响 

底物浓度3.0mg/mL，酶添加量3000u/g，pH＝9.0，分别在温度30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃恒温酶解4h，测定米糠蛋白酶解产物的ACE抑制率、水解度。

1.4米糠ACE抑制肽酶解反应的响应曲面优化

结合SPSS 13.0软件对各影响因素显著性分析的结果，确定单因素中底物浓度、酶添加量、pH、酶解温度均为制备米糠ACE抑制肽试验的主要考察因素(P＜0.05)。采用Design Expert 7.0.0实验设计 及统计分析软件中的Box-Behnken优化模型，设计制备米糠ACE抑制肽的响应曲面试验，因素水平编码见表1：

表1 制备具有ACE抑制活性的米糠蛋白肽的因素水平编码表

1.5水解时间对米糠ACE抑制肽抑制活性的影响

配制米糠蛋白浓度为3.9mg/ml，酶添加量3006u/g，pH＝9.1，恒温40℃水浴，分别进行酶解0.5h、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h以后，测定米糠蛋白酶解产物的ACE抑制率，以确定出制备米糠ACE抑制肽的最佳水解时间。

1.6超滤法初级分离具有ACE抑制活性的米糠蛋白肽

超滤是利用膜的筛分作用截留溶液中大于膜孔的大分子，使溶质与溶剂、小分子组分分离的膜过程，超滤膜孔大小及形状对分离起主要作用。超滤膜能分离大多数生物活性物质，具有无相变、无热量、能耗低、投资少、工艺设备简单、回收率高和处理速度快等优点，常用于样品分级分离、浓缩及脱盐，尤其适合浓缩蛋白质及酶类等、去掉热源以及分离恒体积洗涤等场合。当目标样品与杂质之间的分子量相差10倍以上时，具有较好的分离效果，分子量0.3～1000KDa范围的可溶性分子，超滤压力常采用0.1～1.0MPa。米糠蛋白水解产物是一种含蛋白质、肽、游离氨基酸和糖组分的混合物，混合物中多种成分的存在会在很大程度上影响米糠ACE抑制肽对ACE的抑制效果，除掉混合物中的对ACE无抑制活性的或低活性的物质，可以提高米糠蛋白酶解物对ACE的抑制活性。大量研究文献显示，大多数降血压肽分子量都在1.5kDa以下，并且大多都是由10个以下氨基酸残基 组成的小肽物质。因此用超滤法首先控制了水解产物分子量，同时可以除去水解物中的蛋白质、多肽以及其他的大分子物质。然后可以针对活性最高的组分进行SDS-PAGE电泳试验以测定器分子量范围，或者可以直接进行进一步的逐级分离与纯化试验。

首先按照图3的顺序连接好超滤装置，将各连接管的接口处密封紧，用蒸馏水预先反复冲洗超滤膜，直到流出的水清澈为止。超滤试验以常温20～30℃作为操作温度，控制超滤装置入口处压力保持在0.1～0.4MPa左右，样品溶液即米糠蛋白酶解物从中空纤维膜组件的侧面下端口进入膜组件，在泵内压力的作用下，从膜组件顶端口流出。恒流泵将米糠蛋白酶解液先压入截留分子量10KDa中空纤维膜组件，收集截留液、超滤液；然后将＜10KDa的超滤液压入截留分子量6KDa中空纤维膜组件，收集截留液、超滤液。超滤结束后，先用0.5mol/L的NaOH溶液正向冲洗30min，再用蒸馏水反向冲洗超滤系统30min，直到流出的超滤液清澈为止，使中空纤维膜装置性能恢复。测定收集的各截留液、超滤液的ACE抑制率，比较超滤前后水解物对ACE抑制活性的影响。

1.7检测指标的测定方法

1.7.1米糠蛋白水解物氮溶解指数的测定

根据刘海梅等人的研究结果，取米糠蛋白酶解物溶液10mL，用1.0mol/L的HCI或NaOH调节pH至7.0，静置20min后，4000r/min离心20min，取上清液测总氮量。

1.7.2米糠蛋白酶解产物水解度的测定

采用国外通用的pH-state法测定米糠蛋白酶解产物的水解度 (DH)。即用0.5mol/L的NaOH分别将水解开始及结束时的反应体系pH调至7.0，记录所消耗的碱液体积。

其中：

B-碱液NaOH的消耗体积，mL；M_b-碱液NaOH的摩尔浓度，0.5mol/L；

1/α-在pH＝7.0，50℃试验条件下，1/α＝2.26；M_P-样品蛋白质的总量，g；

h_tot-每克原料蛋白质中肽键的毫摩尔数，h_tot＝8.20mmol/g。

1.7.3ACE抑制活性的体外测定方法

参照Cushman等研究者的实验方法并加以改进，在体外测定ACE抑制活性的试验。反应试管内，首先加入25.0μL肽液样品(溶于pH＝8.3的0.1mol/L硼酸盐缓冲液，含0.3mol/L NaCI)和50.0μL的8.3mmol/L底物马尿酰组胺酰亮氨酸(HHL)(溶于相同的缓冲液中)于37℃恒温水浴保温5min。加入25.0μL的ACE(0.25U溶于2.5mL相同缓冲液中)，37℃反应60min，加入200.0μL的1.0mol/L HCl终止反应。然后于各试管中加人1.0mL乙酸乙酯，旋涡混合后离心(4000r/min，10min)；吸取1.0mL乙酸乙酯层移于另一试管中，放人120℃的烘箱中挥发溶剂30min，冷却至室温后加入4.0mL去离子水，充分振摇混合30s，在228nm波长下测定各组吸光值。ACE抑制率的计算公式：

其中：OD_a-不存在抑制剂时的光密度(对照组)；

OD_b-存在抑制剂与酶时的光密度(实验组)；

OD_c-抑制剂与酶都不存在时的光密度(空白组)。

定义ACE抑制活性达到50％时的抑制剂浓度为半抑制浓度 (mg/mL)，记为IC₅₀。

1.7.4米糠蛋白酶解物的蛋白含量测定方法

采用GB/T5009.5-2003中叙述的凯氏定氮法测定制备出的米糠蛋白及其蛋白水解物的总氮含量，然后换算成蛋白质含量。

1.8结果与讨论 

1.8.1米糠组成成分的测定结果

米糠中含量较多的是蛋白质、脂肪、淀粉、纤维素等，实验主要目的是获得具有较高营养、经济价值及具有较强市场应用性的米糠蛋白活性肽，首先对米糠中的主要成分进行了测定分析，结果如表2。

表2 原料米糠组成成分的分析结果

1.8.2碱法制备米糠蛋白

碱法制备米糠蛋白的提取率为47.12％，经冷冻干燥后，得到的米糠蛋白粉的蛋白纯度为88.98％。

1.8.3制备米糠ACE抑制肽蛋白酶的筛选

1.8.3.1绘制测定蛋白酶活力的标准曲线

酶活力的定义：1.00g固体或1mL液体蛋白酶，在一定温度和pH值条件下，1min水解蛋白产生1.0μg酪氨酸为一个酶活力单位，以u/g表示。以酪氨酸浓度为纵坐标，以吸光值为横坐标，绘制标准曲线(图4)，由回归方程得到未知酪氨酸浓度的计算公式为y＝109.27x-0.5367(R²＝0.9995)。

其中：A-由吸光度值查得相应酪氨酸量；N-样品稀释倍数；W-样品含水量。 

1.8.3.2制备米糠ACE抑制肽蛋白酶的筛选结果

不同蛋白酶具有不同的酶切割位点，水解具有高度专一性，可以 对蛋白质定位水解而产生目标蛋白活性肽类，对蛋白质营养价值破坏小，水解过程易控制。但由于ACE抑制肽没有固定的结构，所以酶法制备ACE抑制肽存在一定的盲目性，故筛选适合的蛋白酶是获得具有ACE抑制活性的米糠蛋白水解物的首要步骤。试验分别采用中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、复合蛋白酶这四种蛋白酶制剂，在各自最佳酶解反应条件对米糠蛋白进行4h水解反应后，测定酶解物的NSI值、DH及ACE抑制率，各蛋白酶的反应条件均参照表3的最佳反应条件进行，试验结果见图5。

表3 购买的实验用蛋白酶实测酶活结果及其最佳反应条件

实验号	蛋白酶	最适温度(℃)	最适pH	酶活力(u/g)
					1	中性蛋白酶	50	7.0	1.42×105
2	碱性蛋白酶	55	8.5	3.91×105
					3	木瓜蛋白酶	50	7.5	1.96×106
4	复合风味蛋白酶	50	7.0	2.54×104

由图5可以看出，米糠蛋白分别经碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶及复合风味蛋白酶四种蛋白酶的酶解后产生的酶解产物均具有ACE抑制活性，但存在很大差异，四种蛋白酶的水解产物的AEC抑制活性由强到弱的顺序为：碱性蛋白酶＞中性蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞复合风味蛋白酶；同时，各水解产物的水解度及氮溶解指数也有较大差别。

首先，由于碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶的酶切位点有一部分是相同的，故由图5可知，除了复合蛋白酶水解物的ACE抑制率比较小以外，其他蛋白酶水解物的ACE抑制率都在35.0％以上，其中碱性蛋白酶的ACE抑制率达到63.23％。而复合风味蛋白酶是一种用在中性或微酸性条件下的水解蛋白质的真菌蛋白酶/肽酶的复合体，由选育的米曲霉菌经发酵而制得，它具有内切蛋白酶和外切蛋白酶两种活性。在水解米糠蛋白的实验中，复合风味蛋白酶的水解效果不佳，ACE抑制率最低，仅为30.11％；水解度过高为25.56％，水解 过度、苦味重，其原因可能与蛋白酶和肽酶比例有关，如果调整蛋白酶与肽酶比例，对蛋白的水解效果可能会更好一些。

对于有限改性酶解，良好的蛋白肽功能特性基于良好的氮溶解指数以及控制其相应酶解过程的水解度。碱性蛋白酶和中性蛋白酶均为细菌蛋白酶，可能细菌蛋白酶比较适合植物蛋白的水解。因为从结果图5可以看到，经碱性蛋白酶和中性蛋白酶酶解得到的产物NSI值可达到80.0％左右，较为理想。但是由于碱性蛋白酶的水解位点要多于中性蛋白酶，而且碱性环境可能更有助于米糠蛋白的水解，所以碱性蛋白酶的水解度要远优于中性蛋白酶。由于中性蛋白酶的水解程度不够，大量的蛋白质水解成了较长的肽段，而碱性蛋白酶的水解程度高，将米糠蛋白酶解为较小的肽段，因而碱性蛋白酶在同一时间得到的水解产物ACE抑制活性明显高于中性蛋白酶的水解产物。但中性蛋白酶对于ACE的抑制活性不高，这也间接说明了有ACE抑制活性的肽类片断多数是一些短链多肽。而经中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、复合风味蛋白酶酶解得到的水解产物的NSI值、DH及ACE抑制率都达不到理想效果，并且碱性蛋白酶的价格要明显低于其他蛋白酶类，选择采用碱性蛋白酶作为改性及制备性用酶是经济可行的，所以本试验研究最终确定碱性蛋白酶酶解米糠蛋白制取ACE抑制肽。这也同时说明，用不同蛋白酶酶解米糠蛋白产生的酶解产物对AEC抑制活性存在较大差异，正确选择适合的蛋白酶对酶解产物ACE抑制活性具有重要意义。

1.9制备米糠ACE抑制肽的单因素实验结果

1.9.1底物浓度对制备米糠ACE抑制肽的影响结果

酶解反应是一个生化过程，在酶的催化过程中受诸多因素影响，各因素间相互联系、相互制约。米糠蛋白浓度对水解度和ACE抑制率的影响结果(图6)表明，酶解物的水解度与底物浓度呈反比例关系，底物浓度增加而水解度表现为逐渐下降，看见底物浓度过高不利于米糠蛋白酶解反应的发生。一方面底物浓度过高使得溶液环境中的有效水分含量降低，水分活度下降，抑制碱性蛋白酶活力，不利于米 糠蛋白水解；另一方面，底物浓度过高降低了碱性蛋白酶与目标米糠蛋白底物的接触机会，导致蛋白质溶解不够充分、分散性较差；在试剂生产中原料蛋白浓度过低造成多肽绝对产量低，势必通过反复生产来提高产量，使得能耗增加，没有实际生产应用的意义。与此同时，随着底物浓度由2.0mg/mL增加至3.0mg/mL，酶解产物的ACE抑制率呈显著性增加(P＜0.05)；随着底物浓度由3.0mg/mL增加至5.0mg/mL，酶解产物ACE抑制率及水解度均显著性降低(P＜0.05)；但底物浓度＞5.0mg/mL时，酶解产物ACE抑制率及水解度均未见显著性(P＞0.05)。综合考虑，确定制备米糠ACE抑制肽的蛋白底物浓度为3.0mg/mL，此时米糠蛋白水解物ACE抑制率为63.45％，水解度可以达到14.87％。

由图7可见，酶添加量对酶解产物ACE抑制率和水解度均有显著影响(P＜0.05)。随着蛋白酶添加量由500u/g增加至3000u/g时，酶解产物的水解度和ACE抑制率都明显增大(P＜0.05)。酶添加量3000u/g时，米糠蛋白水解物的ACE抑制率达到最大63.07％，此时的水解度为14.73％。随后当酶添加量＞3000u/g时，水解产物的ACE抑制率呈显著性减小趋势(P＜0.05)，而水解度不断增大，这可能是由于过度水解生成了ACE抑制活性较低的小分子蛋白肽。在酶解过程中，米糠大分子蛋白迅速减少，小分子肽迅速增多，而肽作为底物又会被碱性蛋白酶进一步酶解生成分子量更低的短肽，米糠蛋白与其酶解产物这二者存在与碱性蛋白酶的竞争性作用。随着不断增大碱性蛋白酶用量，体系反应速度也不断提升，在较短时间内的多数米糠蛋白大分子被酶解生成小分子肽；而当米糠蛋白经碱性蛋白酶水解到一定程度时，无论体系中蛋白酶浓度高或低，蛋白酶与大分子米糠蛋白的作用几率都会在很大程度上降低。主要原因是作用底物变成了多肽物质，并且蛋白酶也易发生自溶现象。综合考虑，最终选择最佳酶添加量为3000u/g为宜。

1.9.3pH对制备米糠ACE抑制肽的影响结果

溶液环境pH对酶促反应的影响主要是通过影响蛋白酶活力来实 现的，图8反映出溶液pH值在7.5～10.0范围内，米糠蛋白酶解物体系水解度和ACE抑制率的变化情况。随着溶液pH7.5～8.0逐渐升高，酶解产物水解度呈显著性增加(P＜0.05)，而其ACE抑制率未见显著性变化(P＞0.05)；随着pH8.0～9.0逐渐升高，酶解产物的ACE抑制活性呈现显著性增加(P＜0.05)，pH＝9.0时的米糠蛋白水解物ACE抑制活性最大，为65.11％；随后随着溶液pH值进一步上升，在pH9.0～10.0时，米糠蛋白水解产物的ACE抑制率及水解度均呈现逐步减小趋势，显著性降低(P＜0.05)。综合考虑，pH值对米糠蛋白酶解产物水解度和ACE抑制率的影响，选择pH＝9.0为碱性蛋白酶水解米糠蛋白制备ACE抑制肽的最适pH值。

1.9.4酶解温度对制备米糠ACE抑制肽的影响结果

酶解反应所用到的蛋白酶分子稳定性很大程度上影响着酶解温度的选择，蛋白酶分子的肽键具有特定的空间结构，当酶解温度过低时，则会影响反应体系中分子的运动速度，导致激烈程度变小，降低蛋白酶与目标底物碰撞的几率；但如果当酶解反应体系的温度超过某极限值，就会引起蛋白酶肽键的断裂，降低其活性。由图9可知，随着温度的升高，碱性蛋白酶水解米糠蛋白的水解度总体呈增加趋势，55℃时达到最大，但此时ACE抑制率却不高，原因可能是由于温度过高造成部分碱性蛋白酶失活及米糠蛋白变性。酶解温度30～40℃时，米糠蛋白水解产物的ACE抑制率显著性增加(P＜0.05)；酶解温度40～55℃时，米糠蛋白水解产物的ACE抑制活性显著性降低(P＜0.05)。综合考虑，选择40℃为制备制备米糠ACE抑制肽的酶解温度，既可以保证酶解产物具有较高的ACE抑制率67.41％，同时又控制了其水解度为13.84％。

1.10米糠ACE抑制肽酶解反应的响应曲面优化结果

1.10.1米糠ACE抑制肽酶解反应的实验结果及模型方差分析

运用SPSS for Windows 13.0统计软件分析出底物浓度、酶添加量、pH、酶解温度这四个因素均具有显著性(P＜0.05)，并确定出相应响应因素的显著实验数值，然后再根据Box-Behnken的中心组合 实验设计原理，采用Design Expert 7.0.0统计分析软件设计响应曲面试验，得到实验组合及结果见表4。X₁、X₂、X₃、X₄为底物浓度、酶添加量、pH、酶解温度这四个响应因素的编码值，以ACE抑制率作为响应指标，来探索碱性蛋白酶酶解米糠蛋白制备ACE抑制肽的最佳工艺条件，建立米糠多肽的ACE抑制活性的回归方程。

表4 米糠ACE抑制肽酶解反应的响应曲面表

底物浓度、酶添加量、pH以及酶解温度这四个因素对响应值米糠蛋白水解物的ACE抑制活性的影响并非简单的线性关系，回归方程中各个变量对响应值影响的显著性，是由F检验来判定的，概率P值越小，响应变量的显著性越高。运用Design Expert 7.0.0软件进行二次响应面回归分析，根据响应曲面试验结果，在不同实验条件下测得的米糠蛋白酶解物ACE抑制活性，以回归系数建立米糠蛋白水解物的ACE抑制率(Y)与底物浓度(X₁)、酶添加量(X₂)、pH(X₃)、酶解温度(X₄)四个因子优化得到如下多元二次响应面回归方程：Y＝-2319.0400-3.5027X₁+0.2967X₂+379.7047X₃+11.2395X₄+5.1000X₁X ₂+4.0900X₁X₃-0.04100X₁X₄-9.0200X₂X₃+9.7800X₂X₄-0.06800X₃X₄-5.6607X₁ ²-4.2723X₂ ²-19.9327X₃ ²-0.1669X₄ ²

表5 米糠ACE抑制肽酶解反应的响应曲面试验结果方差分析

(注：p值(Prob＞F)小于0.05，显著；p值(Prob＞F)大于0.05，不显著。)

由表5可知本发明中，底物浓度、酶添加量、酶解温度及pH这四个因素的p值相差较大，从方差分析可以看出模型显著性检验p＜0.05，表明该模型方程高度显著，酶解法制备米糠ACE抑制肽不同条件间的差异高度显著表明该模型具有统计学意义。而自变量一次项中的X₁、X₃、X₄，二次项X₁X₂、X₁X₃、X₁X₄、X₂X₃、X₂X₄、X₃X₄、X₁ ²、X₂ ²、X₃ ²、X₄ ²均显著(p＜0.05)。失拟项用来表示所用模型与实验拟合程度，也就是两者的差异程度。从回归方程各项方差的进一步检验可以看出，方程的失拟项较小，说明模型的预测值与实际值非常吻合；该模型失拟项P值为0.0566＞0.05，模型失拟项不显著，无失拟因素存在，也说明模型选择合适，可用该回归方程代替试验真实点对实验结果进行分析。该响应面实验设计方法是可靠的，说明酶解物ACE抑制率(Y)实际值与预测值之间具有较好的拟合度，因此该模型可用于预测响应值ACE抑制率(Y)的实际情况，可以用该回归方程代替实验真实点对实验结果进行分析。

一次项的回归系数绝对值的大小依次为B3＞B4＞B1＞B2，即影响酶解法制备米糠ACE抑制肽因素的顺序依次为：pH＞酶解温度＞底物浓度＞酶添加量。这表明酶添加量(X₂)对米糠蛋白水解物的ACE抑制活性影响最小，且不显著(p＞0.05)；底物浓度(X₁)、pH(X₃)、酶解温度(X₄)影响显著(p＜0.05)，其中pH(X₃)对ACE抑制率影响最大；X₁为负效应影响，X₃、X₄为正效应影响。

利用响应曲面设计实验，运用根据Box-Benhnken的中心组合试 验设计原理，选择对ACE抑制率有显著影响作用的四个因素：底物浓度(X₁)、酶添加量(X₂)、pH(X₃)、酶解温度(X₄)，做四因素三水平的响应面分析试验，得到优组合为：底物浓度3.9mg/mL、酶添加量3006u/g、pH＝9.1、酶解温度40℃。

1.10.2米糠ACE抑制肽酶解反应的双因素交互作用响应面分析

结合本发明中的二次回归方程及表5可知，二次项X₁X₂、X₁X₃、X₁X₄、X₂X₃、X₂X₄、X₃X₄均具有显著的交互作用(p＜0.05)，即底物浓度、酶添加量、pH以及酶解温度这四个因素中的每两个因素间均具有交互作用。通过立体响应面和等高线可解释说明试验中自变量和因变量的关系，如图10-21所示。图10-21中所描述的四个显著影响因素的响应面中，以米糠酶解物的ACE抑制率为考核指标，同时保证两个因素恒定，以研究另外两个因素对酶解产物ACE抑制率的影响。底物浓度和酶添加量之间交互作用如图10-11所示，从图中可以看出：底物浓度和酶添加量均对水解产物的ACE抑制率均有明显影响，底物浓度和酶添加量在最低水平附近时，相互作用最大。比较酶添加量、pH、酶解温度、底物浓度这四个因素中每两个因素的交互作用，对米糠蛋白水解物ACE抑制率的影响结果，均升高后降低，响应值呈抛物线形趋势，因此回归方程有极大值。结合方程与响应曲面可得到以米糠蛋白为原料，由碱性蛋白酶制备ACE抑制肽的最优工艺参数，接下来的任务就是考察水解时间对制备具有ACE抑制活性的米糠水解物的影响结果。

1.11水解时间对米糠ACE抑制肽抑制活性的影响结果

参照Hwang等人的研究报告，由于ACE抑制肽在一定温度及pH条件下的不同反应时间会在相当程度上影响其ACE抑制活性，故本实验研究了酶解时间对于米糠ACE抑制肽抑制活性的影响关系。由图22可知，碱性蛋白酶酶解米糠蛋白在2h以内，ACE抑制率急剧上升，而3～4h生成的水解物对ACE抑制活性增加趋势较为缓慢。导致这个试验现象的可能原因为，酶解开始2h碱性蛋白酶水解程度不够，大量的蛋白质水解成较长的肽段，然而随着水解时间的延长，水 解程度不断增高，米糠蛋白酶解为较小肽段。因而酶解时间0.5h～4h，蛋白酶解产物的ACE抑制活性随酶解时间延长而显著性增加(P＜0.05)，这也说明有抑制活性的肽片段大多是一些短肽类物质。酶解米糠蛋白4～6h，酶解物的ACE抑制率维持在较高水平69.0％～70.0％范围内，未见显著变化(P＞0.05)。当酶解时间超过6h后，酶解产物的ACE抑制活性呈现显著性降低(P＜0.05)。从碱性蛋白酶水解物的ACE抑制活性趋势线可以得出：酶解时间4h时，米糠蛋白水解物的抑制活性为最高。考虑到高度水解会导致苦味，为尽可能减少米糠白因水解引起的营养价值的改变，同时保持高ACE抑制活性的功能性，制备ACE抑制肽的水解时间选为4h。

1.12酶解法制备米糠ACE抑制肽的最佳工艺条件

目前尚未见有关从米糠中获得具有血管紧张素转换酶(ACE)抑制功能的活性肽的相关报道，本发明通过对蛋白酶酶解产物的ACE抑制活性研究，获得具有较高ACE抑制活性的米糠酶解产物，并利用响应曲面优化方法获得了最佳酶解反应条件。经过多次验证实验，得到酶解法制备米糠ACE抑制肽的最佳工艺条件，即底物浓度3.9mg/mL、酶添加量3006u/g、pH＝9.1、酶解温度40℃，冷冻干燥最佳工艺条件下制得的米糠蛋白酶解产物，分析结果如表6：蛋白水解度15.32％，ACE抑制率70.37％，IC₅₀值为1.50mg/mL，冷冻干燥此组分。可见得到的蛋白水解物对血管紧张素转换酶具有一定的抑制作用，但IC₅₀值较大，表明其ACE抑制活性较弱，需要对其进一步的分离纯化，以提高相应纯化产物对ACE的抑制活性，即降低活性组分的IC₅₀值。

根据以往的研究报道，通过酶解食源性蛋白可以获得具有较高ACE抑制活性的蛋白肽，具有安全性、无毒害的优点。米糠蛋白经过碱性蛋白酶酶解后产生的水解物的IC₅₀值，与其他研究报告中的食源性ACE抑制肽的比较结果显示出，其具有较高的ACE抑制活性。这也同时说明含有大量疏水性氨基酸的蛋白通过合适的蛋白酶酶解就会得到有ACE抑制活性的水解产物，也与经连续色谱纯化后得到 的ACE抑制肽的氨基酸分析结果相一致。

表6 酶解法制备米糠ACE抑制肽的最佳工艺的实验结果

1.13超滤法初级分离具有ACE抑制活性的米糠蛋白肽

酶解液浓度对超滤通量的影响十分显著，对于不同截留分子量的超滤膜，随着酶解液中肽浓度越大，溶液的粘度也逐渐变大，溶质之间的作用力也变大，溶质的方向扩散加强，膜表面浓度差极化迅速增加，因此传质阻力增加，导致溶液通量显著降低。进样浓度应该适宜，不影超滤膜通量，综合考虑试验进度及生产工艺合理性、经济性，故采用蛋白浓度为2.0mg/mL的米糠蛋白水解物为超滤试验基本进样浓度。超滤试验以常以20℃～25℃作为操作温度，原因是温度过高会减弱料液分子间的粘滞性，粘度降低，增大吸附在超滤膜表面的溶质由膜面向母液扩散的数量，增强其传质作用，导致膜表面凝胶层变薄，提高了米糠蛋白酶解液透过超滤膜的速率。但与此同时，超滤的操作温度若过高，则会导致米糠蛋白发生变性，生产变形蛋白的凝胶层。超滤利用静压差的推动力而起到初步分离目标物的目的，提高实验压力对起始膜透过速率起促进作用，但当操作压力大于某超滤临界压时，则会加剧浓差极化现象的发生，超滤膜表面逐渐形成凝胶层并增厚，透过速率不再增大。较高压力下，膜被压紧，导致有效传质推动力下降，控制试验超滤操作压力在0.1MPa～0.4MPa范围内。

目前为止，大多超滤试验采用截留分子量1KDa～10KDa之间的超滤膜对具有ACE抑制活性的水解物进行初级分离，不仅可以起到去除杂质、浓缩试样的作用，而且超滤后活性多肽对ACE抑制活性得到不同程度的提高。但与此同时随着截留分子量的减小，蛋白质损失 率也随之增大，对后续ACE抑制肽的结构鉴定有突出性贡献。水解产物中含有很多的大分子肽片段，通过超滤处理去除大分子量的肽片段提高ACE抑制肽的含量就有可能提高水解物的抑制活性。超滤膜在较低进口压力0.1～0.4Mpa范围下，尽量使料液不产生湍流，有较好分离效果，同时保证在超滤进行过程中通量始终较大，能满足工业化生产的需要。本实验采用截留分子量分别为10KDa、6KDa的中空纤维超滤膜，分两步进行降血压活性物质的分离研究。经两步超滤的蛋白肽样品颜色明显变浅，呈现出淡茶色，得到分子量分别＞10KDa、6KDa～10KDa、＜6KDa三种蛋白水解物组分，蛋白含量、ACE抑制活性等指标的结果见表7。

表7 超滤对具有ACE抑制活性的水解物的影响

组分名称	蛋白含量(mg/mL)	ACE抑制率(％)
			分子量＞10KDa	3.05	10.53
分子量6KDa～10KDa	1.69	23.96
			分子量＜6KDa	1.31	73.80

以超滤实验结果来看，通过超滤处理脱除大分子肽片段，提高水解物ACE抑制活性是可行的。截留分子量6KDa的中空纤维超滤膜比截留分子量10KDa的超滤膜更能有效地提高米糠蛋白水解物对ACE的抑制活性。超滤实验的蛋白回收率为84.62％，ACE抑制活性回收率为82.14％。分子量低于6KDa的超滤液部分对ACE抑制活性最高，其蛋白水解物IC₅₀值为0.8848mg/mL(图23)，冷冻干燥此组分。此组分的ACE抑制活性是原米糠蛋白酶解物的1.70倍，ACE抑制活性有显著性提升，与其他关于超滤初步分离食源性ACE抑制肽的研究结果相一致。

米糠蛋白水解物中，ACE抑制活性物质主要来源于分子量＜6KDa的小肽，同时也表明小分子肽在对ACE抑制方面发挥着举足轻重的作用。试验考虑进一步分离纯化6KDa超滤膜的截留组分，还需要与葡聚糖凝胶柱层析、高效液相色谱等其它精密的分离设备共同使 用。ACE抑制肽的分子量分步范围很广，所有报道的ACE抑制肽均为2肽～15肽，分子量在200～1500Da之间，故试验采用葡聚糖凝胶层析色谱、高效液相色谱等精密仪器，对于超滤法初级分离试验得到的分子量低于6KDa的肽混合物组分进行逐级纯化，为后续ACE抑制肽的分离纯化及结构分析鉴定奠定基础根据。

1.14小结：

1)确定碱性蛋白酶为酶解米糠蛋白制备ACE抑制肽的最优蛋白酶。

2)通过单因素实验以及响应曲面优化方法获得制备米糠ACE抑制肽的最佳酶解条件：底物浓度3.9mg/mL、酶添加量3006u/g、pH＝9.1、酶解温度40℃、酶解4h，在该条件下得到的酶解方应物的ACE抑制活性IC₅₀值为1.50mg/mL，其水解度为15.32％。

3)截留分子量6KDa的中空纤维超滤膜比截留分子量10KDa的超滤膜更能有效地提高米糠蛋白水解物对ACE的抑制活性，分子量低于6KDa超滤组分对ACE抑制活性最高，其抑制活性IC₅₀值为0.8848mg/mL。超滤实验的米糠蛋白回收率为84.62％，ACE抑制活性回收率为82.14％。

2、米糠ACE抑制肽的分离纯化与结构表征分析

目前，科学家们已从不同食物蛋白质酶解产物中经过多种先进分离纯化技术的结合，获得并鉴定出部分具有ACE抑制活性的功能生物肽。具有生物活性和生理功能的目标天然产物的提取、纯化、测定及结构表征技术是相关研究的前沿。从混合物中纯化出生物活性较高的目标分子涉及一系列理论和技术，常用的分离纯化及结构表征鉴定的方法：超滤、离子交换、凝胶过滤、反相高效液相色谱、质谱和氨基酸序列分析等。对于米糠蛋白酶解后得到的具有ACE抑制活性的水解物而言，它是由蛋白质、肽和氨基酸组成的混合物，根据其组成物质、理化性质以及ACE抑制肽活性特点等因素，选择适当的纯化技术组合顺序对ACE抑制肽进行多步纯化精制、浓缩，得到最终产物进行一级结构的表征。

本部分首先应用葡聚糖凝胶Sephadex G-15柱层析技术对分子量＜6KDa的具有ACE抑制活性的蛋白水解物进行纯化精制，再采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)对其进一步纯化，并鉴定高活性组分的纯度；然后运用氨基酸自动分析仪测定米糠ACE抑制肽的氨基酸组成，最后利用基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱(MALDI-TOF-MS/MS)对米糠ACE抑制肽进行分子量测定及氨基酸碎片分析，得到串联质谱数据结合氨基酸组分分析结果，通过手工解析既得到米糠ACE抑制肽的氨基酸序列，其一级结构得到表征。实验主要流程见图24。

2.1实验方法

2.1.1Sephadex G-15柱层析分离纯化米糠ACE抑制肽

2.1.1.1Sephadex G-15层析柱实验的填装、洗脱及加样

根据相关ACE抑制肽文献报道，具有ACE抑制活性的食源性蛋白肽分子量一般都小于1.5KDa。综合考虑，在本发明中选用葡聚糖凝胶Sephadex G-15作为分离纯化具有ACE抑制活性的米糠蛋白水解物试验的葡聚糖凝胶型号。Sephadex G-15一般常用于分离纯化分子量小于1.5KDa的小肽，比较适合分离纯化米糠蛋白水解物中的ACE抑制肽成分。Sephadex G-15层析柱实验的填装、洗脱及加样过程：

(1)将购置的干葡聚糖凝胶Sephadex G-15颗粒按5～10倍量悬浮于洗脱液中充分溶胀。自然常温溶胀费时较长，加热可以加速凝胶颗粒溶胀，即在沸水浴中将湿Sephadex G-15凝胶浆逐渐升温至近沸，1至2小时即可达到充分胀溶Sephadex G-15凝胶，同时加热处理Sephadex G-15凝胶既能节省时间又可以达到杀菌消毒的目的，经充分溶胀后将极细的小颗粒倾泻出去。(2)填装层析柱：将Sephadex G-15凝胶层析柱与地面垂直地固定在铁架上，下端流出口用夹子夹紧，柱底填充一定量洗脱液，将已进行抽真空处理半小时的Sephadex G-15凝胶调成较稀薄的凝胶溶液盛于烧杯中，然后在轻微地搅拌下使凝胶下沉于柱内，直至层析实验所需高度为止，然后用直径1.6cm 滤纸片轻轻盖在凝胶床表面。(3)稍放置后，逐渐增加洗脱液流速开始流动平衡，但流速始终要低于层析试验流速。平衡Sephadex G-15凝胶柱过夜，洗脱试验要保证层析床均匀、无“纹路”或气泡，如发现异常则必须重新装柱。(4)洗脱液预先平衡、饱和凝胶柱，Sephadex G-15凝胶床顶部留下数毫升洗脱缓冲液，加入样品溶液体积必须小于或等于Sephadex G-15凝胶床总体积的5.0％～10.0％。(5)将洗脱液贮瓶、蠕动泵、层析柱、紫外检测器以及自动组分收集器按顺序相连，旋紧各连接口处旋塞，预先设定蠕动泵流速。(6)加入米糠蛋白酶解液后，打开层析柱下端的流出口，使其渗入Sephadex G-15凝胶层析柱内，当样品液面恰与层析柱上端表面相平时，再加入一定体积洗脱液冲液冲洗Sephadex G-15凝胶层析柱壁，使样品完全进入层析柱，如此操作也同时避免了空气进入层析柱中。(7)开始葡聚糖凝胶Sephadex G-15层析色谱实验，收集各洗脱组分，做米糠ACE抑制肽的定性、定量测定研究。

2.1.1.2Sephadex G-15柱层析分离纯化米糠ACE抑制肽

凝胶色谱层析是一种利用分离物质分子量大小不同而达到分离纯化效果的色谱方法，层析柱所用的填料Sephadex G-15是具有立体网状结构、筛孔直径较为一致、且呈珠状颗粒的物质。当含有不同分子量大小的米糠蛋白酶解物混合液通过Sephadex G-15凝胶层析柱时，洗脱液及小分子化合物可以在葡聚糖凝胶筛孔中自由地扩散、渗透，而大分子物质则被阻挡在凝胶孔外。因此，大分子量物质在Sephadex G-15填料颗粒间隙中流动，故比低分子量物质更早地洗脱下来。然而，凝胶过滤层析分离效果受到多种因素的影响，如柱体积、长度、洗脱液种类及其流速、样品浓度和上样量等因素。

试验以经超滤后的分子量小于6KDa的米糠蛋白肽为上样品，分别考察了洗脱液类型、径高比、洗脱液流速这三个因素对米糠ACE抑制肽分离纯化效果的影响，以葡聚糖凝胶色谱图的出峰时间、峰分离度及分辨度等来考察纯化ACE抑制肽的效果，从而确定出Sephadex G-15最佳洗脱ACE抑制肽的试验参数。冷冻干燥ACE抑 制活性最高组分，-12℃冰箱冷冻备用。柱层析试验各项洗脱条件：

(1)洗脱液：a、0.01M HCl；b、1.0M HAc；c、0.1M乙酸铵；d、pH＝4.0，0.2M HAc-NaAc缓冲液；

(2)径高比：a、16mm∶250mm；b、16mm∶300mm；c、16mm∶350mm；

(3)洗脱流速：a、0.2mL/min；b、0.5mL/min；c、0.8mL/min；

(4)上样量：3.0mL；

(5)检测波长：280nm。

大多数蛋白质或肽分子中都含有酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等氨基酸残基，它们结构中均具有苯环，而苯环结构中的共扼体系对275～280nm波段处的紫外光区域具有强烈吸收。一定浓度范围的蛋白溶液，在280nm波长处的吸光度与蛋白含量成正比，所以可以对蛋白质或肽进行定性、定量测定。某些研究者利用了这点对ACE抑制肽进行了研究，故实验确定280nm作为判断Sephadex G-15柱层析分离纯化米糠蛋白水解物的检测波长。此方法具有简单、灵敏、快速，消耗样品少、不受盐类干扰等优点。

2.1.2RP-HPLC分离纯化米糠ACE抑制肽

RP-HPLC系统分离氨基酸、肽时常采用一定pH缓冲液与有机溶剂进行梯度淋洗，与其它方法比较其主要特点是样品回收率很高，一般大于80％，这也是分离小肽物质的首选方法。RP-HPLC在肽的分离纯化中多采用C₁₈(ODS)柱，按出峰时间进行样品收集浓缩，然后再用RP-HPLC进行反复收集分离，可制备得到活性纯组分。取Sephadex G-15分离纯化所得的较高ACE抑制活性组分E冻干粉溶于蒸馏水(含0.1％TFA)，配成浓度为5.0mg/mL的样品，经0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液上制备型RP-HPLC系统进行分离纯化，然后得到的ACE抑制活性高组分再次进行分析型RP-HPLC系统进一步纯化。试验连续两次运用RP-HPLC纯化米糠ACE肽的实验条件如下：

(1)制备型RP-HPLC纯化ACE抑制肽

HPLC系统：AKTA purifier chromatography systems；

色谱柱：Shim-Pack PREP-ODS(4.6×250mm，12μm)，反相色 谱柱；

流动相：A、5.0％乙睛(含0.1％TFA，v/v)；B、80.0％乙睛(含0.1％TFA，v/v)；

洗脱条件：0～20min，0～80.0％B；20～24min，80.0％～0B；25～60min，100.0％A；梯度洗脱60min；

流速：0.5mL/min；

柱温：30℃；

上样量：200.0μL；

检测波长：280nm。

每组样品的分离需要重复10次以上，分管收集单个组分峰，冷冻干燥并测定相应组分的ACE抑制活性。

(2)分析型RP-HPLC纯化分析ACE抑制肽

将ACE抑制活性最高组分E-9溶于蒸馏水(含0.1％TFA)后，继续用分析型RP-HPLC再次分离纯化，分管收集单个组分峰，冷冻干燥，测定各个组分峰的ACE抑制活性。分析型RP-HPLC纯化分析条件如下：

HPLC系统：AKTA purifier chromatography systems；

色谱柱：Shim-Pack PREP-ODS(4.6×250mm，5μm)，色谱分析柱；

流动相：A、5.0％乙睛(含0.1％TFA，v/v)；B、80.0％乙睛(含0.1％TFA，v/v)；

洗脱条件：用流动相A和B梯度洗脱60min(0～60min，0～80.0％B)；

流速：1.0mL/min；

柱温：30℃；

上样量：100.0μL；

检测波长：280nm。

2.1.3测定ACE抑制肽E-9的氨基酸组成 

精确量取一定量的米糠ACE抑制肽E-9样品于水解管中，加入 定量6.0mol/L的HCl，抽真空，110℃下水解24h，经充分冷却，将水解液定容至50mL。过滤，取1mL滤液于小烧杯中，真空干燥后加入1mL的0.02mol/L HCl，在室温下放置30min。采用L-8800型全自动氨基酸分析仪，分析鉴定ACE抑制肽的氨基酸组成。检测条件为：

分析柱类型：钠型阳离子交换柱(4.6mm×60.0mm)；

柱的衍生反应液：A-茚三酮/L丙二醇甲醚，B-醋酸钠/醋酸∶丙二醇甲醚(V∶V＝60∶40)；

流动相：柠檬酸三钠缓冲液(pH＝3.2～4.9)；缓冲液流速：0.4mL/min；

洗脱条件：四元梯度洗脱；茚三酮流速0.35mL/min；

缓冲液泵1压力：8.0～11.5Pa，茚三酮泵2压力：0.9～1.2kPa；氮气压力：20kPa；

柱温：50℃；分析时间：35min；

上样量：样品组和对照组进样量均为40.0μL。

2.1.4MALDI-TOF-MS质谱测定米糠ACE抑制肽E-9

经两步RP-HPLC分离纯化后得到的米糠ACE抑制肽的单一活性峰组分E-9用于质谱分析，以鉴定其分子质量和推定出其相应的氨基酸序列。基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS/MS)作为一种新型的软电离质谱技术，已成为测定生物大分子物质，尤其是蛋白质、多肽分子量和一级结构的有效工具。分子量精确度可达到0.01％，对样品的杂质耐受力强，不受样品所含添加物缓冲液或盐的影响。基质辅助激光解析电离质谱仪可用于测定肽段的氨基酸序列，其过程是从一级质谱产生的肽段中选择母离子，进入二级质谱，经惰性气体碰撞后肽段沿肽链有规律地断裂，由所得到的各肽段质量数差值来推定肽的氨基酸序列，表征未知肽的一级结构。同时，基质辅助激光解析电离质谱仪也是鉴定蛋白质、多肽纯度的有效手段之一。

样品的预处理及点样：组分E-9用含0.1％TFA的蒸馏水溶解，取1.0μL样品溶液与基质溶液1.0μL混合均匀，用微量加样枪取 1.0μL混合液，点样于192孔不锈钢MALDI靶体盘上，待组分E-9样品溶液干燥后进行一级、二级质谱分析，鉴定及表征米糠ACE抑制肽组分E-9的一级结构；

质谱仪：Atuoflexlll Smartbeam，MALDI-TOF-MS Proteomics Analyer；

激光器：UV Nd-YAG，频率220Hz，波长355nm；检测方式：反射式阳离子；

加速电压：30kV；检测器电压：1kV；

基质溶液：含有5.0mg/mLα-氰基-4-羟基肉桂酸(α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid)及0.1％TFA的50.0％乙腈溶液；

内标校正：肌红蛋白的胰蛋白酶水解物。

2.1.5ACE抑制率的体外测定方法

如前文实验方法1.7.3中所述步骤进行操作，体外测定ACE抑制活性。 

2.1.6分离纯化步骤中的蛋白含量测定

用考马斯亮蓝法测定经葡聚糖凝胶Sephadex G-15、RP-HPLC分离纯化后的各个组分的蛋白质含量。

2.2结果与讨论 

2.2.1Sephadex G-15柱层析分离纯化米糠ACE抑制肽

2.2.1.1洗脱液类型对Sephadex G-15柱层析分离纯化ACE抑制肽的影响

ACE抑制肽的组成中具有较强的疏水性，与Sephadex G-15凝胶之间可能存在比较强的疏水相互作用，为避免异常峰形、提高峰的分辨率，葡聚糖凝胶柱层析的洗脱剂盐溶液需要降低离子强度。但对于分子量较大的物质，其溶液粘度随浓度增加而增大，会限制分子运动，虽然样品浓度与分配系数无关，但也要保证米糠蛋白酶解物与洗脱液的相对粘度不超过1.5～2.0。米糠蛋白水解液为上样品，经过滤除杂质后，准确量取3.0mL样品溶液进行上样，设定洗脱流速0.5mL/min，分别选取0.01M HCl、1.0M HAc、0.1M乙酸铵、pH＝4.0，0.2M  HAc-NaAc缓冲液这四种低离子强度的洗脱液，在280nm检测波长下对Sephadex G-15层析柱进行洗脱试验。

从图25-28可以看到，0.01M HCl洗脱效果明显优于另三种洗脱液。经0.01M HCl洗脱米糠蛋白水解物可以得到4个主要的独立组分，并且4个组分峰具有较高的分辨率、峰形也较对称。另一方面，在其他分离纯化实验参数一致的情况下，以1.0M HAc、0.1M乙酸铵及pH＝4.0，0.2M HAc-NaAc缓冲液为洗脱剂时，Sephadex G-15柱层析的洗脱出样品的洗脱时间分别在50.00min、48.50min及45.67min；而以0.01M HCl为洗脱剂时，Sephadex G-15柱层析的出峰时间为40.00min。综合考虑，故选用0.01M HCl作为后续分离纯化米糠蛋白水解物Sephadex G-15柱层析试验中的洗脱液。

2.2.1.2径高比对Sephadex G-15柱层析分离纯化ACE抑制肽的影响

经过滤除杂质后，准确量取3.0mL样品溶液进行上样，以0.01M HCl为洗脱液，设定洗脱流速为0.5mL/min，分别选取径高比为16mm∶250mm、16mm∶300mm、16mm∶350mm，在280nm检测波长下进行Sephadex G-15层析柱洗脱实验，分离纯化结果如图29-31所示。

当含有不同分子量大小的米糠蛋白肽混合物溶液进入Sephadex G-15凝胶柱后，大分子物则被阻挡在Sephadex G-15的立体网状结构筛孔之外，流动在Sephadex G-15颗粒间隙之间，故先被洗脱下来；小分子组分可以在Sephadex G-15立体网状结构筛孔中自由扩散、渗透，后被洗脱下来。由于相对分子质量大的组分和相对分子质量小的组分是根据在Sephadex G-15凝胶柱中的流动速度快慢而实现分离的，当层析柱短时，两部分无法实现完全分离。虽然径高比分别为16mm∶250mm、16mm∶300mm时，洗脱峰均具有较好分辨率；但是径高比16mm∶250mm的主要洗脱峰为4个，而径高比16mm300mm的主要洗脱峰为5个，分离米糠蛋白水解物的效果更佳。然而，当径高比为16mm∶350mm时，由于层析柱过长，不同分子量的肽段可能会被部分地同时洗脱下来，从而出现重叠现象，组分反而不能得到充分 的分离效果，导致米糠蛋白肽的分离洗脱峰分离度和分辨率较差、峰型不佳，达不到葡聚糖凝胶柱层析分离的目的，不利于后续的实验收集；并且此时的出峰时间以及分离时间都过长，使有效的试验时间延长。综合考虑，故选用16mm∶300mm作为后续分离纯化米糠蛋白水解物Sephadex G-15柱层析试验的径高比。

2.2.1.3洗脱流速对Sephadex G-15柱层析分离纯化ACE抑制肽的影响

经过滤除杂质后，准确量取3.0mL样品溶液进行上样，以0.01M HCl为洗脱液，径高比为16mm∶300mm，洗脱流速分别设定为0.2mL/min、0.5mL/min、0.8mL/min，在280nm检测波长下进行Sephadex G-15层析柱洗脱实验，分离纯化结果如图32-34所示。

流速为0.2mL/min时，因为流速过低，溶质的扩散作用对洗脱分离蛋白水解物的影响过大，使得Sephadex G-15柱层析的谱带扩张而使得出峰时间延长，而凝胶对米糠蛋白水解物分离的选择性较低，导致后三个峰的分离度较低、分辨率降低，不利于后续收集。Sephadex G-15具有立体网状结构、筛孔直径较一致、且呈珠状颗粒状，利用米糠蛋白肽具有不同大小的分子量而起到分离的实验目的。而当洗脱流速过高为0.8mL/min时，分子量接近的米糠蛋白水解物不易被分开，使得洗脱峰的分辨率降低峰形过宽柱内弥散情况严重，使得洗脱峰叠加从而影响分离结果。当洗脱速度为0.5mL/min时，色谱峰的峰型、分离度和分辨性均较好。综合考虑，故选用0.5mL/min作为分离纯化米糠蛋白水解物Sephadex G-15柱层析试验中的洗脱液流速。

2.2.1.4Sephadex G-15柱层析分离纯化米糠蛋白水解物

根据实验结果2.2.1.1、2.2.1.2、2.2.1.3中所述，确定了Spehadex G-15分离纯化分子量＜6000Da的米糠蛋白水解液的最佳洗脱实验工艺流程如下所述：

试验以米糠蛋白水解液为上样品，经过滤除杂质后，准确量取3.0mL样品溶液进行上样，洗脱液为0.01M HCl，层析柱径高比为16mm∶300mm，洗脱流速设定为0.5mL/min，在280nm检测波长下对 水解物进行Sephadex G-15层析柱洗脱实验，Sephadex G-15柱层析分离纯化米糠蛋白水解物的凝胶层析图谱如图34所示。反复多次经Sephadex G-15柱层析分离纯化后，将米糠蛋白酶解液分成明显的五个多肽成分，分别命名它们为组分A、B、C、D、E，收集相应的这五个峰组分，各活性组分的蛋白含量及ACE抑制率如表8所示。

表8 经Sephadex G-15分离纯化得到A～E组分的分析结果

组分名称	蛋白含量(μg/mL)	ACE抑制率(％)
			A	102.5	54.67
B	84.7	52.76
			C	60.3	38.51
D	51.2	34.34
			E	86.0	78.69

葡聚糖凝胶Sephadex G-15层析利用待分离的米糠蛋白酶解物样品的分子量大小不同而达到分离纯化目的，填料凝胶呈珠状颗粒状，具有立体网状结构、筛孔直径较一致。当含有不同分子量大小的米糠蛋白水解液通过Sephadex G-15凝胶柱时，大分子物被阻挡在凝胶筛孔之外，在葡聚糖凝胶Sephadex G-15填料颗粒间隙中自由流动，组分A最先被洗脱出来，说明组分A的分子量相对较大；而小分子物质可以在Sephadex G-15凝胶筛孔中自由扩散、渗透，比大分子物质A后被洗脱下来。实验比较了经葡聚糖凝胶Sephadex G-15柱层析分离纯化而得的A～E五个组分的ACE抑制活性，从图35可以看到：组分A、B、C、D、E对ACE的抑制活性呈现逐步上升趋势，IC₅₀值分别为0.0983mg/mL、0.0803mg/mL、0.0783mg/mL、0.0746mg/mL、0.0546mg/mL；它们的蛋白含量分别为102.5μg/mL、84.7μg/mL、60.3μg/mL、51.2μg/mL、86.0μg/mL。组分E最后被洗脱出来，其ACE抑制活性最高，此实验结果也提示说明了该洗脱组分E中可能含有具有较高ACE抑制活性的短肽，冷冻干燥此组分。经过葡聚糖凝胶Sephadex G-15柱层析分离纯化后，米糠蛋白水解物的蛋白回收率达到84.15％，ACE抑制活性回收率为90.02％。

2.2.2RP-HPLC分离纯化ACE抑制肽的试验结果

2.2.2.1制备型RP-HPLC纯化ACE抑制肽

取Sephadex G-15分离纯化所得组分E的冻干粉溶于蒸馏水(含0.1％TFA)，配制成浓度为5.0mg/mL的样品溶液，再经0.45μm微孔滤膜过滤后，留取滤液。利用制备型RP-HPLC分离纯化组分肽E的试验分析结果如下所述：

Sephadex G-15分离纯化所得的组分E经第一步RP-HPLC制备后被分离成为22个组分如色谱图36，由于RP-HPLC色谱图中的组分峰11′～22′保留时间短、出峰时间较接近，所占峰面积小的原因可能是因为制备时上样量较大，导致各个层面上成分通过层析柱时的流动速度不均匀导致的，也有可能是成分含量确实较少。故合并色谱图中的组分峰11′～22′相应出峰物质为制备型RP-HPLC的第11号组分，并命名RP-HPLC色谱图中的组分分别为组分E-1、E-2、E-3、E-4、E-5、E-6、E-7、E-8、E-9、E-10、E-11。

表9 经RP-HPLC分离纯化组分E得到的组分E-1～E-11的分析结果

组分名称	蛋白含量(μg/mL)	ACE抑制率(％)
			E-1	47.2	23.56
E-2	——	——
			E-3	31.7	27.23
E-4	——	——
			E-5	41.5	36.92
E-6	70.4	57.11
			E-7	68.8	66.17
E-8	61.3	49.33
			E-9	21.0	89.03
E-10	32.1	54.44
			E-11	72.7	32.17

经RP-HPLC纯化后得到的11个峰组分的蛋白含量及ACE抑制率分析结果如表9所示，ACE抑制活性IC₅₀值的结果见图37所示。研究结果可以看到，其中组分E-2及E-4未检测出ACE抑制活性，这可能是因为这两个组分峰中的主要成分是含有不具有ACE抑制活 性的未清除掉的杂质物质或有机溶剂等。然而，组分E经制备型RP-HPLC分离纯化后，蛋白回收率达到97.06％，ACE抑制活性回收率为95.32％。与其他活性组分相比，组分E-9具有ACE抑制活性最高，IC₅₀值为0.0118mg/mL，实验结果提示组分E-9中可能含有高ACE抑制活性的蛋白肽组成成分。收集该活性组分E-9，于-12℃冰箱冷冻保藏，备用。

2.2.2.2分析型RP-HPLC纯化ACE抑制肽

经过上一步制备型RP-HPLC分离纯化组分E后，在11个分离纯化组分中，第9个出峰组分的ACE抑制活性最高，命名为组分E-9。为进一步探索具有高血管紧张素转酶抑制活性组分的结构与功能的关系，用分析型反相高效液相色谱对E-9进行了反复的分析制备。组分E-9再次经Shim-Pack PREP-ODS(4.6×250mm，5μm)反向色谱柱再次梯度洗脱，分离纯化结果见图谱38，看出组分E-9仍然为单一组分峰，所以可以认定经过多次连续分离纯化色谱得到的米糠ACE抑制肽组分E-9为纯肽组分。

2.2.3分析米糠ACE抑制肽的分离纯化过程

根据米糠蛋白肽的各种物理性质及功能特性，并结合其他研究者的研究结果，实验先后运用包括超滤、葡聚糖凝胶层析、反向高效液相色谱在内的一组连续分离纯化色谱技术对米糠蛋白酶解产物进行分离纯化，可得到纯度较高的米糠ACE抑制肽的纯组分E-9，纯化过程的结果分析如表10所示。

表10 分离纯化米糠ACE抑制肽的纯化表

实验首先利用超滤法初步地分离出分子量＜6KDa的米糠蛋白酶解物，其ACE抑制活性IC₅₀值为0.8848mg/mL；然后，采用空间排阻色谱即葡聚糖凝胶Sephadex G-15纯化分子量＜6KDa的超滤液，得到ACE抑制活性是米糠超滤酶解液组分16.21倍的Sephadex G-15葡聚糖凝胶柱层析组分E，其ACE抑制活性IC₅₀值为0.0546mg/mL；最后，试验运用两次连续的RP-HPLC分离纯化组分E，得到肽纯组分E-9，其ACE抑制活性最高，其IC₅₀值为0.0118mg/mL。得到的新型米糠ACE抑制肽的ACE抑制活性是其超滤酶解液的74.98倍。与其他关于食源性如大豆、金枪鱼、部分海鲜类等研究报告结果相比，本发明得到的新型米糠ACE抑制肽的ACE抑制活性及纯化倍数均处于较高水平。

2.2.4ACE抑制肽E-9的氨基酸组成 

纯组分米糠ACE抑制肽E-9经完全水解预处理后，采用L-8800型氨基酸自动分析仪进行氨基酸组成的分析与鉴定，得到ACE抑制肽E-9的氨基酸图谱(图39)，分析结果见表11。由氨基酸组成结果可见，米糠ACE抑制肽E-9是由苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸这三种氨基酸组成的，它们的氨基酸分子量分别为119.1Da、131.2Da、131.2Da，并且相对应的出峰时间分别为6.81min、17.13min、18.07min。

表11 米糠ACE抑制肽E-9的氨基酸组成

2.2.SACE抑制肽E-9的分子量及氨基酸序列测定结果

基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)已成为了测定生物大分子物质，尤其是蛋白质、多肽分子量和一级结构的有效工具，也是鉴定蛋白质、多肽纯度的有力工具。MALDI-TOF质谱仪可直接用于测定肽段的氨基酸序列，即从一级质 谱产生的肽段中选择母离子，进入二级质谱(MS/MS)，利用待测分子在电离及飞行过程中产生的亚稳离子，通过分析相邻同组类型峰的质量差，识别相应氨基酸残基，测定蛋白肽的序列。根据得到的串联质谱数据，第一种方法是通过仪器提供的软件从头解析肽序列；第二种方法是可以人工推测解析，即结合氨基酸破碎片段的质谱分析结果，对应相应的离子质量，正确得到未知肽的氨基酸序列，本试验就采用了第二种方法解析米糠ACE抑制肽E-9的氨基酸序列。

通过肽键作用，将多种氨基酸残基连接在一起，形成肽分子和蛋白质分子。对于单电荷离子，沿肽骨架有规律地断裂后，会产生一个带电荷离子和一个中性丢失物，MALDI-TOF质谱仪检测的就是这个带电荷离子。在肽键外断裂，主要可得到N端系列碎片离子(b系列离子)和C端系列碎片离子(y系列离子)，这些碎片离子还可以进一步形成脱水、脱氨离子。除丙氨酸(Ala，A)、脯氨酸(Phe，F)、色氨酸(Trp，W)、酪氨酸(Tyr，Y)外，氨基酸残基还可能发生侧链β碳和γ碳之间的断裂。由于这几组碎裂峰的峰强相对较高，是确定氨基酸序列的主要依据，所以首先需要区分出各组峰的归属类型，通过比较相邻同种离子的质量差，判断相应氨基酸残基。肽段在MALDI-TOF质谱中有一定碎裂规律，主要断裂方式以及碎片类型如图40所示。据相关文献提及到的Roepstorff及Fohlman的命名系统，N端碎片离子用a、b、c等表示，C端离子则用x、y、z等英文字母表示。

b系列离子的质量特征：m/z＝n个氨基酸组成的分子量之和-n×18+1

b系列离子的结构特征：

y系列离子的质量特征：m/z＝n个氨基酸组成的分子量之和 -(n-1)×18+1

y系列离子的结构特征：

利用MALDI-TOF-MS质谱仪对经过两次RP-HPLC分离纯化后的单一峰组分E-9分析测定，得到一级质谱分析图(图41)。一级质谱图可以明确显示出E-9组分为一个单一分子离子峰(M+H⁺)，分子量为345.238Da，这也同时说明了经RP-HPLC分离纯化后所得到的试样为单一纯化肽。

由试验2.2.4中的氨基酸分析结果已知氨基酸组成，结合一级MS谱图显示的分子离子峰(m/z 345.238)，综合推断E-9应该是由Thr(T)、Ile(I)、Leu(L)这三种氨基酸组成的三肽类物质。根据肽段在MALDI-TOF质谱中按照一定断裂规律后产生的碎片b、y系列离子的质量及结构特征，推测此种三肽的氨基酸组成序列有6种可能性组合，如表12所示。

表12 推测肽E-9的氨基酸序列及其b离子、y离子质量理论值

一级质谱中的母离子(m/z 345.238)经肽键外断裂，产生氨基酸碎片，得到米糠ACE抑制肽E-9的氨基酸碎片二级质谱图(图42)。即肽链断裂后可以产生氨基酸质量碎片及某个或某几个氨基酸残基+CO+NH、残基+CO、残基+NH、残基-NH、残基-CO或残基-CO-NH的质量碎片，将这些质量碎片与氨基酸进行比对就可以得知原来的肽 中的氨基酸序列。

根据氨基酸碎片二级质谱图，对照表12中三肽E-9的b离子、y离子质量理论值，可以对应找到其相对应的b离子、y离子质量分别有：b1＝114.012，b2＝215.132，y2＝232.964，即可以确定米糠ACE抑制肽E-9此三肽物质的氨基酸序列为ITL或LTI。参考有关食源性ACE抑制肽的文献资料，现在所发现的ACE抑制肽的肽链长度一般都是二肽至十五肽，本实验经碱性蛋白酶酶解米糠蛋白所分离纯化得到的米糠ACE抑制肽的肽链长度为三肽，亦在此范围内。

表13 米糠ACE抑制肽E-9的相关数据

ACE底物或者抑制剂的C末端对其结合血管紧张素转换酶发挥着重要作用：(1)C末端为Ile、Ala、Leu、Met等疏水性脂肪族氨基酸有利于以竞争性抑制方式结合ACE；(2)目标样品的N末端为支链氨基酸或C末端为Tyr、Trp、Phe等氨基酸的芳香族氨基酸、C末端为Pro的二肽或三肽也更易以竞争性抑制方式与ACE结合；(3)ACE与C末端含有如芳香族氨基酸、支链氨基酸在内的疏水性氨基酸的底物或抑制剂显示出更明显的亲和力。本试验得到的三肽E-9的C末端就为疏水性脂肪族氨基酸。本实验研究首次运用超滤、葡聚糖凝胶色谱、反相高效液相色谱、质谱等方法从米糠蛋白酶解物中获得了具有高ACE抑制活性的三肽E-9，经部分国内外食源型ACE抑制肽一级结构文献检索结果表明，尚未见与此有同源的相关研究报道。

2.3小结

1)Sephadex G-15纯化米糠ACE抑制肽的最佳洗脱参数：上样量3.0mL；洗脱液0.01M HCl；径高比16mm∶300mm；洗脱流速0.5mL/min；检测波长280nm。此时，经纯化后共得到五个明显的肽组分A、B、C、D、E，其中组分E具有最高ACE抑制活性，IC₅₀值为0.0546mg/mL。 经Sephadex G-15柱层析分离纯化后，米糠蛋白水解物的蛋白回收率达到84.15％，ACE抑制活性回收率为90.02％。

2)制备型RP-HPLC纯化肽组分E，共纯化出11个明显的组分峰，分别命名为组分E-1、E-2、E-3、E-4、E-5、E-6、E-7、E-8、E-9、E-10、E-11。其中具有最高ACE抑制活性的是组分E-9，IC₅₀值为0.0118mg/mL。经制备型RP-HPLC分离纯化后，蛋白回收率达到97.06％，ACE抑制活性回收率为95.32％。并且再次经分析型RP-HPLC鉴定ACE抑制肽E-9纯度为纯肽组分。

3)米糠ACE抑制肽E-9是由苏氨酸(Thr，T)、异亮氨酸(Ile，I)、亮氨酸(Leu，L)这三种氨基酸组成的三肽物质，分子量为345.238Da，其氨基酸序列为Ile-Thr-Leu(ITL)或Leu-Thr-Ile(LTI)。

3、米糠ACE抑制肽的活性及稳定性研究

植物蛋白质具有如热稳定性、冷藏稳定性等性质，经蛋白酶水解后，生成肽和游离氨基酸的混合物，分子量降低，离子性基团数目增加，疏水性基团暴露出来，可能使产物某些物理化学性质、稳定性等发生变化。米糠ACE抑制肽在体外对血管紧张素转换酶(ACE)具有较强的抑制作用，在实际生产应用中，如果在不同温度、不同酸碱pH等条件下否能保持稳定而持续地对ACE抑制活性。另一方面，具有ACE抑制活性的米糠水解物经口服或静脉注射，能否具有降血压作用，能否达体内目标靶点抑制其ACE活性。所以在进行动物实验之前，有必要考察模拟体内的ACE抑制肽抗肠道酶降解能力，为米糠ACE抑制肽今后的相关产品在一些较特殊人群的食品开发中的应用提供理论和参考依据。

本部分试验以ACE抑制活性最高的米糠ACE抑制肽E-9为实验样品，经人工胃液和人工胰液先后处理，模拟人体内的消化系统环境进行抗消化试验；分别针对米糠ACE抑制肽对于血管紧张素转换酶的耐受能力、热稳定性、耐酸碱性等相关性质进行了研究；以体外测定法，将米糠ACE抑制肽与目前市场上常见的降压药物进行了抑制ACE活性的比较。实验流程如图43。

3.1实验方法

3.1.1米糠ACE抑制肽的模拟体内消化试验

人体摄入ACE抑制肽后，需经过胃肠消化道才能被吸收利用，许多研究已证明：在胃肠道中，二肽或三肽更容易以完整形式被吸收进入到血液中，某些四肽以上的寡肽也能直接被人体利用吸收；然而一些更大分子量的ACE抑制肽既不能降解也不被吸收，亦有可能在体内被降解成小肽之后才可以发挥降压功能。这就造成了一些食源性酶解物在体外测定具有ACE抑制活性，而经口服或静脉注射后无降血压作用。ACE抑制肽经口服摄入后能否以完整的活性形式被人体吸收，从而抑制血管紧张素转换酶从而发挥降血压作用，其中对人体肠道消化酶消化降解作用的耐受性起着举足轻重的地位。经研究发现，常常发生体外ACE抑制活性测定结果与动物实验不相符的情况，导致此现象发生的原因有许多种，其中最有可能的原因是产生的酶解物本身是血管紧张素转换酶的底物，或者经胃肠道消化酶降解为不具有ACE抑制活性的酶解物产物^[80]。为考察米糠ACE抑制肽的纯化肽E-9在体内对肠道消化酶的耐受情况，试验通过模拟体内消化道环境对ACE抑制活性进行了比较。米糠ACE抑制肽E-9的体外模拟消化试验综合了其他研究者的方法并加以改进：

用pH＝2.0的0.1M KCI-HCl缓冲溶液将胃蛋白酶配制成为0.05mg/mL的新鲜酶液，称取25.0mg冷冻干燥的米糠ACE抑制肽纯化物E-9溶于5mL胃酶溶液中，37℃保温4h后。沸水浴灭酶处理5min，12000r/g离心5min，取上清液。然后用0.25M的NaOH溶液调节上清液pH至8.0，调整酶解物浓度为4.0mg/mL，取出2mL溶液准备后续消化实验；剩余溶液用pH＝8.3硼酸缓冲液稀释至2.0mg/mL，进行ACE抑制活性的测定，以肽液作为对照。

配制0.1mM的pH＝8.0磷酸盐缓冲溶液，称取5.0mg胰酶，用上述缓冲液配制成为0.05mg/mL的胰酶溶液。分别在上一步所取出的2mL溶液中加入2mL新鲜胰酶溶液，37℃水浴保温4h，沸水处理5min终止酶解反应。12000r/g离心5min，取上清液，稀释成2.0mg/mL溶液，测 定ACE抑制活性，以未经任何处理的米糠ACE抑制肽E-9作为对照。

3.1.2米糠ACE抑制肽与降压药ACE抑制活性的比较

目前市场上高血压患者常用的抗高血压的首选化学合成类药物类型有：血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)、利尿剂、血管紧张素II受体阻滞剂(ARB)、钙离子拮抗剂(CCB)、β-受体阻滞剂、α-受体阻滞剂、复合降压药等。

本实验选取化学合成降压药物以及复方利血平氨苯蝶啶等合成类降压药物与米糠ACE抑制肽E-9纯化物比较，均配制成剂量浓度为3.0mg/mL的样品溶液，分别测定它们对于抑制血管紧张素转换酶活性的作用效果。

3.1.3米糠ACE抑制肽的稳定性研究

3.1.3.1米糠ACE抑制肽对ACE的稳定性

以含有0.3mol/L NaCl的0.1mol/L硼酸缓冲液(pH＝8.3)作为溶剂，将纯品肽E-9冻干粉配制成为2.0mg/mL的溶液，与20μL 4mU的ACE在37℃水浴中保温3h，每30min进行一次取样实验。待测样品沸水浴中灭酶处理10min，终止酶解反应后，测定处理前后样品E-9的ACE抑制活性，得到相对活性，判断米糠ACE抑制肽对血管紧张素转换酶的稳定性。

3.1.3.2米糠ACE抑制肽的热稳定性

将米糠ACE抑制肽E-9用含0.3mol/L NaCl的0.1mol/L硼酸盐缓冲液(pH＝8.3)配制成为2.0mg/mL的肽溶液，分别在温度0℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃条件下保温3h，每30min进行一次取样实验，快速冷却至室温。测定样品溶液pH＝8.3时的ACE抑制活性，以未加热处理的纯化物E-9作为对照组，得到相对ACE抑制活性，以评定米糠ACE抑制肽在不同温度变化中的稳定性趋势。

3.1.3.3米糠ACE抑制肽的酸碱稳定性

将米糠ACE抑制肽E-9配制成2.0mg/mL的溶液，分别调节pH至2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0，40℃条件下保温3h，每30min进行一次取样实验，快速取出后冷却至室温。再将样品溶液pH调节至8.3， 浓度稀释为1.0mg/mL，再对各溶液进行ACE抑制活性的测定。与未经处理的纯化物E-9作为对照组的进行比较，得到相对ACE抑制活性，以判定米糠ACE抑制肽在不同pH环境中的稳定性变化。

3.1.4ACE抑制率的体外测定方法

按照前文中实验方法1.7.3所叙述的内容进行ACE抑制活性的体外测定。

3.2结果与讨论 

3.2.1米糠ACE抑制肽的模拟体内消化试验结果

米糠ACE抑制肽分别经胃蛋白酶、胰蛋白酶等肠道酶作用，考察产物对ACE的抑制活性效果(如图44)。米糠ACE抑制肽经胃蛋白酶水解后，一方面米糠ACE抑制肽中的某些组分可能是原来对ACE具有抑制功能的活性组分，经胃蛋白酶作用后生成了更高活性的新组分；另一方面，也可能是一些原来对ACE没有抑制活性效果的组分，与胃蛋白酶作用后生成了新型活性组分，提高了血管紧张素转换酶抑制活性，水解液的ACE抑制活性IC₅₀值由0.0118mg/mL略微变小为0.0104mg/mL，即ACE抑制活性增加了11.93％。实验结果表明，米糠ACE抑制肽不仅可以完全抵抗胃蛋白酶降解作用，而且经过胃蛋白酶作用后的产物对于血管紧张素转换酶的抑制活性作用有所增强。

但米糠ACE抑制肽中较多活性组分却不能完全抵抗胰蛋白酶的降解作用，一方面，肽E-9经胰蛋白酶单独酶解后得到的产物IC₅₀值增加至0.0170mg/mL，ACE抑制活性减小至组分E-9原活性的44.07％；另一方面，先经胃蛋白酶酶解后水解物再次经胰蛋白酶水解得到的酶解产物，IC₅₀值大幅度增加到0.0349mg/mL，ACE抑制活性减小至组分E-9原活性的29.80％。这说明米糠ACE抑制肽E-9中主要的蛋白活性肽成分可能在很大程度上抵抗胃肠道消化酶的水解作用，即经胃蛋白酶、胰蛋白酶等消化酶作用后，米糠ACE抑制肽依然具有较强的抑制血管紧张素转换酶的活性，故可以认为经口服后，米糠ACE抑制肽E-9具有较显著的体外抗胃肠道消化酶的性质，但 仍需进一步的动物体内实验验证。

3.2.2米糠ACE抑制肽与降压药ACE抑制活性的比较结果

试验选择米糠ACE抑制肽E-9与七种不同类型的高血压患者常用的化学合成抗高血压药物，在体外比较对于ACE活性的抑制作用，结果见表14。在相同剂量时，对于在体外检出的样品中，复方利血平氨苯蝶啶片(复合降压药)药物成分中有多种物质，有少部分成分属于血管紧张素转化酶抑制剂，适当的体外环境对血管紧张素转化酶有一定程度的抑制作用，但抑制活性较低，IC₅₀值为0.0658mg/mL。马来酸依那普利片的主要药物成分就是血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)，与其他类型的降压样品比较，其体外对于ACE的抑制作用最强，IC₅₀值0.0034mg/mL。食源性ACE抑制肽E-9次之为0.0118mg/mL，这可能是因为米糠ACE抑制肽E-9与药物血管紧张素转换酶抑制剂对于血管紧张素转化酶的作用位点不同；另一方面，药物类ACEI的组成成分中可能还含有其他的非血管紧张素转换酶抑制剂类药物成分，而这些药物成分在体外ACE的抑制活性仍然很高。

表14 米糠ACE抑制肽与降压药的体外测定比较结果

然后将实验得到的米糠ACE抑制肽纯化物与部分食源型ACE抑制肽进行了对比，比较了它们对于血管紧张素转换酶的抑制活性以及一级结构信息，对比结果如表15所示。从表中，可以看到与其他多种食源型ACE抑制肽相比，米糠ACE抑制肽E-9具有较强的ACE抑制活性；同时也可以发现许多食源型ACE抑制肽的C末端或N末端均具有亮氨酸(Leu，L)或脯氨酸(Phe，F)的氨基酸残基。

表15 米糠ACE抑制肽其他食源型ACE抑制肽的对比结果

3.2.3米糠ACE抑制肽的稳定性研究结果

3.2.3.1米糠ACE抑制肽对ACE的稳定性

ACE是一种含锌的二肽羧酶，它能从有ACE抑制活性的多肽C末端开始以二肽为单位依次水解肽键，其具有相对较宽的底物特异性，故在体外测定评价多肽的ACE抑制活性时，许多活性肽是以底物的形式被ACE水解而表现出类似的ACE抑制活性。将米糠ACE抑制肽与血管紧张素转换酶在37℃恒温条件下处理3h，每0.5h进行一次取样实验，比较试验前后其ACE抑制活性的变化趋势(图45)。由米糠ACE抑制肽对ACE的稳定性图可知，在3h内经ACE处理后对米糠ACE抑制肽活性的影响较低，活性肽的ACE抑制活性均保持了原有活性的90.0％以上；但是从实验结果中仍可以看出来，在3h内随着ACE处理米糠ACE抑制肽时间的延长，酶解产物的血管紧张素转换酶抑制活性呈现逐步下降趋势，但是降低幅度并不明显。

食源性ACE抑制肽可以分为以下三类：(1)抑制剂类型，经血管紧张素转换酶作用后，其ACE抑制活性始终保持不变；(2)前体 药抑制剂类型，同样能被ACE水解，但酶解产物的肽片段具有比水解前更强的ACE抑制活性；(3)底物类型，这类肽能够被ACE水解生成其它的低活性或者无活性的肽片段，使其在生物体内不具有降血压活性。一般来说，抑制剂类型或者前体药抑制类型的ACE抑制肽在口服或者注射后能能显示出较强的降血压效果。然而，本实验中米糠降压纯化肽E-9与血管紧张素转换酶恒温共同作用后，如图45所示的结果显示：经过3h后，酶解产物的相对ACE抑制率最低为91.26％，一直保持在90.0％以上，其ACE抑制活性仅有微弱的下降变化，原因之一可能是ACE抑制活性测定误差所引起的。上述结果表明：从在体外测定ACE抑制率的结果来看，经血管紧张素转换酶作用后的各个样品仍然是抑制剂类型，说明米糠ACE抑制肽对于血管紧张素转换酶具有良好的耐受性。

3.2.3.2米糠ACE抑制肽的热稳定性

尽管生物活性肽的开发已经成为当前食品领域的研究热点之一，但以活性肽为主导地位的工业化产品却不常见。在由实验研究成果向生产工业化产品转化的过程中，生物活性肽所具有的生物活性或生物活性成分，在特定的加工环境或者生理条件下也能维持相对的稳定性，具备一定的加工性能。试验酶解米糠蛋白制备ACE抑制肽的目的之一就是将具有活性的蛋白酶解物应用于食品工业、生物保健行业中，作为功能性添加剂或功能因子改善食品品质，提高食品的营养价值、市场价值。故试验在温度20～100℃、pH2.0～10.0等常规性食品加工条件下，考察米糠ACE抑制肽的ACE抑制活性是否具有良好的稳定性，能否满足工业化的加工条件。因此，有必要评价其所具有的ACE抑制活性在食品加工过程中的稳定性。纯化肽在不同温度下加热3h，每0.5h检样一次，抑制活性比较结果如图46所示。

ACE抑制肽在0℃冷藏保温一定时间，其ACE抑制活性与在常温放置的对照组试样测定结果相比没有显著变化，有较好的冷藏稳定 性。然而从总体上来看，米糠降血压肽E-9对ACE的抑制效果随温度升高、加热时间的延长而呈现降低趋势。当加热温度达到50℃、60℃时，米糠ACE抑制肽对于血管紧张素转换酶的抑制效果在整个加热过程中呈逐渐下降趋势，但下降幅度不大，且加热2.5h相对ACE抑制活性仍保持在90.0％以上；在70℃以下的温度加热1h，ACE抑制活性仍能保留90.0％；纯化肽在70℃、80℃加热至1.5h后对ACE的抑制活性下降幅度增大；当加热温度为90℃时，水解液加热0.5h后对ACE的抑制效果明显下降，随着加热时间的延长，水解液对ACE的活性下降趋势变缓；水解液在90℃加热1h后，ACE抑制活性仍能保持60.0％左右。以上这些关于米糠ACE抑制肽的热稳定性试验结果说明：米糠ACE抑制肽纯化物在高温(80℃以下)较长时间加热过程中有良好的耐热稳定性。

3.2.3.3米糠ACE抑制肽的酸碱稳定性

并非所有ACE抑制肽都具有很好的酸碱稳定性，所以试验对米糠ACE抑制肽E-9在不同pH环境中恒温保持3h，每0.5h取样试验一次，其ACE抑制活性的实验结果如图47所示。在pH2.0～12.0范围中，不同pH的水解液对ACE抑制活性效果随着保温时间的延长而呈现下降趋势。其中，在加热时间低于0.5h时，短时间的加热肽液的活性变化并不大，ACE抑制率保留了90.0％左右。当加热时间超过半小时后，pH＝10.0及pH＝12.0的降压肽水解物短时间内活性损失增大，水解液对ACE的抑制活性效果下降最为明显，对ACE抑制活性最大下降至50.0％左右。可能与酶解物的制备条件、活性肽序列及相对分子质量等因素有关。而在pH＝6.0以及pH＝8.0的溶液环境下保温，对米糠ACE抑制肽的ACE抑制活性影响较小，ACE抑制活性损失率仅不到10.0％，米糠ACE抑制肽具有良好的耐酸碱稳定性，相比较而言，ACE抑制肽耐酸性好于耐碱性。

经过不同温度及不同pH实验环境条件中作用，与处理之前的米糠纯化太相比较，其ACE抑制活性没有明显变化，ACE抑制活性仍可以保留50.0％以上，这与其他研究者如Hwang所报道的关于金枪鱼 ACE抑制肽稳定性的研究结果一致。

3.3小结

1)米糠ACE抑制肽的主要的活性肽成分能很大程度上抵抗胃肠道消化酶的水解作用，并且仅经胃蛋白酶作用后的产物对ACE的抑制活性增加了11.93％，IC₅₀值达到0.0104mg/mL；肽E-9经胰蛋白酶单独酶解后得到的产物IC₅₀值增加至0.0170mg/mL，ACE抑制活性减小至组分E-9原活性的44.07％；另一方面，先经胃蛋白酶酶解后水解物再次经胰蛋白酶水解得到的酶解产物，IC₅₀值大幅度增加到0.0349mg/mL，ACE抑制活性减小至组分E-9原活性的29.80％。可以认为经口服进入至体内后，米糠ACE抑制肽经消化后仍能具有较显著的生物学作用。

2)在体外检测，在相同剂量时，马来酸依那普利片(血管紧张素转换酶抑制剂，ACEI)体外对于ACE的抑制作用最强，IC₅₀值为0.0034mg/mL；米糠ACE抑制肽E-9次之，ACE抑制活性IC₅₀值为0.0118mg/mL；复方利血平氨苯蝶啶片(复合降压药)，ACE抑制活性IC₅₀值为0.0658mg/mL。

3)米糠ACE抑制肽E-9的稳定性：a、对血管紧张素转换酶具有良好的耐受性；b、具有良好的耐热稳定性；c、具有良好的耐酸碱稳定性，并且米糠ACE抑制肽耐酸性好于耐碱性。

Claims (7)

1.一种具有ACE抑制活性的米糠蛋白肽的制备方法，其特征在于所述方法步骤如下：

一、以米糠为原料，采用碱法提取米糠蛋白：

二、向米糠蛋白中加入蒸馏水，控制底物浓度为1.0～6.0mg/mL，充分搅拌溶解后，调节pH值为7.5～10；再添加一定比例的蛋白酶后放于恒温水浴中，使其发生酶解反应，控制酶添加量为500～5000u/g，酶解温度为30～55℃，水解时间为0.5～10h；反应结束后，迅速升温至94～96℃保持10～15min，对蛋白酶进行充分的灭活处理；离心分离酶解液，即得米糠蛋白水解液；

三、采用超滤法初级分离米糠蛋白水解液；

四、采用葡聚糖凝胶Sephadex G-15纯化步骤三获得的米糠ACE抑制肽；

五、采用RP-HPLC法分离纯化步骤四获得的米糠ACE抑制肽，得到纯化的米糠ACE抑制肽。

2.根据权利要求1所述的具有ACE抑制活性的米糠蛋白肽的制备方法，其特征在于所述蛋白酶为碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶或复合风味蛋白酶。

3.根据权利要求1所述的具有ACE抑制活性的米糠蛋白肽的制备方法，其特征在于所述蛋白酶为碱性蛋白酶。

4.根据权利要求1或3所述的具有ACE抑制活性的米糠蛋白肽的制备方法，其特征在于所述最佳酶解条件：底物浓度3.9mg/mL、酶添加量3006u/g、pH＝9.1、酶解温度40℃、酶解4h。

5.根据权利要求1所述的具有ACE抑制活性的米糠蛋白肽的制备方法，其特征在于所述超滤操作温度为20～25℃，超滤操作压力在0.1～0.4MPa范围内，截留分子量＜6KDa。

6.根据权利要求1所述的具有ACE抑制活性的米糠蛋白肽的制备方法，其特征在于所述Sephadex G-15纯化米糠ACE抑制肽的最佳洗脱参数：上样量3.0mL；洗脱液0.01M HCl；径高比16mm:300mm；洗脱流速0.5mL/min；检测波长280nm。

7.根据权利要求1所述的具有ACE抑制活性的米糠蛋白肽的制备方法，其特征在于所述纯化的米糠ACE抑制肽是由苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸组成的三肽物质，分子量为345.238Da，其氨基酸序列为Ile-Thr-Leu或Leu-Thr-Ile。