CN101210043A - 一种米糠免疫肽及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种米糠免疫肽及其米糠免疫肽的制备方法，以全脂米糠为原料，先用低碱法提取米糠蛋白，再以胰蛋白酶水解米糠蛋白，获得米糠肽。本发明采用低碱法提取米糠蛋白、以动物蛋白酶水解米糠蛋白制备米糠肽，得到的米糠肽产品不仅无苦味、风味好，并具有免疫调节活性。
Description
技术领域
本发明涉及一种米糠肽及其制备方法，尤其是涉及一种具有免疫调节活性的米糠肽及其制备方法。
背景技术
米糠是我国第一大粮食品种——稻谷加工的副产品，米糠肽是米糠蛋白经酶水解获得的短肽混合物，其氨基酸组成与大豆蛋白质基本相同，必须氨基酸平衡良好，含量丰富。且易为人体消化，安全无毒，是一种优良的肠道营养液。目前已发现米糠肽具有抗氧化、降血压、降胆固醇、降血糖、免疫、抗疲劳、抗癌等生理活性。然而目前大部分米糠仍用作动物饲料，资源浪费严重，同时免疫米糠肽的研究方面比较薄弱，国内外的研究报导也比较零散。因此，以米糠为原料制备米糠免疫肽，对于提高米糠附加值具有重要现实意义。
目前，短肽类物质的生产主要有三种方法：一、基因工程方法，二、化学合成方法，三、酶解法。采用基因工程方法和化学合成方法生产免疫活性肽需要较昂贵的仪器设备，投资大，成本高，且其安全性还需进一步检测，而用酶解法生产免疫活性肽则具有较多的优势。现有的酶解法通常采用木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等植物蛋白酶制备短肽类物质，尽管原料丰富，生产简单但是酶解效率较低、容易失活，且得到短肽产品具有明显的苦味。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有免疫调节活性的米糠免疫肽。
本发明的另一个目的在于提供具有免疫调节活性的米糠免疫肽的制备方法。
本发明的第一个目的可通过以下的技术措施来实现：一种具有免疫调节活性的米糠免疫肽，采用低碱法提取米糠蛋白、再以胰蛋白酶水解米糠蛋白后制得。
本发明的第一个目的可通过以下的技术措施来实现：一种具有免疫调节活性米糠免疫肽的制备方法，以全脂米糠为原料，先用低碱法提取米糠蛋白，再以胰蛋白酶水解米糠蛋白，获得米糠肽。
本发明所述低碱法提取米糠蛋白的具体过程：
A、以全脂米糠为原料，加入其8～12倍重量的水，以0.5～1.5mol/l的氢氧化钠溶液调节其pH值为9～11，置于35～45℃水浴提取110～135min，完成后置离心机中分离，收集上清液；
B、以0.1～0.2mol/l的盐酸溶液调节收集上清液的pH值为4～5，静置，蛋白质析出完全后，置离心机中离心分离上清液，倾去上清液，得到米糠蛋白沉淀，于真空冷冻干燥机中干燥，得到米糠蛋白粉，其米糠蛋白提取率可达到80％以上。
本发明所述以胰蛋白酶水解米糠蛋白的具体过程：
C、将上述米糠蛋白粉加水配制成3～7％(重量百分比)的混合物，以0.5～1.5mol/l的氢氧化钠溶液调节其pH值为7.5～9；
D、按照60～120USP-U/g的用量加入胰蛋白酶，置于45～60℃水浴中酶解1.5～3hr，完成后加热至100℃维持10～15min进行灭酶活，冷却至室温后置于离心机中分离取上清液，真空浓缩后置于真空冷冻干燥机中干燥，得到米糠免疫肽。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、在米糠蛋白的提取工艺方面，为了提高提取率，现有的工艺通常采用强碱性条件，其浸提液pH值≥12，但上述强碱性条件对米糠蛋白的溶解性、乳化性、起泡性等功能特性会产生不良影响，并降低其酶解制备米糠肽的效率。本发明控制提取条件pH≤11，温度≤45℃，使得米糠蛋白的功能性质基本不受影响，并可提高其酶解制备米糠肽的效率，由于具有免疫活性肽的分子量多在1900Da以下，对水解效率要求较高，因此，本发明采用低碱法提取米糠蛋白、以动物蛋白酶水解米糠蛋白制备米糠肽，得到的米糠肽产品不仅无苦味、风味好，并具有免疫调节活性。
2、在米糠肽的制备工艺方面，为了降低生产成本，现有的工艺通常采用价格较低的木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等植物蛋白酶，其水解效率不高，不容易得到具有免疫活性的米糠肽。本发明采用动物蛋白酶胰蛋白酶对上述米糠蛋白进行酶解，米糠蛋白原有的许多功能性质，如乳化功能、起泡功能、吸水功能、增稠功能、粘着功能、营养价值、生理功能等均有了不同程度的改善，能够更好的满足食品工业及相关行业的需要。
本发明制备得到的米糠肽的免疫活性评价见下表
附表1米糠肽对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响(
n＝8)
| 组别 | 光密度值OD | 差值 | |
| +ConA | -ConA | ||
| 对照组 | 0.61±0.23 | 0.49±0.12 | 0.12±0.15 |
| 高剂量组 | 0.61±0.12 | 0.26±0.11 | 0.35±0.14ab |
| 低剂量组 | 0.40±0.13 | 0.22±0.09 | 0.19±0.15 |
| 环磷酰胺组 | 0.50±0.13 | 0.44±0.11 | 0.06±0.21ab |
a表示在P＜0.05的显著水平下差异显著；b表示在P＜0.01的显著水平下差异显著
从附表1可见，经过20天的灌胃和腹腔注射后，本工艺制备的米糠肽对小鼠脾淋巴细胞增殖影响显著，在P＜0.01的显著水平下对照组与高剂量组和环磷酰胺组(药物诱导免疫力低下组)存在显著性差异。脾淋巴细胞增殖能力的大小高剂量组＞低剂量组＞对照组＞环磷酰胺组。脾脏是各类免疫细胞居住的场所，也是对抗原物质产生免疫应答及产生免疫效应物质的重要基地。通过测定ConA诱导的脾淋巴细胞增殖程度可以反映机体的细胞免疫功能。附表1的研究结果表明，本工艺制备的米糠肽对脾淋巴细胞增殖能力有明显的增强作用。
附表2米糠肽对小鼠溶血的影响(
n＝8)
| 组别 | 溶血值 |
| 对照组 | 0.16±0.02 |
| 高剂量组 | 0.93±0.11ab |
| 低剂量组 | 0.61±0.03ab |
| 环磷酰胺组 | 0.04±0.01ab |
a表示在P＜0.05的显著水平下差异显著；b表示在P＜0.01的显著水平下差异显著
由附表2可见，本工艺制备的米糠肽对小鼠的体液免疫能力有显著影响，在P＜0.01的水平下，对照组、高剂量组、低剂量组和环磷酰胺组间都存在显著性差异，并且高剂量组的体液免疫能力最强。并且各组的溶血值大小按照高剂量组＞低剂量组＞对照组＞环磷酰胺组的顺序排列，说明本工艺制备的米糠肽能够促进小鼠特异性体液免疫力。
正常小鼠B淋巴细胞受抗原(鸡红细胞)刺激后，分化为浆细胞，浆细胞产生一种抗抗鸡红细胞抗体(溶血素)，这种抗体在体外与鸡红细胞、补体一起温育，即可使鸡红细胞溶解，释出血红蛋白，使溶液呈红色。颜色的深浅，反映了红细胞溶出量的多少，而红细胞溶血与血清中抗体含量有关。血清溶血素的含量反映了被鸡红细胞免疫后的小鼠特异性体液免疫的功能。本工艺制备的不同剂量的米糠肽使血清中溶血素的含量显著提高，能够促进小鼠特异性体液免疫功能。
具体实施方式
以下实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以下实施例。所述技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容和各参数所取范围，均可实现本发明的目的。
实施例一
1米糠蛋白的提取
1.1以全脂米糠为原料，加入其9倍重量的水，以0.5mol/l的氢氧化钠溶液调节其pH值为10；
1.2将步骤1.1中得到的混合物置于45℃水浴提取130min；
1.3将步骤1.2中得到的混合物置于离心机中，在3000/min的转速下离心分离25min，收集上清液；
1.4以0.1mol/l盐酸溶液调节步骤1.3中得到的上清液pH值为4.5，静置10min，待蛋白质完全析出；
1.5将步骤1.4中得到的混合物置离心机中，在3500r/min的转速下离心分离15min，倾去上清液，得到米糠蛋白沉淀；
1.6将步骤1.5中得到的米糠蛋白沉淀置于真空冷冻干燥机中干燥，得到米糠蛋白粉。
2免疫米糠肽的制备
2.1将步骤1中得到的米糠蛋白粉加水配制成5％的混合物；
2.2将步骤2.1中得到的混合物以1mol/l的氢氧化钠溶液调节pH值为8；
2.3将步骤2.2中得到的混合物按照80(USP-U/g米糠蛋白)的用量加入胰蛋白酶；
2.4将步骤2.3中得到的混合物置于55℃水浴中酶解2.5hr；
2.5将步骤2.4中得到的混合物加热至100℃维持10min进行灭酶活；
2.6将步骤2.5中得到的混合物冷却至室温后置于离心机中，在4000r/min的转速下离心分离5min，取上清液；
2.7将步骤2.6中得到的上清液真空浓缩后置于真空冷冻干燥机中干燥，得到米糠免疫肽。
实施例二
1米糠蛋白的提取
1.1以全脂米糠为原料，加入其10倍重量的水，以1mol/l的氢氧化钠溶液调节其pH值为11；
1.2将步骤1.1中得到的混合物置于40℃水浴提取120min；
1.3将步骤1.2中得到的混合物置于离心机中，在4000/min的转速下离心分离20min，收集上清液；
1.4以0.2mol/l盐酸溶液调节步骤1.3中得到的上清液pH值为5，静置8min，待蛋白质完全析出；
1.5将步骤1.4中得到的混合物置离心机中，在3000r/min的转速下离心分离20min，倾去上清液，得到米糠蛋白沉淀；
1.6将步骤1.5中得到的米糠蛋白沉淀置于真空冷冻干燥机中干燥，得到米糠蛋白粉。
2免疫米糠肽的制备
2.1将步骤1中得到的米糠蛋白粉加水配制成3％的混合物；
2.2将步骤2.1中得到的混合物以0.5mol/l的氢氧化钠溶液调节pH值为8；
2.3将步骤2.2中得到的混合物按照100(USP-U/g米糠蛋白)的用量加入胰蛋白酶；
2.4将步骤2.3中得到的混合物置于50℃水浴中酶解3hr；
2.5将步骤2.4中得到的混合物加热至100℃维持15min进行灭酶活；
2.6将步骤2.5中得到的混合物冷却至室温后置于离心机中，在3500r/min的转速下离心分离10min，取上清液；
2.7将步骤2.6中得到的上清液真空浓缩后置于真空冷冻干燥机中干燥，得到米糠免疫肽。
Claims (4)
1.一种米糠免疫肽，其特征在于：采用低碱法提取米糠蛋白、再以胰蛋白酶水解米糠蛋白后制得。
2.一种米糠免疫肽的制备方法，其特征在于：以全脂米糠为原料，先用低碱法提取米糠蛋白，再以胰蛋白酶水解米糠蛋白，获得米糠肽。
3.根据权利要求2所述米糠免疫肽的制备方法，其特征在于：所述低碱法提取米糠蛋白的具体过程：
A、以全脂米糠为原料，加入其8～12倍重量的水，以0.5～1.5mol/l的氢氧化钠溶液调节其pH值为9～11，置于35～45℃水浴提取110～135min，完成后置离心机中分离，收集上清液；
B、以0.1～0.2mol/l的盐酸溶液调节收集上清液的pH值为4～5，静置，蛋白质析出完全后，置离心机中离心分离上清液，倾去上清液，得到米糠蛋白沉淀，于真空冷冻干燥机中干燥，得到米糠蛋白粉，其米糠蛋白提取率可达到80％以上。
4.根据权利要求2所述米糠免疫肽的制备方法，其特征在于：
所述以胰蛋白酶水解米糠蛋白的具体过程：
C、将上述米糠蛋白粉按重量百分比3～7％加入水中配制成混合物，以0.5～1.5mol/l的氢氧化钠溶液调节其pH值为7.5～9；
D、按照60～120USP-U/g的用量加入胰蛋白酶，置于45～60℃水浴中酶解1.5～3hr，完成后加热至100℃维持10～15min进行灭酶活，冷却至室温后置于离心机中分离取上清液，真空浓缩后置于真空冷冻干燥机中干燥，得到米糠免疫肽。
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