CN103194512B

CN103194512B - 促进乳酸菌增殖和提高存活性的大豆多肽及制备方法与应用

Info

Publication number: CN103194512B
Application number: CN201310082971.0A
Authority: CN
Inventors: 王才华; 周雪松; 曾建新; 蒋文真
Original assignee: GUANGZHOU HECHENG INDUSTRY Co Ltd
Current assignee: GUANGZHOU HECHENG INDUSTRY Co Ltd
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2013-03-15
Publication date: 2014-12-31
Anticipated expiration: 2033-03-15
Also published as: CN103194512A

Abstract

本发明公开一种促进乳酸菌增殖和提高存活性的大豆多肽及制备方法与应用，属于大豆蛋白的精深加工工艺领域。本发明通过高温挤压大豆蛋白，通过剪切和摩擦的双重作用，破坏维持蛋白质三级结构，使得大豆蛋白疏水基团展开，然后利用蛋白酶将变性的蛋白质切割成小分子肽，经过离心分离、过滤、干燥等工艺得到大豆多肽。其中，大豆多肽得率高达72%，生产成本低廉，能够有效地促进乳酸菌增殖，缩短发酵时间，提高储藏期乳酸菌存活性。而且，该大豆多肽可应用于发酵乳制品，也可以用于其他食品，是一种优质的健康食品配料。

Description

促进乳酸菌增殖和提高存活性的大豆多肽及制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种大豆蛋白的精深加工工艺，具体涉及一种促进乳酸菌增殖和提高存活性的大豆多肽及制备方法与应用。

背景技术

发酵乳是指以牛（羊）奶为原料，经杀菌后发酵而成的产品。发酵乳制品由于其风味独特、营养丰富和较好的保健功能，深受世界各地消费者的青睐。发酵乳较强的保健功能，主要是因为当中含有大量活性乳酸菌。研究表明，活性乳酸菌具有维持肠道菌群生态平衡、阻止致病菌对肠道的入侵和定殖、降低胆固醇、增强免疫功能、抗癌、降血压等功能作用。

通常认为，10⁸cfu/mL以上的乳酸菌才有较好的保健作用。发酵乳在储藏过程中，由于pH下降以及其中的乳酸、过氧化氢、氧溶解量等因素的变化，导致其活菌数量呈下降的趋势，在4℃储藏大约三周后，超过70%的活性菌死亡，发酵乳的功能性大打折扣。我国对发酵乳的乳酸菌活菌数要求不高，《乳酸菌饮料卫生标准》（GB16321-2003）规定，出厂产品乳酸菌含量必须高于10⁶cfu/mL；在销售时，有活菌检出即可。因此，如何提高发酵乳中的乳酸菌存活性成为乳品工作者的重要课题。

有学者提出添加还原性成分（维生素C、半胱氨酸）消除发酵过程中产生的过氧化氢、降低发酵乳中的溶氧量，从而实现对乳酸菌活菌的保护；一些发明专利提出添加锰元素（专利申请号200880003552.0，乳酸菌存活性提高剂）、死乳酸菌体（专利申请号：200780025021.7，乳酸菌的增殖促进剂和存活性提高剂）、κ-酪蛋白糖巨肽（专利申请号201080039225.8，乳杆菌属乳酸菌的增殖促进剂和/或存活性提高剂）等物质，促进乳酸菌的增殖以缩短发酵时间，并且提高发酵乳储藏期间的乳酸菌存活性。但这些方法或者安全度不高（如专利申请200880003552.0，乳酸菌存活性提高剂），或者分离纯化方法复杂（如专利申请200780025021.7，乳酸菌的增殖促进剂和存活性提高剂），或者成本较高等不足之处。

申请号为200610034387.8，名称为“一种促进乳酸菌增殖及发酵产酸的生物活性肽的制备方法”的国家发明专利申请提出用大豆蛋白或大豆粕为原料生产的生物活性肽，添加到酸奶中可以显著促进乳酸菌的增殖。利用该方法制备大豆多肽简单易行，但获得的大豆多肽得率低，同时该发明方法并未涉及到提高乳酸菌的存活性。此外，大豆多肽的功能特性与用途还直接与制取大豆多肽的加工工艺条件有关，尤其是加工过程中的蛋白质变性程度和制备获得的大豆多肽的粗细度等将直接影响其功能和用途。

发明内容

为克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种促进乳酸菌增殖和提高存活性的大豆多肽的制备方法。该制备方法以大豆蛋白为原料，采用高温高压的预处理方式，使得大豆蛋白疏水基团展开，然后利用蛋白酶将变性的蛋白质切割成小分子大豆多肽，是大豆蛋白的精深加工技术。

本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法得到的促进乳酸菌增殖和提高存活性的大豆多肽。

本发明的再一目的在于提供上述促进乳酸菌增殖和提高存活性的大豆多肽的应用。

本发明的目的可以通过下述技术方案实现：一种促进乳酸菌增殖和提高存活性的大豆多肽的制备方法，包括如下步骤：

（1）水分调节：调节大豆蛋白水分，使大豆蛋白水分含有量为10～20%（w/w）；

（2）高温挤压：将大豆蛋白于120～200℃进行挤压加工后，进行粉碎处理，过筛；

（3）酶解：将步骤（2）处理后的大豆蛋白用水配制成为大豆蛋白浓度为5～15%（w/w）的悬浮液，加热至45～60℃，将悬浮液pH值调节至7～9；再加入相当于大豆蛋白质量0.2～2%的蛋白酶酶解，酶解过程中保持酶解液pH值恒定；

（4）灭酶：将步骤（3）酶解后的酶解液加热完全钝化蛋白酶的活性；

（5）中和：将步骤（4）灭酶之后的酶解液调节pH值至7.0；

（6）离心分离：将步骤（5）中和后的酶解液离心分离，取上清液；

（7）超滤：将步骤（6）所取的上清液通过超滤膜过滤，获得滤液；

（8）浓缩和干燥：将步骤（7）过滤后的滤液进一步浓缩，干燥，得到具有促进乳酸菌增殖和活性保护功能的大豆多肽；

步骤（1）中所述的大豆蛋白为大豆分离蛋白或大豆浓缩蛋白中的一种或两种；优选为大豆分离蛋白，大豆浓缩蛋白在高温高压作用下，容易发生褐变，影响产品品质；所选的大豆蛋白为无发霉变质、无结块；

步骤（1）中所述的调节大豆蛋白水分方法，可优选下述方法中的一种，①将水分较低的大豆蛋白与水分较高大豆蛋白充分混合；②水分较低的大豆蛋白，可通过喷雾加湿；③水分较高的大豆蛋白，可通过烘干除湿；

步骤（1）中所述的大豆蛋白水分含有量优选为15%（w/w）；

步骤（2）中所述的挤压可选择用螺杆膨化挤压机进行单螺杆挤压或双螺杆挤压；优选双螺杆挤压；双螺杆挤压参数范围，机筒温度120～200℃，转速80～200r/min；

步骤（2）中所述的筛优选为目数为至少20目的筛；

步骤（3）中所述的pH值的调节剂优选为NaOH溶液、KOH溶液或HCl溶液，更优选为浓度为0.1mol/L的NaOH溶液和浓度为0.1mol/L的HCl溶液；

步骤（3）中所述的蛋白酶为碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶或中性蛋白酶中的一种或至少两种，优选为碱性蛋白酶；

步骤（3）中所述的酶解的酶解温度和pH值的选择为依据蛋白酶的最佳作用温度和pH值；其中碱性蛋白酶的酶解温度优选为45℃，pH值优选为9；木瓜蛋白酶的酶解温度优选为55℃，pH值优选为7；中性蛋白酶的酶解温度优选为50℃，pH值优选为7；

步骤（3）中所述的酶解的时间优选为3～12h；

步骤（4）中所述的加热的条件优选为90～100℃保持5～30min；

步骤（5）中所述的pH值的调节剂优选为0.1mol/L的NaOH溶液或0.1mol/L的HCl溶液；

步骤（6）中所述的离心的条件优选为5000～10000rpm离心5～20min；

步骤（7）中所述的超滤膜为截留分子量为1000～10000Da的超滤膜，优选截留分子量为5000Da的超滤膜；超滤膜过滤的目的是除去大分子蛋白和杂质；

步骤（8）中所述的浓缩优选为真空浓缩，浓缩温度60℃，浓缩压力0.1MPa；

步骤（8）中所述的干燥的方法可选择喷雾干燥或冷冻干燥；喷雾干燥进风温度165～190℃，出风温度75～95℃；冷冻干燥，冷冻后干燥时加热的温度为90℃，真空为100Pa；

一种促进乳酸菌增殖和提高存活性的大豆多肽，通过上述制备方法得到。

所述的促进乳酸菌增殖和提高存活性的大豆多肽在发酵乳制品领域应用，如应用于酸牛奶、酸羊奶、活性菌乳饮料等产品中，具有促进乳酸菌增殖，缩短发酵时间，改善发酵乳品质，保护乳酸菌活性等功能；

所述的促进乳酸菌增殖和提高存活性的大豆多肽也可以在其他食品领域应用，这是由于大豆多肽具有优异的分散性、溶解性、透明度高，并具有调节血压、抵抗自由基、提高免疫力、缓解疲劳、延缓衰老以及降低血脂等功能性，是一种十分理想的健康食品配料。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

（1）本发明以大豆蛋白为原料，采用高温挤压膨化法，通过剪切和摩擦的双重作用，破坏维持蛋白质三级结构的氢键、范德华力、离子键、双硫键，使得大豆蛋白疏水基团展开，然后利用蛋白酶将变性的蛋白质切割成小分子肽，经过离心分离、过滤、干燥等工艺得到大豆多肽。与专利申请200610034387.8（一种促进乳酸菌增殖及发酵产酸的生物活性肽的制备方法）相比较，专利申请200610034387.8中采用75～90℃加热10～20min的常规热变性工艺，通常采用75～90℃热变性的蛋白质，酶解后的大豆多肽得率在40～50%，即使增加蛋白酶用量、延长酶解时间，当酶解反应达到平衡后，得率几乎没有变化。本发明的采用了高温挤压的预处理方式，蛋白变性程度适中，有利于酶解反应，从而大豆多肽的得率更高（最高得率超过72%），成本更加低廉。

（2）本发明提供的大豆多肽能够有效地促进乳酸菌增殖，保护储藏期间乳酸菌活性。由于采用高温高压的预处理方式，使得大豆蛋白疏水基团展开，一些隐藏在疏水基团中的功能性肽段被释放出来。采用常规低变性蛋白质水解方法，很难得到这些功能性肽段。其中一些功能性肽段能够有效地促进乳酸菌增殖，提高储藏期间乳酸菌存活性。

（3）本发明提供的大豆多肽不影响发酵乳的风味，同时还具有安全性高、工艺简单、成本低廉等特点。通过本发明提供的方法制备得到的大豆多肽在提高乳酸菌存活性、提升发酵乳制品的功能性的同时，还可以缩短发酵时间，提高生产设备利用率，减少直投式乳酸菌菌种用量，从而降低发酵乳制品的生产成本。

附图说明

图1为对比实施例和实施例1制备得到的大豆多肽对酸乳储藏期间乳酸菌活菌数的影响结果图。

图2为实施例2和实施例3制备得到的大豆多肽对酸乳储藏期间乳酸菌活菌数的影响结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

（1）水分调节：精选无发霉变质、无结块的优质大豆分离蛋白，10%（w/w）水分含量的大豆分离蛋白与20%（w/w）水分含量的大豆蛋白以1：1配比，充分混匀，得到15%（w/w）水分含量的大豆蛋白。

（2）高温挤压：采用双螺杆膨化挤压机将大豆蛋白挤压处理机筒温度为200℃，转速为80r/min。挤压结束后将大豆蛋白，用高速搅拌器以1000r/min打碎，过20目筛。

（3）酶解：用水将经过挤压、过筛后的大豆蛋白配制成5%（w/w）的悬浮液，加热至45℃，用0.1mol/L的NaOH溶液将悬浮液的pH值调节至9；再加入相当于大豆蛋白质量0.2%的碱性蛋白酶Alcalase2.4L（丹麦诺维信公司产品，酶活力6.9×10⁴U/mL），于45℃，酶解时间3h，酶解过程中，用0.1mol/L的NaOH溶液保持酶解液的pH值恒定为9。

（4）灭酶：将步骤（3）最终得到的酶解液加热至100℃，保持5min，目的为将蛋白酶的活性完全钝化。

（5）中和：将灭酶之后的酶解液用0.1mol/L的HCl溶液调节pH值至7.0。

（6）离心分离：将步骤（5）中和后的酶解液以5000rpm的速度离心20min，取上清液。

（7）超滤：将上清液上通过截留分子量为10000Da的超滤膜，除去大分子蛋白和杂质，获得滤液。

（8）浓缩和干燥：最后将滤液进一步真空浓缩，浓缩温度60℃，浓缩压力0.1MPa；冷冻干燥，冻干加热的温度为90℃，冻干压力100Pa；得到一种具有促进乳酸菌增殖和活性保护功能的大豆多肽，命名为1#大豆多肽。每组实验做三个平行样，实验结果取平均值，1#大豆多肽的平均得率为69.5%。

大豆蛋白水分含量的测定方法参考中华人民共和国国家标准《粮食、油料检验水分测定法》（GB/T5497-1985）；

采用丹麦科汉森公司（CHR HANSEN）YF L-822乳酸菌菌种做发酵乳实验，每组实验做三个平行样，实验结果取平均值。实验条件：取1000g鲜牛奶（牛奶蛋白≥3.0%），加入80g白砂糖，添加0.5%（w/w）大豆多肽，于90℃保温10min，然后冷却43℃，接种0.02g菌种，于43℃发酵。以发酵乳pH值4.60作为发酵终点，牛奶由液态转变成为均匀的凝块酸乳。空白对照1为不添加大豆多肽，其他实验条件同前。0#大豆多肽为对比实施例制备得到的大豆多肽。大豆多肽对酸乳发酵过程中pH值的影响见表1。添加1#大豆多肽发酵乳发酵时间比空白对照样平均缩短1.03h。发酵结束后，于4℃冷藏，活菌变化如图1所示。结果表明，相比空白对照组，特别在储藏12d以后，大豆多肽能够有效提高储藏期乳酸菌存活性。

表1

实施例2

（1）水分调节：精选无发霉变质、无结块的优质大豆分离蛋白，7%（w/w）水分含量的大豆分离蛋白，采用喷雾加湿的方法，将水分含量提高到20%（w/w）。

（2）高温挤压：用双螺杆膨化挤压机将大豆蛋白挤压处理机筒温度为120℃，转速为145r/min。挤压结束后将大豆蛋白，用高速搅拌器以1000r/min打碎，过20目筛。

（3）酶解：用水将经过挤压、过筛后的大豆蛋白配制成15%（w/w）的悬浮液，加热至55℃，用0.1mol/L的NaOH溶液将悬浮液的pH值调节至7；再加入相当于大豆蛋白质量2%的木瓜蛋白酶（广州酶制剂厂，酶活力3.2×10⁴U/mL），酶解的条件为于55℃，酶解时间12h，酶解过程中，用0.1mol/L的NaOH溶液保持酶解液pH值恒定。

（4）灭酶：将步骤（3）制备得到的酶解液于90℃加热15min。

（5）中和：将灭酶之后的酶解液保持在pH值为7.0。

（6）离心分离：将步骤（5）处理后的酶解以8000rpm的速度离心15min，取上清液。

（7）超滤：将上清液通过截留分子量为5000Da的超滤膜，除去大分子蛋白和杂质。

（8）浓缩和干燥：最后将上清液进一步真空浓缩，浓缩温度60℃，浓缩压力0.1MPa，冷冻干燥，冻干干燥时的加热温度90℃，冻干压力100Pa，得到一种具有促进乳酸菌增殖和活性保护功能的大豆多肽，命名为2#大豆多肽。每组实验做三个平行样，实验结果取平均值，2#大豆多肽的平均得率为72.1%。

采用丹麦科汉森公司（CHR HANSEN）YC-381乳酸菌菌种做发酵乳实验，实验条件与数据处理方法与实施例1相同。空白对照2为不添加大豆多肽，其他实验条件与数据处理方法与实施例2相同。发酵乳发酵时间比空白对照2平均缩短0.96h。发酵结束后，于4℃冷藏，活菌变化如图2所示。结果表明，相比空白对照2样品，特别在储藏12d以后，2#大豆多肽能够有效提高储藏期乳酸菌存活性。

实施例3

（1）水分调节：精选无发霉变质、无结块的优质大豆分离蛋白，7%（w/w）水分含量的大豆分离蛋白，采用喷雾加湿的方法，将水分含量提高到10%（w/w）。

（2）高温挤压：采用双螺杆膨化挤压机将大豆蛋白挤压处理机筒温度为165℃，转速为200r/min。挤压结束后将大豆蛋白，用高速搅拌器以1000r/min打碎，过20目筛。

（3）酶解：将经过挤压预处理的大豆蛋白配制成10%（w/w）的悬浮液，加热至60℃，用0.1mol/L的NaOH溶液将悬浮液pH值调节至7；再加入相当于大豆蛋白质量1%的中性蛋白酶（丹麦诺维信公司产品，酶活力2.7×10⁴U/g），酶解的条件为于50℃，酶解时间6h，酶解过程中，用0.1mol/L的NaOH溶液保持酶解液pH值恒定。

（4）灭酶：将步骤（3）制备得到的酶解液加热，加热的条件为：100℃保持30min。

（5）中和：将灭酶之后的酶解液保持pH为7.0。

（6）离心分离：将步骤（5）处理后的酶解以10000rpm的速度离心5min，取上清液。

（7）超滤：将上清液上通过截留分子量为1000Da的超滤膜，除去大分子蛋白和杂质。

（8）浓缩和干燥：最后将步骤（7）处理的上清液进一步真空浓缩，浓缩温度60℃，浓缩压力0.1MPa，喷雾干燥，进风温度190℃，出风温度95℃，得到一种具有促进乳酸菌增殖和活性保护功能的大豆多肽，命名为3#大豆多肽。每组实验做三个平行样，实验结果取平均值，3#大豆多肽的平均得率为60.7%。

应用条件和数据处理方法与实施例2相同。大豆多肽对酸乳发酵过程中pH值的影响见表2。发酵时间比空白对照2平均平均缩短0.63h。发酵结束后，于4℃冷藏，活菌变化如图2所示。结果表明，相比空白对照2样品，特别在储藏12d以后，3#大豆多肽能够有效提高储藏期乳酸菌存活性，但其效果略逊于实施例2所制备的2#大豆多肽。

表2

对比实施例

对比实施例所制备的0#大豆多肽与实施例1所制备1#大豆多肽的工艺除步骤（2）不同以外，其他工艺相同。步骤（2）为将用水大豆蛋白配制成5%（w/w）的悬浮液，加热至90℃保温20min，然后温度降低至45℃。每组实验做三个平行样，实验结果取平均值，0#大豆多肽的平均得率为46.2%。

应用条件和数据处理方法与实施例1相同。大豆多肽对酸乳发酵过程中pH值的影响见表1。发酵时间比空白对照1平均缩短0.52h，其发酵时间比相同应用条件下1#大豆多肽平均长0.51h，这说明1#大豆多肽比0#大豆多肽促进发酵效果更好。发酵结束后，于4℃冷藏，活菌变化如图2所示。结果表明，相比空白对照1样品，特别在储藏12d以后，0#大豆多肽能够有效提高储藏期乳酸菌存活性，其效果逊于1#大豆多肽。

本发明实施例1步骤（2）中的高温挤压工艺，相比于对比实施例中步骤（2）加热至90℃保温20min，然后温度降低至45℃，极大的提升了大豆蛋白分子三级结构的破坏，大豆蛋白的一些功能性区域暴露出来，实施例1的大豆多肽得率为69.5%，相对于对比实施例中的得率46.2%，大豆多肽的得率得到很大提高，成本降低；另一方面，相比对比实施例，实施1的大豆多肽具更好的促进乳酸菌增值和提高存活性的效果。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种促进乳酸菌增殖和提高存活性的大豆多肽的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）水分调节：调节大豆蛋白水分，使大豆蛋白水分含有量为质量百分比10～20%；

（2）高温挤压：将大豆蛋白于120～200℃进行挤压加工后，粉碎处理，过筛；

（3）酶解：将步骤（2）处理后的大豆蛋白用水配制成为大豆蛋白浓度为质量百分比5～15%的悬浮液，加热至45～60℃，将悬浮液pH值调节至7～9；再加入相当于大豆蛋白质量0.2～2%的蛋白酶酶解，酶解过程中保持酶解液pH值恒定；

（5）中和：将步骤（4）灭酶之后的酶解液调节pH值至7.0；

（8）浓缩和干燥：将步骤（7）过滤后的滤液浓缩、干燥，得到具有促进乳酸菌增殖和活性保护功能的大豆多肽。

2.根据权利要求1所述的促进乳酸菌增殖和提高存活性的大豆多肽的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述的大豆蛋白为大豆分离蛋白或大豆浓缩蛋白中的一种或两种；

步骤（1）中所述的调节大豆蛋白水分的方法为下述方法中的一种：①将水分较低的大豆蛋白与水分较高大豆蛋白充分混合；②水分较低的大豆蛋白，可通过喷雾加湿；③水分较高的大豆蛋白，可通过烘干除湿；

步骤（1）中所述的大豆蛋白水分含有量为质量百分比15%。

3.根据权利要求1所述的促进乳酸菌增殖和提高存活性的大豆多肽的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述的挤压为使用螺杆膨化挤压机进行单螺杆挤压或双螺杆挤压。

4.根据权利要求3所述的促进乳酸菌增殖和提高存活性的大豆多肽的制备方法，其特征在于：所述的双螺杆挤压的条件为：机筒温度120～200℃，转速80～200r/min。

5.根据权利要求1所述的促进乳酸菌增殖和提高存活性的大豆多肽的制备方法，其特征在于：

步骤（2）中所述的筛为目数为至少20目的筛；

步骤（3）中所述的pH值的调节剂为NaOH溶液、KOH溶液或HCl溶液；

步骤（3）中所述的蛋白酶为碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶或中性蛋白酶中的一种或至少两种；

步骤（3）中所述的酶解的时间为3～12h。

6.根据权利要求1所述的促进乳酸菌增殖和提高存活性的大豆多肽的制备方法，其特征在于：

步骤（4）中所述的加热的条件为90～100℃保持5～30min；

步骤（5）中所述的pH值的调节剂为0.1mol/L的NaOH溶液或0.1mol/L的HCl溶液；

步骤（6）中所述的离心的条件为5000～10000rpm离心5～20min；

步骤（7）中所述的超滤膜为截留分子量为1000～10000Da的超滤膜；

步骤（8）中所述的浓缩为真空浓缩；

步骤（8）中所述的干燥为喷雾干燥或冷冻干燥。

7.根据权利要求6所述的促进乳酸菌增殖和提高存活性的大豆多肽的制备方法，其特征在于：

所述的真空浓缩的条件如下：浓缩温度60℃，浓缩压力0.1MPa；

所述的喷雾干燥的条件如下：进风温度165～190℃，出风温度75～95℃；

所述的冷冻干燥的条件如下：冷冻后干燥时的加热温度为90℃，真空为100Pa。

8.一种促进乳酸菌增殖和提高存活性的大豆多肽，通过权利要求1～7任一项所述的制备方法得到。

9.权利要求8所述的促进乳酸菌增殖和提高存活性的大豆多肽在食品中的应用。

10.根据权利要求9所述的促进乳酸菌增殖和提高存活性的大豆多肽在食品中的应用，其特征在于：所述的食品为发酵乳制品。