CN106755244A - 一种风味蛋白酶酶解制备ace抑制肽的方法 - Google Patents

一种风味蛋白酶酶解制备ace抑制肽的方法 Download PDF

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Abstract

一种风味蛋白酶酶解制备ACE抑制肽的方法，将魔芋蛋白溶液的pH值调节为5‑7后，在温度为40‑60℃下加入风味蛋白酶，酶解3‑6h，得到酶解液；再将酶解液灭酶、冷却、调节pH值至魔芋蛋白等电点，经过离心后收集上清液；上清液经冷冻干燥后纯化得到ACE抑制肽。本发明采用风味蛋白酶酶解制备ACE抑制肽，缩减了成本，工艺简单，可进行产业化生产。该魔芋ACE抑制肽来源于天然植物蛋白，分子量小，稳定、安全、人体易吸收。

Description

一种风味蛋白酶酶解制备ACE抑制肽的方法
技术领域
本发明属于食品深加工领域，特别涉及魔芋飞粉的深加工方法，具体涉及一种风味蛋白酶酶解制备ACE抑制肽的方法。
背景技术
我国是世界上最大的魔芋生产国，精粉年产量超过5000吨。在魔芋精粉加工过程中会产生重量轻、颗粒小的粉末，称为魔芋飞粉，占精粉的30％-40％，即全国年产飞粉1500-2000吨。目前对魔芋的利用主要集中在魔芋精粉(葡甘聚糖)，而魔芋飞粉大多以低价作为饲料或干燥剂出售，利用价值低。因此，开发和利用魔芋飞粉生产高附加值产品成为当务之急。魔芋蛋白质经酶解可得到具有抗衰老、抗癌、降血压、免疫等功能的生物活性多肽，是生产功能性保健食品的良好原料。
ACE抑制肽是一类能够抑制ACE活性的肽段，一般由2-10个氨基酸残基组成。ACE抑制肽通过竞争性与ACE发生结合，阻断了具有升血压活性的血管紧张素Ⅱ的生成，同时促进了具有降血压活性的舒缓肽和脑啡肽的生成，从而起到降血压的作用。食品蛋白源的ACE抑制肽因具有安全性高、毒副作用小、可长期食用、易于吸收等优点，从而越来越受到学者们的广泛重视。
目前，已经有人从沙丁鱼、牦牛乳液蛋白、雪菊、玉米、绿豆、燕麦等食品中得到ACE抑制肽，具有良好的开发与应用前景。魔芋飞粉中蛋白质含量较高，如果对其进行充分利用，通过酶解法加工魔芋蛋白获取ACE抑制肽，人们将会得到较大的社会效益和经技效益。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种风味蛋白酶酶解制备ACE抑制肽的方法，本方法的原料易得，工艺简单，可以提高魔芋蛋白利用率及拓宽ACE抑制肽的来源，提高其使用率和经济效益。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种风味蛋白酶酶解制备ACE抑制肽的方法，将魔芋蛋白溶液的pH值调节为5-7后，在温度为40-60℃下加入风味蛋白酶，酶解3-6h，得到酶解液；再将酶解液灭酶、冷却、调节pH值至魔芋蛋白等电点，经过离心后收集上清液；上清液经冷冻干燥后纯化得到ACE抑制肽。
本发明进一步的改进在于，魔芋蛋白溶液通过以下方法制得：将魔芋蛋白加入到纯净水中，配成质量浓度为2-10％的魔芋蛋白溶液。
本发明进一步的改进在于，每1g魔芋蛋白溶液中加入风味蛋白酶的量为1000-5000U。
本发明进一步的改进在于，灭酶的温度为80-100℃，时间为10-20min。
本发明进一步的改进在于，离心的转速为6000-10000rpm，时间为10-30min。
本发明进一步的改进在于，冷冻干燥的温度为-50～-110℃，冷冻干燥的时间为10-24h。
本发明进一步的改进在于，纯化过程为：将冷冻干燥后得到的产品利用大孔吸附树脂D101、阴离子交换树脂D201层析进行分离。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果：
本发明以魔芋蛋白质为原料，用风味蛋白酶进行酶解，其酶解条件为：底物浓度2-10％，加酶量1000-5000U/g，酶解温度为40-60℃，pH值5-7，反应时间为3-6h，经灭酶、离心、得到魔芋ACE抑制肽酶解液，将酶解液经分离纯化、浓缩、冷冻干燥，纯化，即得ACE抑制肽，经紫外分光光度法检测，魔芋ACE抑制肽的抑制活性是10％-60％。本发明采用风味蛋白酶酶解制备ACE抑制肽，缩减了成本，工艺简单，可进行产业化生产。该魔芋ACE抑制肽来源于天然植物蛋白，分子量小，稳定、安全、人体易吸收。
具体实施方式
下面结合实例对本发明做进一步详细说明。
一种风味蛋白酶酶解制备ACE抑制肽的方法，包括以下步骤：
将魔芋蛋白加入到纯净水中，配成质量浓度为2-10％的魔芋蛋白溶液；调节其pH值为5-7，在温度为40-60℃下加入风味蛋白酶，酶解3-6h，得到酶解液；再将酶解液灭酶、冷却、调pH至魔芋蛋白等电点，经过离心后收集上清液；测上清液的ACE抑制率，上清液经冷冻干燥后即得粗品。粗品依次利用大孔吸附树脂、离子交换层析进行分离，得到纯度较高的ACE抑制肽，检测魔芋ACE抑制肽活性。
其中，每1g魔芋蛋白溶液中加入风味蛋白酶的量为1000-5000U。
灭酶的温度80-100℃，时间为10-20min；
离心的转速为8000-10000rpm，时间为10-30min。
冷冻干燥的温度为为-50～-110℃，冷冻干燥的时间为10-24h。
测定ACE的抑制率：
利用Cushman检测法进行检测:取75uL、HHL(马尿酰-组氨酰-亮氨酸)与25uL、ACE抑制剂(多肽液)充分混匀。在37℃水浴锅中温育5min，加入25uL、25mu/mL ACE硼酸盐溶液，在37℃水浴锅中反应40min。结束后加入200uL、1.0moL/L盐酸溶液破坏反应环境，终止反应进程。然后于各试管中加入乙酸乙酯1.7mL，使其混匀；吸取1.2mL乙酸乙酯层于另一试管中，放入100℃烘箱中，挥发溶剂40min。拿出冷却后加入去离子水3mL，混匀后在波长228nm下测定其吸光度。
表1 ACE抑制率检测方法
计算公式为：
ACE抑制率
式中：A1—ACE抑制肽和ACE都存在溶液的吸光度值
A2—不加ACE抑制肽存在溶液的吸光度值
A3—ACE与HHL存在空白溶液的吸光度值
魔芋ACE抑制肽活性检测
紫外分光光度法检测魔芋ACE抑制肽活性。
配制反应液与空白液，两者其他条件均相同，给反应液中加入魔芋ACE抑制肽。以吸光度为纵坐标，以浓度为横坐标绘制马尿酸标准品曲线方程，得出空白液及反应液中马尿酸含量，计算魔芋ACE抑制肽的抑制活性。
实施例1
(1)将4g魔芋蛋白，加入50mL的纯净水，配成浓度为8％魔芋蛋白溶液；
(2)调节魔芋蛋白溶液的pH值至5，置于恒温磁力搅拌器上使温度恒定在40℃，加入风味蛋白酶，酶解3h，得到酶解液，酶解期间保持其pH值不变；其中，每1g魔芋蛋白溶液中加入风味蛋白酶的量为1000U。
(3)将酶解液置于85℃水浴锅中灭酶20min，冷却至室温、调pH值至魔芋蛋白等电点后离心，转速为10000rpm，时间10min，收集上清液；
(4)收集得到上清液测其ACE抑制率>30％，-50℃、冷冻干燥24h即得ACE抑制肽粗品。
(5)将ACE抑制肽粗品依次利用大孔吸附树脂D101、阴离子交换树脂D201层析进行分离，得到纯度较高的ACE抑制肽。
(6)检测结果显示：魔芋ACE抑制肽的抑制活性为18.9％。
实施例2
(1)将1g魔芋蛋白，加入50mL的纯净水，配成浓度为2％魔芋蛋白溶液；
(2)调节魔芋蛋白溶液的pH值至6，置于恒温磁力搅拌器上使温度恒定在50℃，加入风味蛋白酶，酶解3h，得到酶解液，酶解期间保持其pH值不变；其中，每1g魔芋蛋白溶液中加入风味蛋白酶的量为5000U。
(3)将酶解液置于90℃水浴锅中灭酶15min，冷却至室温、调pH值至魔芋蛋白等电点后离心，其转速为8000rpm，时间20min，收集上清液；
(4)收集得到上清液测其ACE抑制率>60％，-80℃、冷冻干燥18h即得ACE抑制肽粗品。
(5)将ACE抑制肽粗品依次利用大孔吸附树脂D101、阴离子交换树脂D201层析进行分离，得到纯度较高的ACE抑制肽。
(6)检测结果显示：魔芋ACE抑制肽的抑制活性为38.7％。
实施例3
(1)将2g魔芋蛋白，加入50mL的纯净水，配成浓度为4％魔芋蛋白溶液；
(2)调节魔芋蛋白溶液的pH值至5.5，置于恒温磁力搅拌器上使温度恒定在45℃，加入风味蛋白酶，酶解4h，得到酶解液，酶解期间保持其pH值不变；其中，每1g魔芋蛋白溶液中加入风味蛋白酶的量为2000U。
(3)将酶解液置于97℃以上的水浴锅中灭酶10min，冷却至室温、调pH值至魔芋蛋白等电点后离心，其转速为9000rpm，时间15min，收集上清液；
(4)收集得到上清液测其ACE抑制率>40％，-90℃、冷冻干燥12h即得ACE抑制肽粗品。
(5)将ACE抑制肽粗品依次利用大孔吸附树脂D101、阴离子交换树脂D201层析进行分离，得到纯度较高的ACE抑制肽。
(6)检测结果显示：魔芋ACE抑制肽的抑制活性为25.3％。
实施例4
(1)将3g魔芋蛋白，加入50mL的纯净水，配制成浓度为6％魔芋蛋白溶液；
(2)调节魔芋蛋白溶液的pH值至6.5，置于恒温磁力搅拌器上使温度恒定在55℃，加入风味蛋白酶，酶解5h，得到酶解液，酶解期间保持其pH值不变；其中，每1g魔芋蛋白溶液中加入风味蛋白酶的量为3000U。
(3)将酶解液置于95℃以上的水浴锅中灭酶10min，冷却至室温、调pH值至魔芋蛋白等电点后离心，其转速为9500rpm，时间10min，收集上清液；
(4)收集得到上清液测其ACE抑制率>50％，-110℃、冷冻干燥10h即得ACE抑制肽粗品。
(5)将ACE抑制肽粗品依次利用大孔吸附树脂D101、阴离子交换树脂D201层析进行分离，得到纯度较高的ACE抑制肽。
(6)检测结果显示：魔芋ACE抑制肽的抑制活性为32.1％。
实施例5
(1)将5g魔芋蛋白，加入50mL的纯净水，配制成浓度为10％魔芋蛋白溶液；
(2)调节魔芋蛋白溶液的pH值至7.0，置于恒温磁力搅拌器上使温度恒定在60℃，加入风味蛋白酶，酶解4h，得到酶解液，酶解期间保持其pH值不变；其中，每1g魔芋蛋白溶液中加入风味蛋白酶的量为4000U。
(3)将酶解液置于80℃水浴锅中灭酶20min，冷却至室温、调pH值至魔芋蛋白等电点后离心，其转速为10000rpm，时间20min，收集上清液；
(4)收集得到上清液测其ACE抑制率>20％，-110℃、冷冻干燥10h即得ACE抑制肽粗品。
(5)将ACE抑制肽粗品依次利用大孔吸附树脂D101、阴离子交换树脂D201层析进行分离，得到纯度较高的ACE抑制肽。
(6)检测结果显示：魔芋ACE抑制肽的抑制活性为14.9％。
实施例6
将魔芋蛋白加入到纯净水中，配成质量浓度为2％的魔芋蛋白溶液。将魔芋蛋白溶液的pH值调节为5后，在温度为40℃下加入风味蛋白酶，酶解6h，得到酶解液；其中，每1g魔芋蛋白溶液中加入风味蛋白酶的量为1000U；
再将酶解液再100℃下灭酶10min、冷却、调节pH值至魔芋蛋白等电点，在6000rpm下离心10min后收集上清液；上清液经-50℃冷冻干燥20h后，得到粗品，将粗品利用大孔吸附树脂D101、阴离子交换树脂D201层析进行分离，得到ACE抑制肽。
实施例7
将魔芋蛋白加入到纯净水中，配成质量浓度为5％的魔芋蛋白溶液。将魔芋蛋白溶液的pH值调节为7后，在温度为50℃下加入风味蛋白酶，酶解5h，得到酶解液；其中，每1g魔芋蛋白溶液中加入风味蛋白酶的量为2000U；
再将酶解液再85℃下灭酶20min、冷却、调节pH值至魔芋蛋白等电点，在8000rpm下离心30min后收集上清液；上清液经-50℃冷冻干燥20h后，得到粗品，将粗品利用大孔吸附树脂D101、阴离子交换树脂D201层析进行分离，得到ACE抑制肽。

Claims (7)

1.一种风味蛋白酶酶解制备ACE抑制肽的方法，其特征在于，将魔芋蛋白溶液的pH值调节为5-7后，在温度为40-60℃下加入风味蛋白酶，酶解3-6h，得到酶解液；再将酶解液灭酶、冷却、调节pH值至魔芋蛋白等电点，经过离心后收集上清液；上清液经冷冻干燥后纯化得到ACE抑制肽。
2.根据权利要求1所述的一种风味蛋白酶酶解制备ACE抑制肽的方法，其特征在于，魔芋蛋白溶液通过以下方法制得：将魔芋蛋白加入到纯净水中，配成质量浓度为2-10％的魔芋蛋白溶液。
3.根据权利要求1所述的一种风味蛋白酶酶解制备ACE抑制肽的方法，其特征在于，每1g魔芋蛋白溶液中加入风味蛋白酶的量为1000-5000U。
4.根据权利要求1所述的一种风味蛋白酶酶解制备ACE抑制肽的方法，其特征在于，灭酶的温度为80-100℃，时间为10-20min。
5.根据权利要求1所述的一种风味蛋白酶酶解制备ACE抑制肽的方法，其特征在于，离心的转速为6000-10000rpm，时间为10-30min。
6.根据权利要求1所述的一种风味蛋白酶酶解制备ACE抑制肽的方法，其特征在于，冷冻干燥的温度为-50～-110℃，冷冻干燥的时间为10-24h。
7.根据权利要求1所述的一种风味蛋白酶酶解制备ACE抑制肽的方法，其特征在于，纯化过程为：将冷冻干燥后得到的产品利用大孔吸附树脂D101、阴离子交换树脂D201层析进行分离。
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