CN105838765A - 一种菠萝蛋白酶酶解魔芋蛋白制备ace抑制肽的方法 - Google Patents

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Abstract

一种菠萝蛋白酶酶解魔芋蛋白质制备ACE抑制肽的方法，以魔芋蛋白质为原料，利用菠萝蛋白酶进行酶解，在一定酶解条件下酶解一段时间，经过灭酶、冷却、调节pH值、离心得到酶解液，酶解液通过超滤、SephadexG‑25凝胶层析、RT‑HPLC分离纯化后，得到高纯度ACE抑制肽液，经冷冻干燥得到魔芋ACE抑制肽粉末。本发明对实现魔芋飞粉有效利用，生产其高附加值产品具有重要意义。

Description

一种菠萝蛋白酶酶解魔芋蛋白制备ACE抑制肽的方法
技术领域
本发明属于ACE抑制肽制备领域，具体涉及一种菠萝蛋白酶酶解魔芋蛋白制备ACE抑制肽的方法。
背景技术
全国年产魔芋飞粉1500～2000吨。魔芋飞粉含蛋白质20％左右，目前对魔芋的利用主要集中于魔芋精粉(葡甘聚糖)，而魔芋飞粉大多以低价作为饲料或干燥剂出售，利用价值低。
高血压是一种以动脉血压持续升高为主要表现的慢性疾病，常引起心、脑、肾等重要器官的病变并出现相应的后果。高血压患者一般需要长期服用降血压药物，这可能会导致出现咳嗽、肾功能减退、蛋白尿、肝功能异常、血管神经性水肿等不良反应。因此天然、有效、无副作用、可长期服用的ACE抑制肽成为高血压药物方面研究的热点。
自1965年首次发现ACE抑制肽以来，国内外研究人员已从不同来源的蛋白质中制备出各种具有血管紧张素转化酶抑制活性的肽类物质。ACE抑制肽是指血管紧张素转化酶抑制剂。ACE抑制肽对ACE活性区域结合能力较强，共同特点是与ACE活性部位的锌离子结合的能力比AngI或缓激肽更强，而且结合之后不易从ACE结合区域释放，从而阻碍ACE催化AngI水解成AngⅡ以及催化舒缓激肽水解成为失活片段的两个过程，起到降血压的作用。
因此，利用魔芋飞粉生产高附加值产品，一方面拓宽了ACE抑制肽的来源，另一方面更好的开发利用魔芋飞粉。
发明内容
本发明的目的在于提供一种菠萝蛋白酶酶解魔芋蛋白制备ACE抑制肽的方法，该方法通过对魔芋飞粉进行处理，能够得到ACE抑制肽，提高了魔芋飞粉的附加值。
为实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：
一种菠萝蛋白酶酶解魔芋蛋白制备ACE抑制肽的方法，包括以下步骤：
(1)将魔芋蛋白溶液pH值调节为4～9后，加入菠萝蛋白酶进行酶解反应，得到酶解液；
(2)将酶解液灭酶后调节pH值至魔芋蛋白等电点，然后离心，收集上清液，上清液为ACE抑制肽。
所述步骤(1)中魔芋蛋白溶液的质量分数为1～5％。
每克魔芋蛋白溶液中加入的菠萝蛋白酶的量为3000～5000U。
所述步骤(1)pH值是采用1.0moL/L NaOH溶液调节的。
所述步骤(1)酶解温度为40～70℃，酶解时间为1～6h。
所述步骤(2)中灭酶具体是在100℃下保温至少10min。
所述步骤(2)中离心的转速为9000～10000r/min，时间为10～20min。
将步骤(2)中上清液经过超滤、Sephadex G-25凝胶层析、RT-HPLC分离，再经冷冻干燥，得到魔芋ACE抑制肽粉末。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果：
本发明以魔芋飞粉为原料，先调节魔芋蛋白溶液pH值后与菠萝蛋白酶进行酶解反应，再经过灭酶后调节pH值至魔芋蛋白等电点，即可得到ACE抑制肽，并且本发明得到的ACE抑制肽的抑制率高达70％以上，说明制备得到了ACE抑制肽，并且活性较高，本发明利用魔芋飞粉制备了ACE抑制肽，一方面拓宽了魔芋飞粉的开发利用领域，另一方便也拓宽了ACE抑制肽的来源；本发明制备方法简单，利于大量生产，并且成本低。本发明对实现魔芋飞粉有效利用，生产其高附加值产品具有重要意义。
进一步的，本发明将得到的酶解液在100℃条件下，保温至少10min，充分使其中的蛋白酶灭活。
进一步的，本发明将上清液经过超滤、Sephadex G-25凝胶层析、RT-HPLC分离，再经冷冻干燥，能够得到纯度较高的魔芋ACE抑制肽粉末。
具体实施方式
下面结合实施例子对本发明进一步阐述，但不限于此。
本发明中的酶解工艺：
利用菠萝蛋白酶酶解魔芋蛋白质制备ACE抑制肽的方法，将魔芋蛋白溶解于纯净水中，配置成蛋白溶液；蛋白液置于恒温磁力搅拌器上加热；调节pH，加入菠萝蛋白酶混合均匀，在恒温磁力搅拌器进行酶解反应的酶解条件为：pH4.0～8.0，底物质量分数1～5％，加酶量3000～5000U/g，酶解时间1～6h，酶解温度40～70℃；将酶解液置于100℃恒温水浴锅中灭酶至少10min，待酶解液温度降至室温，调节其pH为魔芋蛋白等电点；9000～10000r/min离心10～20min，收集上清液。
将上清液液经过超滤、Sephadex G-25凝胶层析、RT-HPLC得到高纯度ACE抑制肽液，经冷冻干燥得到魔芋ACE抑制肽粉末。
本发明采用如下方法测定ACE的抑制率：
利用Cushman检测法进行检测:取75uL、HHL(马尿酰-组氨酰-亮氨酸)与25uL、ACE抑制剂(多肽液)充分混匀。在37℃水浴锅中温育5min，加入25uL、25mu/mL ACE硼酸盐溶液，在37℃水浴锅中反应40min。结束后加入200uL、1.0moL/L盐酸溶液破坏反应环境，终止反应进程。然后于各试管中加入乙酸乙酯1.7mL，混合后离心4000r/min离心10min；吸取1.2mL乙酸乙酯层于另一试管中，放入100℃烘箱中，挥发溶剂40min。拿出冷却后加入去离子水3mL，混匀后在波长228nm下测定其吸光度，计算公式为：
式中：A1—ACE抑制肽和ACE都存在溶液的吸光度值
A2—不加ACE抑制肽存在溶液的吸光度值
A3—ACE与HHL存在空白溶液的吸光度值
实施例1
(1)将魔芋蛋白溶解于纯净水中，配置成质量分数为1％的魔芋蛋白溶液；
(2)用1.0moL/L NaOH溶液调节pH值后，加入菠萝白酶混合均匀，在恒温磁力搅拌器上进行酶解反应，得到酶解液；其中，酶解条件为：pH值为4.0，底物(即魔芋蛋白溶液)质量分数为1％，加酶量为3000U/g(即在每克魔芋蛋白溶液中加入菠萝白酶的量为3000U)，酶解时间为1h，酶解温度为40℃；
(3)将酶解液置于100℃恒温水浴锅中灭酶10min；
(4)待酶解液温度降至室温，调节其pH值至魔芋蛋白等电点，然后在9000r/min下离心10min，收集上清液。测其ACE抑制率>30％。说明得到了ACE抑制肽，并且具有活性。
(5)将上清液经过超滤、Sephadex G-25凝胶层析、RT-HPLC，得到高纯度ACE抑制肽液，经冷冻干燥得到魔芋ACE抑制肽粉末。
实施例2
(1)将魔芋蛋白溶解于纯净水中，配置成质量分数为2％的魔芋蛋白溶液；
(2)用1.0moL/L NaOH溶液调节pH值后，加入菠萝白酶混合均匀，在恒温磁力搅拌器进行酶解反应，得到酶解液；其中，酶解条件为：pH值为5.0，底物质量分数为2％，加酶量为3500U/g(即在每克魔芋蛋白溶液中加入菠萝白酶的量为3500U)，酶解时间为2h，酶解温度为50℃；
(3)将酶解液置于100℃恒温水浴锅中灭酶15min；
(4)待酶解液温度降至室温，调节其pH值至魔芋蛋白等电点，然后在9500r/min下离心15min，收集上清液。测其ACE抑制率>50％。
(5)将上清液经过超滤、Sephadex G-25凝胶层析、RT-HPLC，得到高纯度ACE抑制肽液，经冷冻干燥得到魔芋ACE抑制肽粉末。
实施例3
(1)将魔芋蛋白溶解于纯净水中，配置成质量分数为3％的魔芋蛋白溶液；
(2)用1.0moL/L NaOH溶液调节pH值后，加入菠萝白酶混合均匀，在恒温磁力搅拌器进行酶解反应，得到酶解液；其中，酶解条件为：pH值为6.0，底物质量分数为3％，加酶量为4000U/g(即在每克魔芋蛋白溶液中加入菠萝白酶的量为4000U)，酶解时间为3h，酶解温度为55℃；
(3)将酶解液置于100℃恒温水浴锅中灭酶10min；
(4)待酶解液温度降至室温，调节其pH值至魔芋蛋白等电点，然后在10000r/min下离心20min，收集上清液。测其ACE抑制率>70％。
(5)将上清液经过超滤、Sephadex G-25凝胶层析、RT-HPLC，得到高纯度ACE抑制肽液，经冷冻干燥得到魔芋ACE抑制肽粉末。
实施例4
(1)将魔芋蛋白溶解于纯净水中，配置成质量分数为4％的魔芋蛋白溶液；
(2)用1.0moL/L NaOH溶液调节pH值后，加入菠萝白酶混合均匀，在恒温磁力搅拌器进行酶解反应，得到酶解液；其中，酶解条件为：pH值为7.0，底物质量分数为4％，加酶量为4500U/g(即在每克魔芋蛋白溶液中加入菠萝白酶的量为4500U)，酶解时间为4h，酶解温度为60℃；
(3)将酶解液置于100℃恒温水浴锅中灭酶20min；
(4)待酶解液温度降至室温，调节其pH至魔芋蛋白等电点，然后在9500r/min离心15min，收集上清液。测其ACE抑制率>60％。
(5)将上清液经过超滤、Sephadex G-25凝胶层析、RT-HPLC得到高纯度ACE抑制肽液，经冷冻干燥得到魔芋ACE抑制肽粉末。
实施例5
(1)将魔芋蛋白溶解于纯净水中，配置成质量分数为5％的魔芋蛋白溶液；
(2)用1.0moL/L NaOH溶液调节pH值后，加入菠萝白酶混合均匀，在恒温磁力搅拌器进行酶解反应，得到酶解液；其中，酶解条件为：pH值为8.0，底物质量分数为5％，加酶量为5000U/g(即在每克魔芋蛋白溶液中加入菠萝白酶的量为5000U)，酶解时间为6h，酶解温度为70℃；
(3)将酶解液置于100℃恒温水浴锅中灭酶20min；
(4)待酶解液温度降至室温，调节其pH值至魔芋蛋白等电点，然后在9000r/min下离心10min，收集上清液。测其ACE抑制率>40％。
(5)将上清液经过超滤、Sephadex G-25凝胶层析、RT-HPLC，得到高纯度ACE抑制肽液，经冷冻干燥得到魔芋ACE抑制肽粉末。
实施例6
(1)将魔芋蛋白溶解于纯净水中，配置成质量分数为5％的魔芋蛋白溶液；
(2)用1.0moL/L NaOH溶液调节pH值后，加入菠萝白酶混合均匀，在恒温磁力搅拌器上进行酶解反应，得到酶解液；其中，酶解条件为：pH值为9.0，底物(即魔芋蛋白溶液)质量分数为1％，加酶量为3000U/g(即在每克魔芋蛋白溶液中加入菠萝白酶的量为3000U)，酶解时间为4h，酶解温度为55℃；
(3)将酶解液置于100℃恒温水浴锅中灭酶10min；
(4)待酶解液温度降至室温，调节其pH值至魔芋蛋白等电点，然后在9000r/min下离心10min，收集上清液。
(5)将上清液经过超滤、Sephadex G-25凝胶层析、RT-HPLC，得到高纯度ACE抑制肽液，经冷冻干燥得到魔芋ACE抑制肽粉末。

Claims (8)

1.一种菠萝蛋白酶酶解魔芋蛋白制备ACE抑制肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将魔芋蛋白溶液pH值调节为4～9后，加入菠萝蛋白酶进行酶解反应，得到酶解液；
(2)将酶解液灭酶后调节pH值至魔芋蛋白等电点，然后离心，收集上清液，上清液为ACE抑制肽。
2.根据权利要求1所述的一种菠萝蛋白酶酶解魔芋蛋白制备ACE抑制肽的方法，其特征在于，所述步骤(1)中魔芋蛋白溶液的质量分数为1～5％。
3.根据权利要求2所述的一种菠萝蛋白酶酶解魔芋蛋白制备ACE抑制肽的方法，其特征在于，每克魔芋蛋白溶液中加入的菠萝蛋白酶的量为3000～5000U。
4.根据权利要求1所述的一种菠萝蛋白酶酶解魔芋蛋白制备ACE抑制肽的方法，其特征在于，所述步骤(1)pH值是采用1.0moL/L NaOH溶液调节的。
5.根据权利要求1所述的一种菠萝蛋白酶酶解魔芋蛋白制备ACE抑制肽的方法，其特征在于，所述步骤(1)酶解温度为40～70℃，酶解时间为1～6h。
6.根据权利要求1所述的一种菠萝蛋白酶酶解魔芋蛋白制备ACE抑制肽的方法，其特征在于，所述步骤(2)中灭酶具体是在100℃下保温至少10min。
7.根据权利要求1所述的一种菠萝蛋白酶酶解魔芋蛋白制备ACE抑制肽的方法，其特征在于，所述步骤(2)中离心的转速为9000～10000r/min，时间为10～20min。
8.根据权利要求1所述的一种菠萝蛋白酶酶解魔芋蛋白制备ACE抑制肽的方法，其特征在于，将步骤(2)中上清液经过超滤、Sephadex G-25凝胶层析、RT-HPLC分离，再经冷冻干燥，得到魔芋ACE抑制肽粉末。
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