CN103130869A - 超声波辅助黄粉虫幼虫蛋白酶解制备的降血压肽及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开超声波辅助黄粉虫幼虫蛋白酶解制备的降血压肽及制备方法，属于生物工程技术领域。降血压肽的氨基酸序列为丝氨酸－蛋氨酸（Ser-Met），分子量为236Da，或为酪氨酸-丙氨酸-天冬酰胺（Tyr-Ala-Asn），分子量为366Da。本发明还公开了利用超声波预处理脱脂黄粉虫幼虫蛋白及蛋白酶用以制备上述降血压肽的方法。获得纯度高、结构明确、降血压效果好、容易被吸收的小分子肽；所采用的原料来源广泛，价格低廉，经过本发明的技术转化可有效地提高黄粉虫的附加值。
Description
技术领域
本发明涉及利用黄粉虫幼虫蛋白制备出两种未见报道的降血压肽及其制备、纯化方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
高血压是当今发病率最高的心血管疾病，其中95%以上的患者是原发性高血压。血管紧张素转换酶（ACE）在人体血压调节过程中起着重要的作用，通过抑制ACE活性可有效地降低原发性高血压。虽然合成的ACE抑制剂（ACEI）具有明显的降血压作用，但同时也具有许多不良反应。因而，寻求安全的ACEI成为世界各国学者研究的热点，现已发现一些生物活性肽能够抑制ACE活性，从而具有降血压作用。ACE抑制肽的研究在国外始于上世纪六、七十年代，而国内从九十年代后期开始才逐渐有报道。活性肽来源一般分为从自然界生物体中提取、化学合成和蛋白质酶解等三种方法。其中，从生物体中提取活性肽存在提取步骤繁琐及得率低等问题，目前研究相对较少。化学合成多肽也有费时费力，成本昂贵等不足。而采用蛋白酶水解各种来源蛋白质制备活性肽是一种较合理的途径。目前，人们已成功地以酪蛋白、水产品、玉米、大豆、鸡蛋、乳制品等为原料，经过蛋白酶酶解制备出降血压肽，但上述降血压肽的制备原料均为人类的生活食物。
国内外许多学者发现，分子量较小的多肽对ACE的抑制活性较强。其中二肽、三肽与游离氨基酸的吸收转移系统不同，这类小分子多肽较游离氨基酸更易被人体直接吸收，且只有进入到血液循环中的降血压肽才能发挥其降压作用。
传统的蛋白质酶解制备降血压肽的方法所需时间一般较长，利用一些物理手段对底物或参与反应的其它物质进行预处理往往能够加快水解进程。近年来，超声波技术在食品加工领域的应用越来越广泛，尤其在有效成分的提取方面应用较多，而利用超声波技术加快蛋白质酶解的报道较少。迄今为止，尚未有超声波辅助黄粉虫幼虫蛋白酶解制备降血压肽的报道。
黄粉虫（Tenebrio molitor L）是一种在世界范围内分布的仓储害虫。黄粉虫幼虫是一种高蛋白、高脂肪、矿物质元素及维生素含量丰富、氨基酸组成合理的昆虫资源。其体内蛋白质含量高达50%（干重），素有“动物蛋白饲料之王”的称誉。黄粉虫易于饲养，山东、山西、河南、江苏、陕西、湖南、广西、福建、安徽等地均有养殖，因此，我国的黄粉虫资源非常丰富。长期以来，由于对其缺乏系统的研究，黄粉虫幼虫主要用于活食喂养鸟禽类动物或饲料生产，使大量的优质蛋白资源被浪费，因此开发利用黄粉虫幼虫蛋白资源具有重要的意义与广阔的前景。
目前，国内外对于利用黄粉虫幼虫这一来源广泛、价格低廉的蛋白质资源制备降血压肽的技术尚未见报道。
发明内容
本发明的目的之一是克服传统的蛋白质酶解所用时间长的特点，利用超声波预处理脱脂黄粉虫幼虫蛋白或者在酶解前对所用蛋白酶进行适当的超声波处理从而达到提高水解速率、缩短酶解时间及改善酶解效果的目的。
本发明的目的之二是克服大分子多肽及蛋白质吸收性差以及活性和纯度不高等方面的不足，获得两种成本低、纯度高、效果好的黄粉虫幼虫蛋白源降血压肽。
超声波辅助黄粉虫幼虫蛋白酶解制备的降血压肽，其氨基酸序列为丝氨酸－蛋氨酸（Ser-Met），分子量为236 Da。
超声波辅助黄粉虫幼虫蛋白酶解制备的降血压肽，其氨基酸序列为酪氨酸-丙氨酸-天冬酰胺（Tyr-Ala-Asn），分子量为366 Da。
一、超声波辅助黄粉虫幼虫蛋白酶解制备降血压肽的方法按照下述步骤进行：
1. 原料的脱脂及超声波预处理
将干燥的黄粉虫幼虫粉进行超临界CO2脱脂，脱脂条件：萃取压力35 MPa，萃取温度35 ℃，萃取时间200 min，常压分离。称取一定量脱脂黄粉虫幼虫粉，加蒸馏水配制成2%～6%（w/v）的溶液，使用功率250～1250 W的脉冲超声波进行底物预处理，超声波处理时间5～30 min，对应一个脉冲的超声波发出时间2～4 s、间隙时间2 s。
2.可控酶解反应
将超声波处理后的脱脂黄粉虫幼虫蛋白溶液pH调至7.5～9.5，在恒温水浴中加热至40～60 ℃，按照酶与底物比例0.02～0.04:1（g/g）加入使用蛋白酶，水解度达到20%时停止反应，期间不断搅拌并用0.2 mol/L NaOH维持酶解液pH恒定。酶解结束后，将酶解液置于沸水浴中加热20 min灭酶，冷却至常温，将酶解液pH值调至7.0，浓缩冻干。
3. 降血压肽的分离纯化
利用葡聚糖凝胶G-15对黄粉虫幼虫降血压肽进行初步纯化，色谱柱规格1.6 × 60 cm；洗脱液为超纯水；洗脱速度1 mL/min；上样量2～5 mL；样品浓度约20 mg/mL；检测波长220 nm。
将经葡聚糖凝胶G-15分离得到的对ACE抑制活性最高的组分进行反相高效液相色谱分离纯化，分离条件：流动相为乙腈：水（含0.05%醋酸）=5:95(v/v)；洗脱模式为等度洗脱；上样量450 μL；样品浓度26.5 mg/mL；色谱柱Sunfire Pre C18 column (10 × 250 mm，5μm )；柱温35 ℃；流速2.2 mL/min。将经过第一次液相色谱制备的活性较高的组分利用反相高效液相色谱进行第二次纯化，流动相为乙腈（含0.05%醋酸）：水（含0.05%醋酸）=5:95(v/v)；洗脱模式为等度洗脱；样品浓度为200 μg/mL；柱温35 ℃；上样量为100 μL；流速为2.0 mL/min。
将纯化后的多肽采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）进行结构鉴定，即可得到上述黄粉虫幼虫降血压活性肽。
二、超声波辅助黄粉虫幼虫蛋白酶解制备降血压的方法也可按照下述步骤进行：
1. 原料的脱脂处理
将干燥的黄粉虫幼虫粉进行超临界CO2脱脂，脱脂条件：萃取压力35 MPa，萃取温度35 ℃，萃取时间200 min，常压分离。
2. 蛋白酶的超声波预处理
将蛋白酶用适当的缓冲溶液稀释后，使用功率50～300 W的脉冲超声波进行处理，超声波处理时间5～30 s，对应一个脉冲的超声波发出时间2 s、间隙时间2 s。
3. 可控酶解反应
称一定量取脱脂黄粉虫幼虫粉，加蒸馏水配制成2%～6%（w/v）的溶液，水浴加热至50 ℃，将溶液pH调至7.5～9.5，按照酶与底物比例0.02～0.04:1（g/g）加入超声波处理后的蛋白酶进行酶解，水解度达到20%时停止反应，期间不断搅拌并用0.2 mol/L NaOH维持酶解液pH恒定。酶解结束后，将酶解液置于沸水浴中加热20 min灭酶，冷却至常温，将酶解液pH值调至7.0。
4. 降血压肽的分离纯化
方法同前。
三、超声波辅助黄粉虫幼虫蛋白酶解制备降血压的方法也可按照下述步骤进行：
1. 原料的脱脂及超声波预处理
将干燥的黄粉虫幼虫粉进行超临界CO2脱脂，脱脂条件：萃取压力35 MPa，萃取温度35 ℃，萃取时间200 min，常压分离。称取一定量脱脂黄粉虫幼虫粉，加蒸馏水配制成2%～6%（w/v）的溶液，使用功率250～1250 W的脉冲超声波进行底物预处理，超声波处理时间5～30 min，对应一个脉冲的超声波发出时间2～4s、间隙时间2 s。
2. 蛋白酶的超声波预处理
将蛋白酶用适当的缓冲溶液稀释后，使用功率50～300 W的脉冲超声波进行处理，超声波处理时间10～30 s，对应一个脉冲的超声波发出时间2 s、间隙时间2 s。
3. 可控酶解反应
将超声波预处理后的脱脂黄粉虫幼虫粉水浴加热至50 ℃，将溶液pH调至7.5～9.5，按照酶与底物比例0.02～0.04:1（g/g）加入超声波处理后的蛋白酶进行酶解，水解度达到20%时停止反应，期间不断搅拌并用0.2 mol/L NaOH维持酶解液pH恒定。酶解结束后，将酶解液置于沸水浴中加热20 min灭酶，冷却至常温，将酶解液pH值调至7.0。
4. 降血压肽的分离纯化
方法同前。
本发明使用的蛋白酶为碱性蛋白酶。
本发明的优点：
1. 获得纯度高、结构明确、降血压效果好、容易被吸收的小分子肽；
2. 提供一种新型高效ACE抑制剂黄粉虫幼虫降血压肽的制备方法；
3. 本发明将超声波技术应用于蛋白酶解制备降血压肽，能够明显缩短脱脂黄粉虫幼虫蛋白酶解时间。
4. 本发明是一种生物酶法，易通过对酶解过程的监控，使降血压肽最大程度地释放出来，提高原料的利用率；
5. 本发明所采用的原料来源广泛，价格低廉，经过本发明的技术转化可有效地提高黄粉虫的附加值。
图1 Sephadex G-15纯化黄粉虫幼虫蛋白酶解液的层析图。
图2 P2组分经C18柱的第一次反相高效液相色谱图和各色谱峰对ACE的抑制作用。
图3 P2-F6经C18柱的第二次反相高效液相色谱图。
图4采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）对P2-F6-1进行结构鉴定。
图5采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）对P2-F6-2进行结构鉴定。
具体实施方式
本发明所述方法制取的高纯度黄粉虫幼虫降血压肽对ACE活性抑制测定试验如下：
取稀释成不同浓度溶液40 μL，加入25 μL ACE溶液，37 ℃保温10 min，加入40 μL HHL溶液，37 ℃保温30 min，加入85 μL 1.0 mol/L HCl终止反应，将反应液10 000 r/min离心20 min，取上清液进行高效液相色谱测定，用40 μL pH8.3（浓度0.05 mol/L）的硼酸缓冲液作为空白对照。
色谱条件如下：
ZORBAX-C18柱(4.6×150 mm，5 μm)；柱温25 ℃；检测波长228 nm；进样量5 μL；洗脱液为乙腈：超纯水（含0.5%醋酸）=25:75（V/V）；流速0.8 mL/min。抑制率计算公式如下：
A—空白对照组Hip的峰面积；
B—添加ACE抑制肽组Hip的峰面积。
称取一定质量样品配成不同浓度的溶液，以样品浓度为横坐标，对ACE的抑制率为纵坐标绘成圆滑的曲线，从曲线中计算IC50值。
本发明使用的蛋白酶为碱性蛋白酶，购于无锡市雪梅酶制剂科技有限公司，酶活力为32.8万U/g（按照厂商提供的反应条件测定其活力，方法参照SB/T 10317-1999 蛋白酶活力测定法）。
本发明结合实施工艺实例做进一步说明：
实施例一
1. 黄粉虫幼虫蛋白的超声波预处理
将干燥的黄粉虫幼虫粉进行超临界CO2脱脂，脱脂条件：萃取压力35 MPa，萃取温度35 ℃，萃取时间200 min，常压分离。取脱脂黄粉虫幼虫粉（超临界CO2脱脂后总蛋白含量60.5%）50 g，加入蒸馏水配制成2%（w/v）的溶液，使用功率250 W的脉冲超声波处理脱脂黄粉虫幼虫蛋白溶液30 min，对应一个脉冲的超声波发出时间2 s、间隙时间2 s。
黄粉虫幼虫酶解液的制备
将溶液恒温水浴至60 ℃，并将其pH调至7.5，加入1.2 mL 碱性蛋白酶进行酶解，水解度达到20%时停止反应，期间不断搅拌反应体系，100 ℃水浴20 min灭酶，冷却后调整pH至7.0，4000 rpm离心10 min，取上清液浓缩冻干。
黄粉虫幼虫降血压肽的纯化
配置成浓度20 mg/mL溶液，利用葡聚糖凝胶G-15对黄粉虫幼虫降血压肽进行初步纯化，色谱柱规格1.6 × 60 cm；洗脱液为超纯水；洗脱速度1 mL/min；上样量2mL；样品浓度约20 mg/mL；检测波长220 nm。经葡聚糖凝胶G-15分离后得到四个组分（Peak 1、Peak 2、Peak 3及Peak 4）（见附图1），分管收集并检测各组分的降血压活性。将活性最强的Peak 2组分进行第一次反相高效液相色谱分离纯化（见附图2），测定各色谱峰对ACE抑制活性；将活性最强的P2-F6进行第二次反相高效液相色谱分离纯化（见附图3）。
高纯度黄粉虫幼虫降血压肽的结构分析
采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）对P2-F6-1、P2-F6-2进行结构鉴定，氨基酸序列分别为丝氨酸－蛋氨酸（Ser-Met），分子量为236 Da；酪氨酸-丙氨酸-天冬酰胺（Tyr-Ala-Asn），分子量为366 Da（见附图4和图5）。
实施例二
1. 碱性蛋白酶的超声波预处理
取5 mL碱性蛋白酶用pH8.0的磷酸盐缓冲溶液（浓度0.05 mol/L）稀释至50 mL，使用功率50 W的脉冲超声波处理碱性蛋白酶溶液30 s，对应一个脉冲的超声波发出时间2 s、间隙时间2 s。
黄粉虫幼虫酶解液的制备
将干燥的黄粉虫幼虫粉进行超临界CO2脱脂，脱脂条件：萃取压力35 MPa，萃取温度35 ℃，萃取时间200 min，常压分离。取脱脂黄粉虫幼虫粉（超临界CO2脱脂后总蛋白含量60.5%）50 g，加入蒸馏水配制成4%（m/v）溶液，将溶液恒温水浴至50 ℃，并将其pH调至8.0，加入6 mL 超声波预处理后的碱性蛋白酶进行酶解，水解度达到20%时停止反应，期间不断搅拌反应体系，100 ℃水浴20 min灭酶，冷却后调整pH至7.0，4000 rpm离心10 min，取上清液浓缩，冻干。
黄粉虫幼虫降血压肽的纯化
配置成浓度20 mg/mL溶液，利用葡聚糖凝胶G-15对黄粉虫幼虫降血压肽进行初步纯化，色谱柱规格1.6 × 60 cm；洗脱液为超纯水；洗脱速度1 mL/min；上样量5 mL；样品浓度约20 mg/mL；检测波长220 nm。经葡聚糖凝胶G-15分离后得到四个组分（Peak 1、Peak 2、Peak 3及Peak 4）（见附图1），分管收集并检测各组分的降血压活性。将活性最强的Peak 2组分进行第一次反相高效液相色谱分离纯化（见附图2），测定各色谱峰对ACE抑制活性；将活性最强的P2-F6进行第二次反相高效液相色谱分离纯化（见附图3）。
高纯度黄粉虫幼虫降血压肽的结构分析
方法同实例一。
实施例三
1. 黄粉虫幼虫蛋白的超声波预处理
将干燥的黄粉虫幼虫粉进行超临界CO2脱脂，脱脂条件：萃取压力35 MPa，萃取温度35 ℃，萃取时间200 min，常压分离。取脱脂黄粉虫幼虫粉（超临界CO2脱脂后总蛋白含量60.5%）50 g，加入蒸馏水配制成6%（w/v）的溶液，使用功率1250 W的脉冲超声波处理脱脂黄粉虫幼虫蛋白溶液5 min，对应一个脉冲的超声波发出时间4 s、间隙时间2 s。
碱性蛋白酶的超声波预处理
取5 mL碱性蛋白酶用pH8.0的磷酸盐缓冲溶液（浓度0.05 mol/L）稀释至50 mL，使用功率300 W的脉冲超声波处理碱性蛋白酶溶液10 s，对应一个脉冲的超声波发出时间2 s、间隙时间2 s。
黄粉虫幼虫蛋白酶解液的制备
将超声波预处理后的脱脂黄粉虫幼虫溶液恒温水浴至40 ℃，并将其pH调至9.5，加入12 mL 超声波处理后的碱性蛋白酶进行酶解，水解度达到20%时停止反应，期间不断搅拌反应体系，100 ℃水浴20 min灭酶，冷却后调整pH至7.0，4000 rpm离心10 min，取上清液浓缩，冻干。
黄粉虫幼虫降血压肽的纯化
配置成浓度20 mg/mL溶液，利用葡聚糖凝胶G-15对黄粉虫幼虫降血压肽进行初步纯化，色谱柱规格1.6 × 60 cm；洗脱液为超纯水；洗脱速度1 mL/min；上样量3 mL；样品浓度约20 mg/mL；检测波长220 nm。
经葡聚糖凝胶G-15分离后得到四个组分（Peak 1、Peak 2、Peak 3及Peak 4）（见附图1），分管收集并检测各组分的降血压活性。将活性最强的Peak 2组分进行第一次反相高效液相色谱分离纯化（见附图2），测定各色谱峰对ACE抑制活性；将活性最强的P2-F6进行第二次反相高效液相色谱分离纯化（见附图3）。
高纯度黄粉虫幼虫降血压肽的结构分析
方法同实例一。
Claims (6)
1.超声波辅助黄粉虫幼虫蛋白酶解制备的降血压肽，其氨基酸序列为丝氨酸－蛋氨酸（Ser-Met），分子量为236 Da。
2.超声波辅助黄粉虫幼虫蛋白酶解制备的降血压肽，其氨基酸序列为酪氨酸-丙氨酸-天冬酰胺（Tyr-Ala-Asn），分子量为366 Da。
3.超声波辅助黄粉虫幼虫蛋白酶解制备降血压肽的方法，其特征在于按照下述步骤进行：
（1）原料的处理
将干燥的黄粉虫幼虫粉进行超临界CO2脱脂，定量称取脱脂黄粉虫幼虫粉，加蒸馏水配制成质量与体积比为2%～6%溶液，使用功率250～1250 W的脉冲超声波进行底物预处理，超声波处理时间5～30 min，对应一个脉冲的超声波发出时间2～4 s、间隙时间2 s；
（2）可控酶解反应
将超声波处理后的脱脂黄粉虫幼虫溶液pH调至7.5～9.5，在恒温水浴中加热至40 ℃～60 ℃，按照酶与底物质量比例0.02～0.04:1加入蛋白酶，水解度达到20%时停止反应，期间不断搅拌；酶解结束后，将酶解液置于沸水浴中加热20 min灭酶，冷却至常温，将酶解液pH值调至7.0，离心后取上清液浓缩，冻干；
（3）降血压肽的分离纯化
利用葡聚糖凝胶G-15对黄粉虫幼虫降血压肽进行初步纯化，色谱柱规格1.6 × 60 cm；洗脱液为超纯水；洗脱速度1 mL/min；上样量2～5 mL；样品浓度约20 mg/mL；检测波长220 nm；
将经葡聚糖凝胶G-15分离得到的对ACE抑制活性最高的组分进行反相高效液相色谱分离纯化，分离条件：流动相为乙腈：水（含0.05%醋酸）=5:95(v/v)；洗脱模式为等度洗脱；上样量450 μL；样品浓度26.5 mg/mL；色谱柱Sunfire Pre C18 column (10 × 250 mm，5μm )；柱温35 ℃；流速2.2 mL/min；将经过第一次液相色谱制备的活性较高的组分利用反相高效液相色谱进行进一步纯化，流动相为乙腈（含0.05%醋酸）：水（含0.05%醋酸）=5:95(v/v)；洗脱模式为等度洗脱；样品浓度为200 μg/mL；柱温35 ℃；上样量为100 μL；流速为2.0 mL/min；即可得到上述黄粉虫幼虫降血压活性肽。
4.权利要求3所述的超声波辅助黄粉虫幼虫蛋白酶解制备降血压的方法，其特征在于其中步骤1和2按照下述步骤进行：
（1）蛋白酶的处理
将蛋白酶用适当的缓冲溶液稀释后，使用功率50～300 W的脉冲超声波进行处理，超声波处理时间5～30 s，对应一个脉冲的超声波发出时间2 s、间隙时间2 s；
（2）可控酶解反应
将干燥的黄粉虫幼虫粉进行超临界CO2脱脂，定量称取脱脂黄粉虫幼虫粉，加蒸馏水配制成质量与体积比2%～6%溶液，水浴加热至40 ℃～60 ℃，将溶液pH调至7.5～9.5，按照酶与底物质量比例0.02～0.04:1加入超声波处理后的蛋白酶进行酶解，水解度达到20%时停止反应，期间不断搅拌；
酶解结束后，将酶解液置于沸水浴中加热20 min灭酶，冷却至常温，将酶解液pH调至7.0，离心后取上清液浓缩，冻干。
5.根据权利要求3所述的超声波辅助黄粉虫幼虫蛋白酶解制备降血压的方法，其特征在于其中步骤1和2按照下述步骤进行：
（1）原料及蛋白酶的处理
将干燥的黄粉虫幼虫粉进行超临界CO2脱脂，定量称取脱脂黄粉虫幼虫粉，加蒸馏水配制成质量与体积比为2%～6%溶液，使用功率250～1250 W的脉冲超声波进行底物预处理，超声波处理时间5～30 min，对应一个脉冲的超声波发出时间2～4 s、间隙时间2 s；
将蛋白酶用适当的缓冲溶液稀释后，使用功率50～300 W的脉冲超声波进行处理，超声波处理时间5～30 s，对应一个脉冲的超声波发出时间2 s、间隙时间2 s；
（2）可控酶解反应
将超声波处理后的脱脂黄粉虫幼虫溶液水浴加热至50 ℃，将溶液pH调至7.5～9.5，按照酶与底物质量比例0.02～0.04:1加入超声波处理后的蛋白酶进行酶解，水解度达到20%时停止反应，期间不断搅拌；
酶解结束后，将酶解液置于沸水浴中加热20 min灭酶，冷却至常温，将酶解液pH调至7.0，离心后取上清液浓缩，冻干。
6.根据权利要求3、4或5所述的超声波辅助黄粉虫幼虫蛋白酶解制备降血压的方法，其特征在于其中使用的蛋白酶为碱性蛋白酶。
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