CN104774896A

CN104774896A - 带鱼鱼骨铁螯合胶原肽制备方法

Info

Publication number: CN104774896A
Application number: CN201510177258.3A
Authority: CN
Inventors: 王斌; 迟长凤; 邓尚贵; 孙坤来
Original assignee: Zhejiang Ocean University ZJOU
Current assignee: Zhejiang Ocean University ZJOU
Priority date: 2015-04-15
Filing date: 2015-04-15
Publication date: 2015-07-15
Anticipated expiration: 2035-04-15
Also published as: CN104774896B

Abstract

本发明涉及一种带鱼鱼骨铁螯合胶原肽的制备方法，具体讲是以带鱼鱼骨为原料，采用酸法提取胶原蛋白，利用复合风味蛋白酶和中性蛋白酶对胶原蛋白进行酶解，采用超滤、固定化铁离子亲和层析和反相高效液相色谱分离纯化得到铁螯合胶原肽Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Trp-Gly-Pro-His-Gly，ESI/MS检测分子量为957.99Da。铁螯合胶原肽由于其独特的螯合和转运机制，吸收利用度高，又可同时补充多肽/氨基酸和铁，是一种理想的补铁物质。

Description

带鱼鱼骨铁螯合胶原肽制备方法

技术领域

本发明属于水产品精深加工技术领域，尤其涉及一种带鱼鱼骨铁螯合胶原肽制备方法。

背景技术

胶原肽是采用酶切技术从胶原蛋白中制备的平均分子量在1 000 Da左右的水解产物，相对胶原蛋白复杂的三级超螺旋结构，胶原肽的线状结构使其无需分解即可被人体吸收利用，消化吸收率高达80%。相对于胶原蛋白等大分子物质，胶原肽可以有效渗入真皮层，延长皮肤细胞寿命、抵抗自由基对DNA的攻击、抑制细胞膜脂质过氧化、促进胶原蛋白和透明质酸的合成、提高皮肤免疫力和保水能力等多种作用，使其成为药品、保健品和日化产品领域所竞相关注的焦点。

铁是人体需要量最多的微量元素，其生理作用主要有：构成血红素，预防贫血；参与细胞色素合成，调解组织呼吸和能量代谢；维持机体的免疫力和抗感染能力。而缺铁会导致食欲不振，烦躁不安，活动后呼吸急促、脉搏加快，还可有肝、脾肿大，贫血或者血象障碍；儿童缺铁可出现偏食、异食癖、智力下降、易怒不安、易发生感染等症状。据联合国儿童基金会统计，全球约有37亿人缺铁，发展中国家40%～50%的5周岁以下儿童和超过50%的孕妇患缺铁病。因此，合理补铁和提高铁的体内吸收率至关重要。现有研究证明而铁与金属螯合肽形成的螯合盐，即可促进铁的吸收，同时又能满足机体对活性肽、氨基酸等的需求，是比较理想的补铁物质。

带鱼在我国的渤海、黄海、东海一直到南海都有分布，和大黄鱼、小黄鱼及乌贼并称为中国的四大海产。但是带鱼加工过程中产生的鱼骨多数加工成鱼骨粉或者作为废弃物丢掉，浪费的宝贵的渔业资源。经检索，以带鱼鱼骨胶原蛋白制备铁螯合胶原肽未见报道。基于此，本发明根据铁螯合胶原肽和带鱼鱼骨的利用现状，提供一种具有金属铁螯合活性的胶原肽，并提供这种铁螯合胶原肽的制备方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种具有高Fe螯合活性带鱼鱼骨铁螯合胶原肽的制备方法。

本发明为解决上述技术问题所采取的技术方案为：一种带鱼鱼骨铁螯合胶原肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）带鱼鱼骨的预处理：将带鱼鱼骨按照料液比1 g:15～20 mL加入到NaOH溶液（0.1 mol/L）于1～4℃下浸泡2～4 h，脱除非胶原蛋白；处理后带鱼鱼骨用蒸馏水反复洗涤至中性、沥干，按照料液比1 g: 5～8 mL加入pH 7.4的EDTA溶液（0.5 mol/L），于1～4℃下浸泡2～3天（每天更换1次EDTA溶液），蒸馏水洗涤2～3次，干燥、粉碎，得脱钙带鱼鱼骨粉。

2）带鱼鱼骨胶原蛋白的制备：将脱钙带鱼鱼骨粉按照料液比1 g:5～8 mL加入到0.5 mol/L乙酸溶液并在1～4℃下动态浸泡3 d，10 000g离心20～25 min，取上清液，并加入NaCl至溶液终浓度为1.0 mol/L，静置60～90 min，12 000g离心25～30 min得沉淀物，冷冻干燥即为带鱼鱼骨胶原蛋白。

）带鱼鱼骨胶原蛋白的酶解：将带鱼鱼骨胶原蛋白按照料液比1 g:20～25 mL加入到磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液（pH 7.0，0.2 mol/L），按照胶原蛋白质量的1.5～2.0%向溶液中加入复合风味蛋白酶（1 000 LAPU/g），于温度45～50℃酶解4～6 h后，将溶液升温至90～95℃，并于此温度保持10～15min后，冷却至45～50℃；按照胶原蛋白质量的1.2～1.5%向溶液中加入中性蛋白酶（1.0×10⁵ U/g），于温度45～50℃下酶解4～6 h，将溶液升温至90～95℃，并于此温度保持10～15min后，8 000g离心25～30 min，取上清液，即为酶解产物；

5）带鱼鱼骨铁螯合胶原肽的制备：将制备的酶解产物采用1 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于1 kDa部分，得超滤酶解液，超滤酶解液依次经固定化铁离子亲和层析和反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化，得到带鱼鱼骨铁螯合胶原肽。

作为优选，所述步骤1）的带鱼为带鱼（Trichiutus haumela）。

作为优选，所述步骤5）的固定化铁离子亲和层析和RP-HPLC纯化的具体过程为：

固定化铁离子亲和层析：将上述超滤酶解液溶于双蒸水配成浓度为10～20 mg/mL的溶液，经过固定化铁离子Sepharose 6B亲和层析柱吸附后，用5～8倍柱体积双蒸水洗脱除去未吸附多肽，然后用3～5倍柱体积的pH 3.0的双蒸水洗脱层析柱，收集洗脱液，冻干，得亲和层析酶解物；

RP-HPLC纯化：将上述亲和层析酶解物用双蒸水配成80～100 μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化，根据对铁离子的螯合活性得1个高Fe螯合活性胶原肽Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Trp-Gly-Pro-His-Gly（GPPGPWGPHG）。

再优选，所述RP-HPLC条件为：进样量15～20 μL；色谱柱Zorbax C18（250 × 4.6mm，5 μm）；流动相25%乙腈；洗脱速度1.0～1.5 mL/min；紫外检测波长214 nm。

本发明根据多肽与金属离子螯合的理论基础，以及多肽-Fe螯合物在补铁上的显著优点，以带鱼鱼骨为原材料，通过对复合风味蛋白酶和中性蛋白酶的酶解条件控制，制备具有高Fe螯合活性的胶原肽。本发明可为补铁药物和功能产品开发，以及带鱼鱼骨的高值化利用提供技术支持。

附图说明

图1是本发明的固定化铁离子亲和层析酶解物的RP-HPLC色谱图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

一种带鱼鱼骨铁螯合胶原肽的制备方法，制备工艺流程如下：带鱼鱼骨"胶原蛋白提取"酶解"酶解物"超滤"亲和层析"RP-HPLC纯化"铁螯合胶原肽。

实施例：

1）带鱼鱼骨的预处理：将带鱼（Trichiutus haumela）鱼骨按照料液比1 g: 20 mL加入到NaOH溶液（0.1 mol/L）于2℃下浸泡4 h，脱除非胶原蛋白；处理后带鱼鱼骨用蒸馏水反复洗涤至中性、沥干，按照料液比1 g: 8 mL加入pH 7.4的EDTA溶液（0.5 mol/L），于3℃下浸泡3天（每天更换1次EDTA溶液），蒸馏水洗3次，干燥、粉碎，得脱钙带鱼鱼骨粉。

2）带鱼鱼骨胶原蛋白的制备：将脱钙带鱼鱼骨粉按照料液比1 g:8 mL加入到0.5 mol/L乙酸溶液并在4℃下动态浸泡3 d，10 000g离心25 min，取上清液，并加入NaCl至溶液终浓度为1.0 mol/L，静置90 min，12 000g离心30 min得沉淀物，冷冻干燥即为带鱼鱼骨胶原蛋白。

）带鱼鱼骨胶原蛋白的酶解：将带鱼鱼骨胶原蛋白按照料液比1g: 25 mL加入到磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液（pH 7.0，0.2 mol/L），按照胶原蛋白质量的1.5%向溶液中加入复合风味蛋白酶（1 000 LAPU/g），于温度50℃酶解4 h后，将溶液升温至90℃，并于此温度保持10 min后，冷却至50℃；按照胶原蛋白质量的1.5%向溶液中加入中性蛋白酶（1.0×10⁵ U/g），于温度50℃下酶解6 h，将溶液升温至95℃，并于此温度保持10 min后，8 000g离心30 min，取上清液，即为酶解产物；

①固定化铁离子亲和层析：将上述超滤酶解液溶于双蒸水配成浓度为10 mg/mL的溶液，经过固定化铁离子Sepharose 6B亲和层析柱吸附后，用5倍柱体积双蒸水洗脱除去未吸附多肽，然后用3倍柱体积的pH 3.0的双蒸水洗脱层析柱，收集洗脱液，冻干，得亲和层析酶解物；

②RP-HPLC纯化：将上述亲和层析酶解物用双蒸水配成80～100 μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化（条件：进样量15 μL；色谱柱Zorbax C18（250 × 4.6mm，5 μm）；流动相25%乙腈；洗脱速度1.0 mL/min；紫外检测波长214 nm），根据对铁离子的螯合活性得1个高Fe螯合活性胶原肽。

③结构检测：收集Fe螯合活性最高的胶原肽经检测为单一峰，利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Trp-Gly-Pro-His-Gly（GPPGPWGPHG），ESI/MS检测分子量为957.99 Da Da。

采用邻菲罗啉比色法，测定带鱼鱼骨铁螯合胶原肽对铁离子的螯合作用。测定结果表明：纯化得到的铁螯合肽Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Trp-Gly-Pro-His-Gly（GPPGPWGPHG）对铁离子的螯合能力为1.53 ± 0.12 nmol/μmol，因而较为适合用于制备补铁的保健食品或类似功能产品的铁携带基材。

最后，尚需注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江海洋学院

<120> 带鱼鱼骨铁螯合胶原肽制备方法

<130> zjou-wb-201504-2

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Gly Pro Pro Gly Pro Trp Gly Pro His Gly

1 5 10

Claims

1.带鱼鱼骨铁螯合胶原肽制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）带鱼鱼骨的预处理：将带鱼鱼骨按照料液比1 g:15～20 mL加入到0.1 mol/L的NaOH溶液于1～4℃下浸泡2～4 h，脱除非胶原蛋白；将经NaOH溶液处理后的带鱼鱼骨用蒸馏水洗涤至中性并沥干，在按照料液比1 g: 5至1g：8 mL加入pH 7.4的EDTA溶液，于1～4℃下浸泡2～3天（每天更换1次EDTA溶液），蒸馏水洗涤2～3次，干燥、粉碎，得脱钙带鱼鱼骨粉；

2）带鱼鱼骨胶原蛋白的制备：将脱钙带鱼鱼骨粉按照料液比1 g:5～8 mL加入到0.5 mol/L乙酸溶液并在1～4℃下动态浸泡3 d，10 000g离心20～25 min，取上清液，并加入NaCl至溶液终浓度为1.0 mol/L，静置60～90 min，12 000g离心25～30 min得沉淀物，冷冻干燥即为带鱼鱼骨胶原蛋白；

3）带鱼鱼骨胶原蛋白的酶解：将带鱼鱼骨胶原蛋白按照料液比1g:20～25 mL加入到磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液（pH 7.0，0.2 mol/L），按照胶原蛋白质量的1.5～2.0%向溶液中加入复合风味蛋白酶（1 000 LAPU/g），于温度45～50℃酶解4～6 h后，将溶液升温至90～95℃，并于此温度保持10～15min后，冷却至45～50℃；按照胶原蛋白质量的1.2～1.5%向溶液中加入中性蛋白酶（1.0×10⁵ U/g），于温度45～50℃下酶解4～6 h，将溶液升温至90～95℃，并于此温度保持10～15min后，8 000g离心25～30 min，取上清液，即为酶解产物；

4）带鱼鱼骨铁螯合胶原肽的制备：将制备的酶解产物采用1 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于1 kDa部分，得超滤酶解液，超滤酶解液依次经固定化铁离子亲和层析和反相高效液相色谱纯化，得到带鱼鱼骨铁螯合胶原肽。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤1）的带鱼为带鱼（Trichiutus haumela）。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤1）采用的EDTA溶液的浓度为0.5 mol/L。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤5）的固定化铁离子亲和层析和反相高效液相色谱纯化的具体过程为：

反相高效液相色谱纯化：将所述的亲和层析酶解物用双蒸水配成80～100 μg/mL的溶液，利用反相高效液相色谱进行纯化，根据对铁离子的螯合活性得到1个高Fe螯合活性胶原肽Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Trp-Gly-Pro-His-Gly。

5.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述反相高效液相色谱纯化条件为：进样量15～20 μL；色谱柱是规格为250 × 4.6mm，5 μm的Zorbax C18色谱柱；流动相为25%乙腈；洗脱速度为1.0～1.5 mL/min；紫外检测波长为214 nm。