CN108095074B - 一种辅助治疗骨质疏松症的金枪鱼鱼骨保健食品及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种辅助治疗骨质疏松症的金枪鱼鱼骨保健食品及其制备方法，金枪鱼鱼骨保健食品的组成及其重量份为：金枪鱼鱼骨胶原肽80‑95份、金枪鱼鱼骨活性钙5‑10份、淫羊藿苷1‑3份、维生素D0.001‑0.005份，将金枪鱼鱼骨胶原肽和金枪鱼鱼骨活性钙充分溶解于双蒸水中，加入淫羊藿苷和维生素D的乙醇溶液，然后进行喷雾干燥后充填制成胶囊。有益效果为：本发明所制备的金枪鱼鱼骨保健食品安全、无毒副作用，并且作用显著，可作为老年人、绝经期妇女和骨质疏松患者的日常保健食品；本发明的金枪鱼鱼骨保健食品可单独制备成药学上可接受的制剂，亦可与药学或食品工业中可接受的辅料制成制剂，制剂优选胶囊。
Description
技术领域
本发明涉及保健食品领域，尤其是涉及一种辅助治疗骨质疏松症的金枪鱼鱼骨保健食品及其制备方法。
技术背景
骨质疏松症(Osteoporosis)骨质疏松症是以骨组织显微结构受损，骨矿成分和骨基质等比例地不断减少，骨质变薄，骨小梁数量减少，骨脆性增加和骨折危险度升高的一种全身骨代谢障碍的疾病。骨质疏松症分为原发性和继发性二大类。原发性骨质疏松症又分为绝经后骨质疏松症(Ⅰ型)、老年性骨质疏松症(Ⅱ型)和特发性骨质疏松(包括青少年型)三种。绝经后骨质疏松症一般发生在妇女绝经后5-10年内；老年性骨质疏松症一般指老人70岁后发生的骨质疏松；而特发性骨质疏松主要发生在青少年，病因尚不明。
老年人患骨质疏松症的概率男性为60.72％，女性为90.47％。引起中老年人骨质丢失的因素是十分复杂的，近年来研究认为与下列因素密切相关。(1)中、老年人性激素分泌减少是导致骨质疏松的重要原因之一。绝经后雌激素水平下降，致使骨吸收增加已是公认的事实。(2)随年龄的增长，钙调节激素的分泌失调致使骨代谢紊乱。(3)老年人由于牙齿脱落及消化功能降低，胃纳差，进食少，多有营养缺乏，致使蛋白质，钙，磷、维生素及微量元素摄入不足。(4)随着年龄的增长，户外运动减少也是老年人易患骨质疏松症的重要原因。(5)近年来分子生物学的研究表明骨疏松症与维生素D受体(VDR)基因变异有密切关系。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种辅助治疗骨质疏松症的金枪鱼鱼骨保健食品，金枪鱼鱼骨保健食品安全、无毒副作用，并且作用显著，可作为老年人、绝经期妇女和骨质疏松患者的日常保健食品。
本发明的目的之二在于提供一种辅助治疗骨质疏松症的金枪鱼鱼骨保健食品的制备方法，制备方法简单易行，金枪鱼鱼骨保健食品各组分的提取率较高，原材料实现全效利用，安全环保。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：一种辅助治疗骨质疏松症的金枪鱼鱼骨保健食品，金枪鱼鱼骨保健食品的组成及其重量份为：金枪鱼鱼骨胶原肽80-95份，金枪鱼鱼骨活性钙5-10份，淫羊藿苷1-3份，维生素D0.001-0.005份；辅助治疗骨质疏松症的金枪鱼鱼骨保健食品安全、无毒副作用，其对于治疗骨质疏松症成果显著，可作为老年人、绝经期妇女和骨质疏松患者的日常保健食品；金枪鱼鱼骨保健食品可单独制备成药学上可接受的制剂，亦可与药学或食品工业中可接受的辅料复配制成制剂，制剂优选胶囊。
优选的，一种辅助治疗骨质疏松症的金枪鱼鱼骨保健食品，由以下重量配比的原料组成：金枪鱼鱼骨胶原肽85-90份，金枪鱼鱼骨活性钙6-8份，淫羊藿苷1.5-2.5份，维生素D0.002-0.003份。
进一步优选的，一种辅助治疗骨质疏松症的金枪鱼鱼骨保健食品，由以下重量配比的原料组成：金枪鱼鱼骨胶原肽88份，金枪鱼鱼骨活性钙5份，淫羊藿苷2份，维生素D0.002份。
一种辅助治疗骨质疏松症的金枪鱼鱼骨保健食品的制备方法，包括：溶解、制备，具体包括以下步骤：
溶解：称取1-3份淫羊藿苷和0.001-0.005份维生素D溶解于50-80份95-97％的乙醇中，搅拌并充分溶解后待用；淫羊藿苷能增加心脑血管血流量、促进造血功能、免疫功能及骨代谢，还具有补肾壮阳、抗衰老等功效；淫羊藿苷与维生素 D协同作用可以有效改善肾精亏虚症状，具有较好的医疗保健功效；
制备：取80-95份金枪鱼鱼骨胶原肽和5-10份金枪鱼鱼骨活性钙于200-300 份双蒸水中，搅拌混均，再加入上述溶解步骤中的乙醇溶液混匀，喷雾干燥，粉末上胶囊填充机进行充填，制成0.28-0.30g/粒的胶囊；经包装、成品检验得到金枪鱼鱼骨保健食品；金枪鱼鱼骨保健食品安全、无毒副作用，并且作用显著，可作为老年人、绝经期妇女和骨质疏松患者的日常保健食品；金枪鱼鱼骨保健食品可单独制备成药学上可接受的制剂，也可与药学或食品工业中可接受的辅料制成制剂。
作为优选，淫羊藿苷的制备方法包括以下步骤：
1)提取：淫羊藿粉碎后按照料液比1g:10-15mL加入45-50％乙醇溶液，加热回流提取3.0-5.0小时，利用旋转蒸发仪脱除乙醇，得淫羊藿提取液；醇法提取淫羊藿苷操作简单，污染较低，提取时间短暂，淫羊藿苷的得率较高；
2)洗脱：按照淫羊藿提取液与D101大孔树脂体积比1:15-20加入到色谱柱内，用双蒸水洗脱2-3个体积后，然后用60％乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，经旋转蒸发仪脱除乙醇、干燥得淫羊藿苷；淫羊藿苷能够对抗维生素D缺乏、调整皮质醇分泌紊乱，洗脱的废料可以用于肥料与饲料添加剂，实现淫羊藿的全物料利用。
作为优选，金枪鱼鱼骨胶原肽的制备方法包括以下步骤：
1)金枪鱼鱼骨的预处理：按照料液比1g:10-15mL向金枪鱼鱼骨中加入 0.1mol/LNaOH溶液，于2-4℃下浸泡3-5小时，然后用蒸馏水反复洗涤至 pH6.5-7.0，按照料液比1g:5-10mL加入0.5mol/L pH为7.4的EDTA溶液，于2-4℃下浸泡24-48小时后干燥、粉碎，得鱼骨粉；先后以NaOH溶液与EDTA溶液浸提金枪鱼鱼骨，可以有效去除鱼骨中的杂质，同时在保留金枪鱼鱼骨胶原蛋白活性的同时可以使胶原蛋白发生部分降解，使蛋白质暴露出更多的酶切位点，为进一步的酶解做准备；
2)金枪鱼鱼骨的酶解：按照料液比1g:15-20mL向鱼骨粉中加入超纯水，按照鱼骨粉质量的1.0-1.5％向溶液中加入胰蛋白酶，胰蛋白酶活力为2.5-3.5× 104U/g，于温度35-45℃下酶解3-4小时；然后按照鱼骨粉质量的1.0-1.5％向溶液中加入中性蛋白酶，中性蛋白酶活力为1.8-2.5×105U/g，酶解3-5小时后，溶液升温至90-95℃并保持10-15分钟后，冷却至室温，10000-11000g离心20-25 分钟，取上清液，即为酶解产物；两步酶解法可以使金枪鱼鱼骨胶原蛋白有效酶解为多肽、寡肽、氨基酸等小分子物质，可以获得生物活性良好的多肽，而且反应成本较低，过程易控；
3)金枪鱼鱼骨胶原肽的制备：将制备的酶解产物采用5kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于5kDa部分，得超滤酶解液，超滤酶解液按照体积比加入到装有10-15倍D101大孔树脂的层析柱中，用2-3倍柱体积水洗脱除去杂质，然后用5-8倍柱体积的95％乙醇进行洗脱，乙醇洗脱液于45-50℃下低压旋蒸除去乙醇、冷冻干燥得胶原肽混合物，胶原肽混合物依次经凝胶柱层析纯化，得到金枪鱼鱼骨胶原肽；将酶解液经超滤、树脂层析、乙醇洗脱、凝胶柱层析后，可以得到具有较高生物活性的金枪鱼鱼骨胶原肽，最后所得的金枪鱼鱼骨胶原肽的平均分子量为1358.0-1549.0Da，甘氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、缬氨酸含量分别为427.7-435.1残基/1000残基、31.8-32.9残基/1000残基、67.5-69.2残基/1000残基、55.4-56.1残基/1000残基、27.3-28.2残基/1000残基、35.2-36.7残基/1000残基和27.6-28.8残基/1000残基。
作为优选，所述金枪鱼鱼骨胶原肽的制备步骤中的凝胶柱层析的具体过程为：
凝胶柱层析：将胶原肽混合物溶于双蒸水配成浓度为10-20mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶G-50柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据214nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对促进成骨样MG-63细胞增殖作用最强的峰为金枪鱼鱼骨胶原肽。
作为优选，金枪鱼鱼骨活性钙的制备方法包括以下步骤：
1)金枪鱼鱼骨的预处理：金枪鱼鱼排切成5cm左右小块自来水洗净，按照料液比w/v为1:2-3加入磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，缓冲溶液的浓度为 0.2mol/L，pH6.5-7.5；按鱼骨重量的0.5-1.0％加入中性蛋白酶，中性蛋白酶活力为1.8-2.5×105U/g，酶解1.5-3小时后，去除溶液，蒸馏水洗净鱼骨；然后按照料液比1g:10-15mL向鱼骨中加入0.1mol/LNaOH溶液，于4℃下浸泡3-5小时后，用蒸馏水反复洗涤至pH6.5-7.0后，干燥、粉碎，得鱼骨粉；利用中性蛋白酶酶解金枪鱼鱼骨粉，可以有效去除鱼骨附着的碎肉以及杂质，同时也可以将骨钙蛋白分解，有助于钙离子的溶出；
2)金枪鱼鱼骨活性钙的提取：取一定量鱼骨粉，按照料液比1g:10-15mL加入酸溶液，酸溶液为体积比为1:1-1.5的苹果酸、柠檬酸的混合酸液，将溶液加热到沸腾并保持1.0-2.0小时，溶液温度降至室温，6000-8000g离心30-45分钟，取上清液，调pH至6.5-7.5，然后进行浓缩烘干，得金枪鱼鱼骨粉活性钙；高料液比有助于降低溶质含量，降低溶液体系渗透压，进而有利于钙离子的溶出，提高活果酸钙的得率；提取果酸钙后剩余的骨渣富含磷，可作为优质的磷肥，实现资源的100％利用。
与现有技术相比，本发明的优点在于：1)本发明中的金枪鱼鱼骨胶原肽，采用蛋白酶酶解并融合大孔树脂和凝胶色谱技术进行制备，酶解过程易监控，使具有促进MG-63细胞增殖作用的金枪鱼鱼骨胶原肽有效释放；2)本发明制备金枪鱼鱼骨活性钙的方法简便易行，活性钙的提取时间较短，提取效率与得率较高，提取活性钙后剩余的骨渣富含磷，可作为优质的磷肥，实现资源的100％利用；3) 本发明所制备的金枪鱼鱼骨保健食品安全、无毒副作用，并且作用显著，可作为老年人、绝经期妇女和骨质疏松患者的日常保健食品；4)本发明的金枪鱼鱼骨保健食品可单独制备成药学上可接受的制剂，亦可与药学或食品工业中可接受的辅料制成制剂，制剂优选胶囊。
附图说明
图1是本发明的超滤酶解液(≤3kDa组分)的葡聚糖凝胶G-50柱层析色谱图；
图2是本发明的葡聚糖凝胶G-50柱层析组分对MG-63细胞增殖作用的影响示意图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
一、淫羊藿苷的制备，包括以下步骤：
1)淫羊藿粉碎后按照料液比1g:10mL加入45％乙醇溶液，加热回流提取3.0 小时，利用旋转蒸发仪脱除乙醇，得淫羊藿提取液；
2)按照淫羊藿提取液与D101大孔树脂体积比1:15加入到色谱柱内，用双蒸水洗脱2个体积后，然后用60％乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，经旋转蒸发仪脱除乙醇、干燥得淫羊藿苷。
二、金枪鱼鱼骨胶原肽的制备，包括以下步骤：
1)金枪鱼鱼骨的预处理：按照料液比1g:10mL向金枪鱼鱼骨中加入 0.1mol/LNaOH溶液，于2℃下浸泡3小时，然后用蒸馏水反复洗涤至pH6.5，按照料液比1g:5mL加入0.5mol/LpH为7.4的EDTA溶液，于2℃下浸泡24小时后干燥、粉碎，得鱼骨粉；
2)金枪鱼鱼骨的酶解：按照料液比1g:15mL向鱼骨粉中加入超纯水，按照鱼骨粉质量的1.0％向溶液中加入胰蛋白酶，胰蛋白酶活力为2.5×104U/g，于温度 35℃下酶解3小时；然后按照鱼骨粉质量的1.0％向溶液中加入中性蛋白酶，中性蛋白酶活力为1.8×105U/g，酶解3小时后，溶液升温至90℃并保持10分钟后，冷却至室温，10000g离心20分钟，取上清液，即为酶解产物；
3)金枪鱼鱼骨胶原肽的制备：将制备的酶解产物采用5kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于5kDa部分，得超滤酶解液，超滤酶解液按照体积比加入到装有10倍D101大孔树脂的层析柱中，用2倍柱体积水洗脱除去杂质，然后用5倍柱体积的95％乙醇进行洗脱，乙醇洗脱液于45℃下低压旋蒸除去乙醇、冷冻干燥得胶原肽混合物；
4)凝胶柱层析：将胶原肽混合物溶于双蒸水配成浓度为10mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶G-50柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据214nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对促进成骨样MG-63细胞增殖作用最强的峰为金枪鱼鱼骨胶原肽。
三、金枪鱼鱼骨活性钙的制备，包括以下步骤：
1)金枪鱼鱼骨的预处理：金枪鱼鱼排切成5cm左右小块自来水洗净，按照料液比w/v为1:2加入磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，缓冲溶液的浓度为0.2mol/L， pH6.5；按鱼骨重量的0.5％加入中性蛋白酶，中性蛋白酶活力为1.8×105U/g，酶解1.5小时后，去除溶液，蒸馏水洗净鱼骨；然后按照料液比1g:10mL向鱼骨中加入0.1mol/L NaOH溶液，于4℃下浸泡3小时后，用蒸馏水反复洗涤至pH6.5 后，干燥、粉碎，得鱼骨粉；酶解鱼浸提可以去除金枪鱼鱼骨上附着的碎肉残渣，酶解废液可以用于饲料添加剂，实现金枪鱼鱼骨的全效利用；
2)金枪鱼鱼骨活性钙的提取：取鱼骨粉，按照料液比1g:10mL加入酸溶液，酸溶液为体积比为1:1的苹果酸、柠檬酸的混合酸液，将溶液加热到沸腾并保持 1.0小时，溶液温度降至室温，6000g离心30分钟，取上清液，调pH至6.5，然后进行浓缩烘干，得金枪鱼鱼骨粉活性钙；高料液比有助于降低溶质含量，降低溶液体系渗透压，进而有利于钙离子的溶出，提高活性钙的得率，活性钙的得率为90％作用，大大提高了金枪鱼鱼骨的经济价值；同时，提取果酸钙后剩余的骨渣富含磷，可作为优质的磷肥，实现资源的100％利用。
四、金枪鱼鱼骨保健食品的制备方法，包括：溶解、制备，具体包括以下步骤：
溶解：称取1-3份淫羊藿苷和0.001份维生素D溶解于50份95％的乙醇中，搅拌并充分溶解后待用；淫羊藿苷能增加心脑血管血流量、促进造血功能、免疫功能及骨代谢，还具有补肾壮阳、抗衰老等功效；淫羊藿苷与维生素D协同作用可以有效改善肾精亏虚症状，具有较好的医疗保健功效；
制备：取80份金枪鱼鱼骨胶原肽和5-份金枪鱼鱼骨活性钙于200份双蒸水中，搅拌混均，再加入上述溶解步骤中的乙醇溶液混匀，喷雾干燥，粉末上胶囊填充机进行充填，制成0.28g/粒的胶囊；经包装、成品检验得到金枪鱼鱼骨保健食品；金枪鱼鱼骨保健食品安全、无毒副作用，并且作用显著，可作为老年人、绝经期妇女和骨质疏松患者的日常保健食品；金枪鱼鱼骨保健食品可单独制备成药学上可接受的制剂，也可与药学或食品工业中可接受的辅料制成制剂。
实施例2：
一种辅助治疗骨质疏松症的金枪鱼鱼骨保健食品，金枪鱼鱼骨保健食品的组成及其重量份为：金枪鱼鱼骨胶原肽95份、金枪鱼鱼骨活性10份、淫羊藿苷3 份、维生素D30.005份、维生素D2 0.0003份；辅助治疗骨质疏松症的金枪鱼鱼骨保健食品安全、无毒副作用，其对于治疗骨质疏松症成果显著，可作为老年人、绝经期妇女和骨质疏松患者的日常保健食品；金枪鱼鱼骨保健食品可单独制备成药学上可接受的制剂，亦可与药学或食品工业中可接受的辅料复配制成制剂，制剂优选胶囊。
一种辅助治疗骨质疏松症的金枪鱼鱼骨保健食品的制备方法，包括：溶解、制备，具体包括以下步骤：
溶解：称取3份淫羊藿苷、0.005份维生素D3和0.00013份维生素D2溶解于 80份97％的乙醇中，搅拌并充分溶解后待用；淫羊藿苷能增加心脑血管血流量、促进造血功能、免疫功能及骨代谢，还具有补肾壮阳、抗衰老等功效；淫羊藿苷与38:1的维生素D3、维生素D2的混合物可以发挥协同作用，有利于降低破骨细胞对抗酒石酸酸性磷酸酶的分泌，有效缓解对抗酒石酸酸性磷酸酶对骨基质中固体钙磷矿化物的降解，强化骨质，缓解骨质疏松；
制备：取95份金枪鱼鱼骨胶原肽和10份金枪鱼鱼骨活性钙于300份双蒸水中，搅拌混均，再加入上述溶解步骤中的乙醇溶液混匀，喷雾干燥，粉末上胶囊填充机进行充填，制成0.30g/粒的胶囊；经包装、成品检验得到金枪鱼鱼骨保健食品；金枪鱼鱼骨保健食品安全、无毒副作用，并且作用显著，可作为老年人、绝经期妇女和骨质疏松患者的日常保健食品；金枪鱼鱼骨保健食品可单独制备成药学上可接受的制剂，也可与药学或食品工业中可接受的辅料制成制剂。
淫羊藿苷的制备方法包括以下步骤：
1)淫羊藿粉碎后按照料液比1g:15mL加入50％乙醇溶液，加热回流提取5.0 小时，利用旋转蒸发仪脱除乙醇，得淫羊藿提取液；醇法提取淫羊藿苷操作简单，污染较低，提取时间短暂，淫羊藿苷的得率较高；
2)按照淫羊藿提取液与D101大孔树脂体积比1:20加入到色谱柱内，用双蒸水洗脱3个体积后，然后用60％乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，经旋转蒸发仪脱除乙醇、干燥得淫羊藿苷；淫羊藿苷还能够对抗维生素D缺乏、调整皮质醇分泌紊乱。
金枪鱼鱼骨胶原肽的制备方法包括以下步骤：
1)金枪鱼鱼骨的预处理：按照料液比1g:15mL向金枪鱼鱼骨中加入0.1mol/L NaOH溶液，于4℃下浸泡5小时，然后用蒸馏水反复洗涤至pH7.0，按照料液比1g:10mL加入0.5mol/L pH为7.4的EDTA溶液，于4℃下浸泡48小时后干燥、粉碎，得鱼骨粉；先后以NaOH溶液与EDTA溶液浸提金枪鱼鱼骨，可以有效去除鱼骨中的杂质，同时在保留金枪鱼鱼骨胶原蛋白活性的同时可以使胶原蛋白发生部分降解，使蛋白质暴露出更多的酶切位点，为进一步的酶解做准备；
2)金枪鱼鱼骨的酶解：按照料液比1g:20mL向鱼骨粉中加入超纯水，按照鱼骨粉质量的1.5％向溶液中加入胰蛋白酶，胰蛋白酶活力为3.5×104U/g，于温度 45℃下酶解4小时；然后按照鱼骨粉质量的1.5％向溶液中加入中性蛋白酶，中性蛋白酶活力为2.5×105U/g，酶解5小时后，溶液升温至95℃并保持15分钟后，冷却至室温，11000g离心25分钟，取上清液，即为酶解产物；两步酶解法可以使金枪鱼鱼骨胶原蛋白有效酶解为多肽、寡肽、氨基酸等小分子物质，可以获得生物活性良好的多肽，而且反应成本较低，过程易控；
3)金枪鱼鱼骨胶原肽的制备：将制备的酶解产物采用5kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于5kDa部分，得超滤酶解液，超滤酶解液按照体积比加入到装有15倍D101大孔树脂的层析柱中，用3倍柱体积水洗脱除去杂质，然后用8倍柱体积的95％乙醇进行洗脱，乙醇洗脱液于50℃下低压旋蒸除去乙醇、冷冻干燥得胶原肽混合物，胶原肽混合物依次经凝胶柱层析纯化，得到金枪鱼鱼骨胶原肽；将酶解液经超滤、树脂层析、乙醇洗脱、凝胶柱层析后，可以得到具有较高生物活性的金枪鱼鱼骨胶原肽，最后所得的金枪鱼鱼骨胶原肽的平均分子量为1395.0Da，甘氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、缬氨酸含量分别为432残基/1000残基、32残基/1000残基、68.5残基/1000残基、55.5 残基/1000残基、27.5残基/1000残基、36残基/1000残基和28残基/1000残基。
所述金枪鱼鱼骨胶原肽的制备步骤中的凝胶柱层析的具体过程为：将胶原肽混合物溶于双蒸水配成浓度为20mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶G-50柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据214nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对促进成骨样MG-63细胞增殖作用最强的峰为金枪鱼鱼骨胶原肽。
金枪鱼鱼骨活性钙的制备方法包括以下步骤：
1)金枪鱼鱼骨的预处理：金枪鱼鱼排切成5cm左右小块自来水洗净，按照料液比w/v为1:3加入磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，缓冲溶液的浓度为0.2mol/L， pH为7.5；按鱼骨重量的1.0％加入中性蛋白酶，中性蛋白酶活力为2.5×105U/g，酶解3小时后，去除溶液，蒸馏水洗净鱼骨；然后按照料液比1g:15mL向鱼骨中加入0.1mol/L NaOH溶液，于4℃下浸泡5小时后，用蒸馏水反复洗涤至pH7.0 后，干燥、粉碎，得鱼骨粉；利用中性蛋白酶酶解金枪鱼鱼骨粉，可以有效去除鱼骨附着的碎肉以及杂质，同时也可以将骨钙蛋白分解，有助于钙离子的溶出；
2)金枪鱼鱼骨活性钙的提取：取一定量鱼骨粉，按照料液比1g:15mL加入酸溶液，酸溶液为体积比为1:1.5:0.003的苹果酸、柠檬酸、3,5-二氟苯甲酸的混合酸液，将溶液加热到沸腾并保持2.0小时，溶液温度降至室温，8000g离心45 分钟，取上清液，调pH至7.5，然后进行浓缩烘干，得金枪鱼鱼骨粉活性钙；高料液比有助于降低溶质含量，降低溶液体系渗透压，进而有利于钙离子的溶出，但是高料液比会造成溶液中自由离子含量降低，溶液阻抗升高，溶液中加入的微量的微量的3,5-二氟苯甲酸有助于提高溶液的离子传导能力，增强自由离子对钙离子的交换频率，有助于钙离子的溶出，提高活性钙的得率，活性钙的得率可以达到97％以上，具有极高的提取率；同时，提取果酸钙后剩余的骨渣富含磷，可作为优质的磷肥，实现资源的100％利用。
实施例3：
一种辅助治疗骨质疏松症的金枪鱼鱼骨保健食品，由以下重量配比的原料组成：金枪鱼鱼骨胶原肽88份，金枪鱼鱼骨活性钙5份，淫羊藿苷2份，维生素D 0.002份；辅助治疗骨质疏松症的金枪鱼鱼骨保健食品安全、无毒副作用，其对于治疗骨质疏松症成果显著，可作为老年人、绝经期妇女和骨质疏松患者的日常保健食品；金枪鱼鱼骨保健食品可单独制备成药学上可接受的制剂，亦可与药学或食品工业中可接受的辅料复配制成制剂，制剂优选胶囊。
实施例4：
(1)金枪鱼鱼骨胶原肽的制备：
①按照料液比1g:13mL向金枪鱼鱼骨中加入0.1mol/L NaOH溶液，于4℃下浸泡4小时后，用蒸馏水反复洗涤至pH7.0后，按照料液比1g:8mL加入 0.5mol/LEDTA溶液(pH7.4)，于4℃下浸泡48h后，干燥、粉碎，得鱼骨粉；
②按照料液比1g:20mL向鱼骨粉中加入超纯水，按照鱼骨粉质量的1.5％向溶液中加入胰蛋白酶(酶活力≥2.5×104U/g)，于温度40℃下酶解4h；然后按照鱼骨粉质量的1.5％向溶液中加入中性蛋白酶(酶活力≥1.8×105U/g)，酶解4h后，溶液升温至95℃并保持10min后，冷却至室温，10000g离心25min，取上清液，即为酶解产物；
③将制备的酶解产物采用5kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于5kDa 部分，得超滤酶解液，超滤酶解液按照体积比加入到装有12倍D101大孔树脂的层析柱中，用2-3倍柱体积水洗脱除去杂质，然后用5-8倍柱体积的95％乙醇进行洗脱，乙醇洗脱液于50℃以下低压旋蒸除去乙醇、冷冻干燥得金枪鱼鱼骨胶原肽混合物；
④将上述金枪鱼鱼骨胶原肽混合物溶于双蒸水配成浓度为15mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶G-50柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据214nm下的吸光度曲线收集洗脱组分(图1)。其中，对促进成骨样MG-63细胞增殖作用最强的峰为金枪鱼鱼骨胶原肽(TP-I)。
制备的金枪鱼鱼骨胶原肽的平均分子量为1450.0Da，甘氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、缬氨酸含量分别为427.9残基/1000残基、 32.3残基/1000残基、67.8残基/1000残基、55.9残基/1000残基、27.7残基/1000 残基、35.6残基/1000残基和28.1残基/1000残基。
(2)金枪鱼鱼骨活性钙的制备：
①金枪鱼鱼排切成5cm左右小块自来水洗净，按照料液比1:3(w/v)加入磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(0.2mol/L，pH7.0)，按鱼骨重量的0.8％加入中性蛋白酶，酶解2h后，去除溶液，蒸馏水洗净鱼骨；然后按照料液比1g:15mL向鱼骨中加入0.1mol/L NaOH溶液，于4℃下浸泡4h后，用蒸馏水反复洗涤至pH7.0 后，干燥、粉碎，得鱼骨粉。
②取一定量鱼骨粉，按照料液比1g:12mL加入酸溶液(苹果酸：柠檬酸＝1：1)，溶液温度加入到沸腾，保持1.5h，溶液温度降至室温，8000g离心，取上清液，调pH至7.0，然后进行浓缩烘干，得金枪鱼鱼骨粉活性钙。
(3)淫羊藿苷的制备：
①淫羊藿粉碎后按照料液比1:12(w/v)加入50％乙醇溶液，加热回流提取 3.0～5.0h，利用旋转蒸发仪脱除乙醇，得淫羊藿提取液；
②按照淫羊藿提取液与D101大孔树脂体积比1:20加入到色谱柱内，用双蒸水洗脱3个体积后，然后用60％乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，经旋转蒸发仪脱除乙醇、干燥得淫羊藿苷。
(4)辅助治疗骨质疏松症的金枪鱼鱼骨保健食品制备制备工艺如下：
①称取配方量的淫羊藿苷和维生素D溶解于适量95乙醇中，备用；
②取配方量金枪鱼鱼骨胶原肽和金枪鱼鱼骨活性钙于适量双蒸水中混均，再加入上述95乙醇溶液混匀，喷雾干燥，粉末上胶囊填充机进行充填，制成0.3g/ 粒的胶囊；
③经包装、成品检验，得到产品。
以实施例4中的金枪鱼鱼骨保健食品为样品进行对照实施，在大鼠去卵巢2周后开始灌服样品。阳性对照组灌胃3mg/(kg·d)的雷诺昔芬，低剂量组灌胃500mg/(kg·d)金枪鱼鱼骨保健食品，高剂量组灌胃1000mg/(kg·d)金枪鱼鱼骨保健食品，模型组予以等体积的生理盐水，每天灌胃一次，持续灌胃12周。
实施结果显示，与未去除卵巢组大鼠比较，去卵巢大鼠的活动能力均有所降低，体重增加，但模型组、阳性对照组和样品组之间无明显差异；通过对大鼠肱骨骨密度研究发现，样品组的骨矿物质含量(BMD)均显著高于模型组，而高剂量组的骨矿物质含量(BMD)与阳性对照组接近，且无明显差异；同时，金枪鱼鱼骨保健食品高剂量组可以显著提高大鼠股骨的骨灰重量和钙含量。因此，本发明金枪鱼鱼骨保健食品具有辅助治疗骨质疏松症的功能。
具体实施结果数据如下表所示：
表1金枪鱼鱼骨保健食品对大鼠肱骨骨密度(BMD)的影响(n＝15)
表2金枪鱼鱼骨保健食品对大鼠股骨物理指标及骨钙含量的影响(n＝15)
本发明的金枪鱼鱼骨保健食品工艺科学合理，操作简单，具有较强的工业实施性。本发明的金枪鱼鱼骨保健食品可作为老年人、绝经期妇女和骨质疏松患者的日常保健食品。
本发明操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1. 一种辅助治疗骨质疏松症的金枪鱼鱼骨保健食品，其特征在于：所述的金枪鱼鱼骨保健食品由如下重量份的原料制成：金枪鱼鱼骨胶原肽80-95份，金枪鱼鱼骨活性钙5-10份，淫羊藿苷1-3份，维生素D 0.001-0.005份；
所述金枪鱼鱼骨胶原肽的平均分子量为1358.0-1549.0Da，甘氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、缬氨酸含量分别为427.7-435.1残基/1000残基、31.8-32.9残基/1000残基、67.5-69.2残基/1000残基、55.4-56.1残基/1000残基、27.3-28.2残基/1000残基、35.2-36.7残基/1000残基和27.6-28.8残基/1000残基；
所述金枪鱼鱼骨胶原肽具有促进成骨样MG-63细胞增殖的作用；
所述金枪鱼鱼骨胶原肽的制备方法包括：
1）金枪鱼鱼骨的预处理：按照料液比1g:10-15mL向金枪鱼鱼骨中加入0.1mol/L NaOH溶液，于2-4℃下浸泡3-5小时，然后用蒸馏水反复洗涤至pH 6.5-7.0，按照料液比1g:5-10mL加入0.5mol/L、pH为7.4的EDTA溶液，于2-4℃下浸泡24-48小时后干燥、粉碎，得鱼骨粉；
2）金枪鱼鱼骨的酶解：按照料液比1g:15-20mL向鱼骨粉中加入超纯水，加入胰蛋白酶，于温度35-45℃下酶解3-4小时；然后加入中性蛋白酶，酶解3-5小时后，溶液升温至90-95℃并保持10-15分钟后，冷却至室温，10000-11000g离心20-25分钟，取上清液，即为酶解产物；所述胰蛋白酶的添加量为鱼骨粉质量的1.0-1.5%，胰蛋白酶活力为2.5-3.5×104U/g；中性蛋白酶的添加量为鱼骨粉质量的1.0-1.5%，中性蛋白酶活力为1.8-2.5×105U/g；
3）金枪鱼鱼骨胶原肽的制备：将制备的酶解产物采用5kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于5kDa部分，得超滤酶解液，超滤酶解液按照体积比加入到装有10-15倍D101大孔树脂的层析柱中，用2-3倍柱体积水洗脱除去杂质，然后用5-8倍柱体积的95%乙醇进行洗脱，乙醇洗脱液于45-50℃下低压旋蒸除去乙醇、冷冻干燥得胶原肽混合物，胶原肽混合物经凝胶柱层析纯化，得到金枪鱼鱼骨胶原肽；
所述金枪鱼鱼骨胶原肽的制备中的凝胶柱层析方法为：将胶原肽混合物溶于双蒸水配成浓度为10-20mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶G-50柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据214nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对促进成骨样MG-63细胞增殖作用最强的峰为金枪鱼鱼骨胶原肽。
2.一种如权利要求1所述的辅助治疗骨质疏松症的金枪鱼鱼骨保健食品的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括：
溶解：称取1-3份淫羊藿苷和0.001-0.005份维生素D溶解于50-80份95-97%的乙醇中，搅拌并充分溶解后待用；
制备：取80-95份金枪鱼鱼骨胶原肽和5-10份金枪鱼鱼骨活性钙于200-300份双蒸水中，搅拌混均，再加入上述溶解步骤中的乙醇溶液混匀，喷雾干燥，粉末上胶囊填充机进行充填制成胶囊；
所述胶囊的粒重为0.28-0.30g/粒。
3.根据权利要求2所述的一种辅助治疗骨质疏松症的金枪鱼鱼骨保健食品的制备方法，其特征在于：所述淫羊藿苷的制备方法包括：
提取：淫羊藿粉碎后按照料液比1g:10-15mL加入45-50%乙醇溶液，加热回流提取3.0-5.0小时，利用旋转蒸发仪脱除乙醇，得淫羊藿提取液；
洗脱：按照淫羊藿提取液与D101大孔树脂体积比1:15-20加入到色谱柱内，用双蒸水洗脱2-3个体积后，然后用60%乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，经旋转蒸发仪脱除乙醇、干燥得淫羊藿苷。
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