CN101416995A - 一种淫羊藿提取物及制备方法、制剂和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种淫羊藿提取物,特别是提供一种高含量的淫羊藿总黄酮提取物,其制备方法主要包括以下步骤:(1)以碱-乙醇-水作为提取溶媒回流提取;(2)减压浓缩;(3)调pH值;(4)大孔树脂柱洗脱(5)洗脱液干燥,所得总黄酮含量在65%以上,淫羊藿苷的含量在20%以上。本发明所提供的提取物可以按照药剂学上的要求制备成各种口服制剂,可以是硬胶囊剂、软胶囊剂、普通片剂、口腔崩解片、含片、分散片、缓释制剂、控释制剂、颗粒剂、水丸、滴丸、蜜丸等。该提取物及含有该提取物的有效药料可以用于制备脑组织保护剂的药物中的应用,特别是在预防和治疗脑梗死、脑梗塞后遗症等缺血性脑血管疾病的药物中的应用。
Description
技术领域:
本发明涉及中药研制领域,特别涉及一种淫羊藿提取物及其制备方法、制剂以及在制备脑组织保护剂的药物中的应用,特别是在预防和治疗脑梗死、脑梗塞后遗症等缺血性脑血管疾病的药物中的应用。
背景技术:
脑梗死俗称中风或脑卒中。中风分为出血性中风和缺血性中风,缺血性中风即脑梗死,它包括脑血栓形成、脑栓塞等,脑梗死在所有中风中占70%~80%,近几年来明显增多,且向年轻化发展。有的病人仅仅27岁,但大多数为45岁以上的中老年。脑梗死的主要病理变化是在脑动脉硬化的基础上,血管内形成血栓,阻塞了血流,造成脑组织的缺血、缺氧和坏死,使病人出现偏瘫、失语、偏侧肢体麻木、走路不稳、大小便失禁、精神错乱、痴呆、甚至成为植物人,部分脑干梗死和大面积脑梗死可致命。
脑中风是严重危害人类健康和生命安全的常见的难治性疾病,祖国医学将其列为“风、痨、臌、膈”四大疑难病之首,存在着明显三高(发病率高、致残率高、死亡率高)现象。根据统计我国每年发生脑中风病人达200万,发病率高达120/10万;现幸存中风病人700万,其中450万病人不同程度丧失劳动力和生活不能自理,致残率高达75%;我国每年中风病人死亡达120万。得过脑中风的患者,容易复发,每复发一次,加重一次。因此,充分认识脑中风的严重性,提高脑中风的治疗与预防水平、降低脑中风的发病率,致残率和死亡率是医药研究工作者的当务之急。
淫羊藿药用历史悠久,来源于小檗科淫羊藿属的多种植物。李时珍在《本草纲目》中称其有“益精气,坚筋骨,补腰膝,强心力”之功效,用于阳痿遗精、筋骨痿软、风湿痹痛、麻木拘挛等。目前对药材淫羊藿的研究比较多,现有文献大量报道它在心血管疾病的治疗作用,能抑制心肌收缩力,降低心肌氧耗量,扩张外周血管,改善微循环等;能促进造血功能、免疫功能及骨代谢,具有抗衰老、抗肿瘤等功效。关于淫羊藿提取物制备方法的文献报道也有很多,例如四川省中药研究所黎万寿等认为巫山淫羊藿中淫羊藿苷的最佳工艺是“15倍量70%乙醇溶液回流提取”(《时珍国医国药》2000,11(11):971);陕西中医学院王昌利等用正交实验对箭叶淫羊藿的总黄酮水提取和醇提取工艺进行比较,认为水提的工艺所得的提取物的含量最高(《中成药》1996,18(5):1-3);中国中医研究院中药研究所赵小妹等认为有的人淫羊藿水提醇沉法所得淫羊藿苷含量最高(《中国实验方剂学杂志》2000,6(6):3-5);还有一些人认为醇提后采用酸碱沉淀法比较理想则,甚至有人认为醇提和水提效果没有什么明显的差异等。有关淫羊藿及其制备方法的专利也是不胜枚举,其中主要的工艺方法有:水煎-大孔树脂分离法、醇提-大孔树脂分离法、水煎-萃取精制法、水煎-醇沉-大孔树脂分离法等。发明专利ZL02138339.1,“具有抗骨质疏松作用的淫羊藿总黄酮的制备方法”中所报道的淫羊藿总黄酮的分离方法是“用水提取-正丁醇萃取”。专利ZL02148571.2“治疗前列腺肥大的淫羊藿提取物及其在制备药物中的应用”中采用的制备方法是“用60-90%的有机溶剂的水溶液提取,减压回收后的残留物上大孔吸附树脂柱D101或D140,用水和乙醇梯度洗脱,收集30-85%乙醇溶液部分。”专利ZL03141371.4“淫羊藿提取物及其生产工艺”中记载了“淫羊藿经过水煮后,加入乙醇醇沉(醇含量70%),过滤后上D101大孔树脂柱,用水、85%乙醇洗脱,收集洗脱液浓缩。”还有其他一些专利文献在此就不一一列举了。总之,关于淫羊藿及淫羊藿苷的制备方法的文献方法和专利方法都比较多,而且研究结果往往大相径庭,似乎还有所矛盾。可能由于药材品种以及提取纯化的目的有所不同的缘故。很难界定研究结果的优劣,更难形成一个客观的可以作为评判的标准和参考。后来的研究者更是对所述的报道疑惑重重。发明人在试图得到高含量的淫羊藿提取物的研究过程中,按照现有的各种报道所述的制备方法进行了大量的重复实验,但是,按照其所述的方法并没有得到预期的效果。经过工艺方案的调整和创新,发明人终于获得50%以上淫羊藿总黄酮提取物。利用该高效的制备方法可以稳定地、可重复地得到较高含量的淫羊藿总黄酮和淫羊藿苷。经过多次的药理药效学试验研究,发现中药材淫羊藿提取物对缺血性脑中风即脑梗死及其后遗症的治疗具有独特的作用,便以此工艺制得的淫羊藿总黄酮和淫羊藿苷作为原料药,开发成药剂学上可以接受的药物制剂。
发明内容:
本发明所要解决的技术问题是:区别于现有技术,提供一种全新的、高效的制备高含量的淫羊藿总黄酮、淫羊藿苷的方法,还提供了该提取物在药剂学上可以接受的制剂形式以及在制备预防和治疗脑中风、中风后遗症及其他脑血管疾病的药物中的应用。
本发明是通过以下的技术方案实现的。
本发明所提供的淫羊藿提取物是将中药材淫羊藿利用一种现有技术中未曾提到过的碱-醇-水系统作为提取溶媒,经过提取、浓缩、纯化、干燥等工艺流程精制而成的。采用该方法制得的淫羊藿提取物中淫羊藿总黄酮的含量至少可以达到65%以上,其中淫羊藿苷的含量至少在20%以上。
本发明所提供的淫羊藿提取物是按照以下所述的工艺制备而成的:
(1)将药材淫羊藿粗粉,以10~40倍量碱—乙醇—水溶液作为溶媒,回流提取2~3次,每次提取时间在1~2小时;
(2)过滤,弃去药渣,合并滤液,在50℃~70℃下减压浓缩至相对密度为1.0~1.5的浸膏;
(3)过滤,滤液中加稀酸调节pH值至中性;
(4)将调过pH值后的药液上HPD100大孔吸附树脂柱,用水洗脱至无色后,用5%~35%乙醇水溶液洗脱,弃去洗脱液;
(5)再用40%~80%乙醇水溶液洗脱,收集乙醇洗脱液;
(6)洗脱液在50℃~70℃下减压浓缩,浓缩至比重约为1.20~1.40,干燥即得。
在上述制备方法中,优选20倍量0.01%碳酸钠50%乙醇水溶液作为提取溶媒,回流提取3次,每次提取时间2小时,合并三次滤液。滤液在65℃下减压浓缩至相对密度约为1.15~1.20,趁热滤过,滤液用稀盐酸调pH至中性,通过预先处理过的HPD100大孔吸附树脂柱,依次用水、30%乙醇、60%乙醇洗脱,收集60%乙醇洗脱液,回收乙醇,于70℃减压浓缩至相对密度为1.30~1.35(60℃)的稠膏,真空干燥,即得到淫羊藿总黄酮提取物,其中淫羊藿总黄酮的含量至少在65%以上,淫羊藿苷的含量至少在20%以上。
本发明所述的淫羊藿提取物可以制备成药剂学任何一种可能的药物制剂,包括口服制剂和注射用制剂,优选口服制剂。以淫羊藿总黄酮提取物为有效药料,根据需要加入可行的药用辅料,按照各种制剂常规的制备方法制成各种药用制剂。本发明的制剂每一单位所含有效药料为1mg~1000mg。
本发明所用的药物制剂可以按照已知的方法、与一种或多种可药用的载体或稀释剂等一起配制。该制剂可以是口服、非肠道、直肠、鼻内给药的形式,也可以制成气雾剂、吸入剂等给药的形式。口服制剂包括硬胶囊剂、软胶囊剂、缓释胶囊、控释胶囊、普通片剂、口腔崩解片、含片、分散片、泡腾片、缓释片、控释片、颗粒剂、水丸、滴丸、蜜丸、微丸、口服液、合剂、糖浆剂等各种制剂在内。
本发明所提供的淫羊藿提取物的制备方法是发明人通过对多种现有的实验方法进行重复、验证后,由于没有达到预期效果,从而提出的新的制备方法。按照本发明所提供的制备方法,可以确定的、可重复的、稳定的得到高含量的淫羊藿提取物,用高效液相检测法测得淫羊藿总黄酮的含量在65%以上,淫羊藿苷的含量在20%以上。同样,发明人对淫羊藿药材直接用水提或者是乙醇提取后浓缩所得的淫羊藿提取物采用上述方法检测,其中淫羊藿总黄酮的含量远远低于50%以上的要求,淫羊藿苷的含量更是很低。除此之外,还对其他目前所知的几种提取工艺方法进行了重复和验证,并且将最终的结果进行了一个客观的比较,发现使用所述的方法很难得到50%以上淫羊藿总黄酮有效部位。
以下是研究结果一览表:
现有技术中淫羊藿多是用于心血管系统疾病的治疗药物,对于神经系统疾病的作用研究相对亏乏。发明人在研究中发现本发明所述的淫羊藿提取物对神经系统疾病特别是脑梗死具有很好的治疗作用。
脑梗死后其有关区域的脑组织发生严重的脑缺血,引起电压依赖性Ca2+通道开放,兴奋性氨基酸(EAA)增加,受体调控的Ca2+通道开放,这两者Ca2+通道的开放导致细胞内Ca2+超载,由此触发花生四烯酸代谢瀑布式反应及活化氧化酶系统,产生大量自由基造成脑细胞损伤。
根据近年研究发现的脑梗死病理生理机制的新理论认为其与损伤级联反应有关,它主要包括兴奋性毒性、周围去极化、炎症、程序性细胞死亡等四种具体机制。这四种机制往往是相互因果、相互影响,在发生的时间上有重叠和互相联系。它与经典认识(血供中断=无底物=无能量=细胞死亡)不同。损伤级联反应认为脑缺血后,引起能量缺乏、兴奋性氨基酸(EAA)从细胞内释放,使细胞外兴奋性氨基酸(谷氨酸)浓度很快增加,导致突触后的谷氨酸过度激活受体,使Ca2+内流或从细胞内的钙库释放,激活大量的酶引发信号级联反应。某些酶导致氧自由基(OFR)产生,它本身也作为第二信使,损害细胞蛋白质、糖、脂肪酸等。细胞进一步去极化释放钾,细胞外钾引起去极化扩散即梗死周围去极化(PID)。氧自由基和其他信使激活炎性细胞因子和酶,导致小胶质细胞激活产生炎症反应。炎症本身产生自由基,导致恶性循环。氧自由基损伤DNA,进而和其他机制一起导致细胞凋亡。级联反应在缺血的数秒内即发生,可持续数周。级联反应都以兴奋性毒性开始。对谷氨酸介导损伤的一种解释是由于梗死周围扩散抑制样的去极化引起缺氧所致。PID是从缺血灶中心被触发而扩散到梗死周围附近(半暗区)。缺血半暗区是无灌注的中心(坏死区)和正常组织间的移行区,该区细胞结构存在但功能受损。半暗区不是静止的,随时间和治疗其大小发生改变。梗死区可扩展到半暗区,成功的治疗可缩小半暗区的范围。半暗区是兴奋性毒性、梗死周围去极化、炎症、凋亡起作用的地方,也是治疗的主要着眼点。半暗区最初损害表现为功能障碍,它和缺血造成的代谢紊乱有关。当血流速度下降时,首先是蛋白质合成抑制,继为厌氧糖酵解、神经递质释放和能量代谢紊乱,最后是缺氧去极化,加重局部缺血损伤,这提示治疗性的抑制去极化可减小梗死面积。
炎症是由级联反应大量细胞毒性成分诱导的氧自由基和其他介质导致细胞因子和致炎症酶原产生的结果。细胞因子作用于内皮细胞受体,吸引白细胞并诱导它们移至脑。而再灌注时中性粒细胞的损伤机制可能有以下几种:(1)由于缺血组织局部产生的趋化因子使中性粒细胞相缺血区浸润;活化的中性粒细胞可释放出多种毒性产物和破坏性的蛋白酶,其中被确认具有介导损伤作用的有髓过氧化物酶、胶原蛋白酶、弹性蛋白酶等,直接造成组织损伤。(2)缺血再灌注中的中性粒细胞粘附、集聚所产生的血流变学效应可加重组织损伤。(3)激活的中性粒细胞可释放TNF(肿瘤坏死因子)、IL-6(白细胞介素-6),引起血管内皮细胞和白细胞表面粘附分子暴露,两者亲和力增强。而黏附的中性粒细胞和血管内皮细胞进一步被激活,自身合成和释放更多的具有趋化作用的炎性介质,使白细胞的浸润进一步加重。(4)再灌注时组织重新获得O2的供应,激活的中性粒细胞耗氧量显著增加,产生大量氧自由基,造成细胞损伤。由此可以看出白细胞介导的微血管损伤和细胞氧化损伤在缺血再灌注损伤的发病中起着重要作用。所以研究表明抑制炎症反应可能也是新的治疗脑梗死的对策。
脑缺血触发的另一类型细胞死亡是程序性死亡(PCD),其中包括凋亡。当细胞接受导致凋亡的“信号”时,细胞内的蛋白质被激活,引发信号级联反应杀死细胞。研究发现细胞凋亡在再灌注半小时即出现,以24~48h凋亡细胞数最多,且可持续四周之久,主要分布于梗死灶边缘区内层。凋亡是脑损伤的动态进行过程,参与缺血后梗塞的发展。急性缺血的中心神经细胞以坏死为主,表现为神经细胞的快速死亡,成为不可逆性死亡。
本发明所提供的淫羊藿总黄酮不但能够显著改善脑缺氧状态,对缺血性脑组织的再灌注损伤具有明显的保护作用,降低血小板聚集,抑制脑血栓生成等的作用,更重要的是可以抑制ATP酶和腺苷酸环化酶的活性,减少ATP的分解,改善脑细胞的能量平衡,提高脑细胞对氧和葡萄糖的利用率与代谢,使神经原的能量增加,电位活力和微循环改善,改善神经功能障碍;直接作用于中枢神经系统多巴胺和5-羟色胺受体,增强突触前神经末梢释放递质和突触后受体的刺激作用,改善神经传递功能;能阻断α-受体,缓解血管痉挛,降低血管阻力,因而增加脑组织的血流供应和对氧的利用。本发明所述的淫羊藿提取物及其各种制剂可以用于制备预防和治疗脑梗死及其后遗症的药物中的应用。
和现有技术相比,本品具有以下优势:
(1)含量高。和现有技术相比,作为开发中药五类新药的原料药的本发明所提供的淫羊藿提取物中淫羊藿总黄酮的含量达到65%以上,淫羊藿苷的含量达到20%以上。本发明突破了现有技术中所采用的提取溶媒非水即醇的惯性思维,而是选择水—碱—醇溶媒系统,经过多次的工艺优化,最终确定了最佳的工艺流程。由于淫羊藿有效成分大部分是含有羟基(酸性)的黄酮类成分及其聚合物,仅是以水或者是醇来提取,势必有一些聚合物不能在水或醇里充分溶解,从而造成提取不完全,有效物质含量随之降低的后果。发明人以水—碱—醇作为提取溶媒,则可以很好的解决这一问题。不但可以使溶于醇溶液的物质大量释放,还可以将其中大量的酸性聚合物在碱溶液中水解,从而使药材中的有效物质能够尽可能完全溶解而被提取出来。这样不但提高了有效物质淫羊藿总黄酮的含量,而且使一些聚合物水解,转化成淫羊藿苷,提高了淫羊藿苷的含量。经过大孔树脂精制的淫羊藿提取物中,淫羊藿总黄酮的含量在65%以上,淫羊藿苷的含量在20%以上。这充分说明了本发明所采用的水—碱—醇系统的溶媒在淫羊藿的提取工艺上展示了突出的创造性和进步性,同时使得淫羊藿提取物具有不同于现有技术的新颖性。
(2)作用机理独特。缺血性脑损伤的病理机制非常复杂,有多个病理环节参与,是一个多基因和多靶点参与的过程。本品独特的作用机理表现在它对脑梗死从多方面、多靶点起作用,不但能够扩张脑血管、抑制血小板聚集、抑制血栓形成,而且可以重构脑缺血区微循环、挽救半暗带,减轻兴奋性氨基酸的毒性作用,减轻炎症反应,抑制细胞凋亡,增强血脑屏障保护作用,促进神经功能恢复、提高能量利用、恢复脑细胞能量代谢、改善神经传递功能,从而明显地改善临床症状,提高生存率,降低致残程度。
(3)安全性高。本品源于天然植物,安全性很好,副反应低,脑梗死等缺血性脑卒中的各个治疗阶段都可以使用。
综上所述,本品经整体动物、细胞和分子生物学等水平深入研究,证明主要有以下药理活性:1、改善脑缺血软脑膜微循环障碍作用,重构缺血区微循环,挽救半暗带,显著缩小脑梗塞面积;2、提高能量利用,恢复脑能量代谢;3、抑制神经递质的毒性作用和纠正神经递质的异常,从而改善神经传递功能;4、阻断自由基连锁反应,抑制脂质过氧化反应;5、调节氨基酸代谢,降低细胞内钙离子超载;6、抑制细胞凋亡,抑制脑电活动,抑制神经元受损;7、增强血脑屏障保护,保持大脑内环境的稳定性8、抗血栓的形成和抗血小板凝聚作用;9、扩张脑血管、增加脑血流量;10、改善局部脑缺血所致记忆障碍;11、对易感型自发性高血压脑卒、脑血管痴呆等疾病有预防和治疗作用。
以下将以药理、药效实验对本发明作进一步的阐释和说明。
1、本品对脑缺血模型鼠脑组织MPO和神经细胞凋亡的影响
1.1、材料与方法
1.1.1 动物及模型制备
健康成年雄性SD大鼠,体重250~300g。采用线栓法制备大鼠局灶性脑缺血模型。结扎大鼠颈总动脉和颈外动脉,自颈总动脉分叉处向颈内动脉插入栓线约18mm,阻断大脑中动脉血流,造成局灶性脑缺血。术后将栓线尾部置于劈下,缺血2小时后轻轻拔栓线造成血流再灌注。假手术组颈内动脉也插入栓线,但深度为5~7mm,不能阻塞大脑中动脉。
1.1.2 主要试剂和药品
MPO测定试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒、兔抗鼠bcl—2抗体、bax抗体及生物素化羊抗兔IgG及DAB显色剂、本品。
1.1.3 动物分组
将60只大鼠随机分为5组,分别为假手术组、模型组、本品低、中、高剂量组,每组12只。给药组灌胃给药,每日1次,7天后造模。脑缺血2小时后再灌注24小时后取脑组织标本分别检测MPO活性及神经细胞凋亡情况。
1.1.4 脑组织MPO活性测定
脑缺血2小时后再灌注24小时后将每组中6只大鼠断头取脑,取缺血侧脑组织(假手术组取假手术侧)100mg,按重量体积1:19加均浆介质制备成5%的组织均浆,按照试剂盒说明书进行具体步骤操作,采用分光光度法在460nm1cm光径处检测各管OD值,应用公式:
测定管OD值-对照管OD值/11.3*取样量计算MPO活性数值。
1.1.5 脑组织神经细胞凋亡检测
脑缺血2小时再灌注24小时后将每组中6只大鼠用10%水合氯醛过量麻醉,迅速开胸暴露心脏,经升主动脉插管后灌注生理盐水快速冲洗,再用4%冷多聚甲醛磷酸缓冲液(Ph7.4)冲洗灌注至肝脏褪色变硬,四肢、尾变硬。断头取脑,取视交叉前后约2~3mm范围的冠状切片脑组织置于4%多聚甲醛中4℃条件下固定24小时,石蜡包埋。连续冠状切片,片厚约4um,行TUNEL染色。采用Nikon ECLIPSE E600全自动图象分析系统,在相同的视野下,分别对相邻切片的凋亡细胞核bcl—2、bax免疫反应阳性细胞的数目、面积及平均光密度进行分析。
1.1.6 统计学处理计量资料以(X±S)表示,采用t检验。
1.2、结果:见表1、2、3。
与假手术组比较,模型组缺血侧脑组织MPO活性显著升高,TUNEL阳性细胞(即凋亡神经元细胞,胞体缩小,核膜皱缩,染色不均,浓集于核膜附近,见核固缩核核碎裂)数目增多,其阳性面积及平均光密度显著增加。与模型组比较,本品低、中、高剂量组大鼠缺血侧脑组织MPO活性降低,TUNEL阳性细胞数目减少(P<0.01,P<0.05),其阳性面积及平均光密度显著降低,其中高剂量组最强。
结果显示,假手术组仅有少量bax蛋白表达,缺血2小数再灌注24小时,bax蛋白的阳性面积及平均光密度显著增加,与假手术数组差异显著。本品治疗后阳性面积及平均光密度显著下降,与模型组比较差异显著。
在正常情况下,bcl—2在神经细胞就有较强的表达,缺血2小数再灌注24小时后bcl—2蛋白阳性面积及平均光密度显著减少,与假手术组差异显著,本品治疗后阳性面积及平均光密度均显著提高,与模型组比较差异显著。
表1:各组大鼠脑组织MPO活性、神经细胞凋亡情况比较(X±S)
组别 | N(只) | MPO(u/g) | TUNEL阳性细胞数目(个/视野) | 阳性面积 | 平均光密度 |
假手术组 | 12 | 0.032±0.005 | 1.9±0.2 | 3.10±1.06 | 0.14±0.008 |
模型组 | 12 | 0.480±0.059# | 52.1±8.8# | 22.12±1.40# | 0.25±0.012# |
低剂量组 | 12 | 0.389±0.009* | 25.2±1.5* | 20.10+1.38 | 0.21±0.086 |
中剂量组 | 12 | 0.360±0.019* | 22.0±1.3* | 18.35±1.30* | 0.19±0.012* |
高剂量组 | 12 | 0.349±0.012** | 19.0±0.5** | 16.85±1.29** | 0.17±0.001** |
与假手术组比较#P<0.01,与模型组比较*P<0.01,**P<0.05
表2:本品对脑缺血再灌注模型鼠半暗带区bax蛋白的影响
组别 | N(只) | 阳性面积 | 平均光密度 |
假手术组 | 6 | 3.03±0.85 | 0.128±0.014 |
模型组 | 6 | 26.25±2.95# | 0.192±0.018# |
低剂量组 | 6 | 18.30±2.50* | 0.188±0.018 |
中剂量组 | 6 | 16.59±3.18** | 0.170±0.020* |
高剂量组 | 6 | 14.01±3.48** | 0.149±0.012** |
与假手术组比较#P<0.01,与模型组比较,**P<0.05,*P<0.01。
表3:本品对脑缺血再灌注模型鼠半暗带区bcl—2蛋白的影响
组别 | N(只) | 阳性面积 | 平均光密度 |
假手术组 | 6 | 19.56±1.60 | 0.22±0.070 |
模型组 | 6 | 10.25+2.15# | 0.15±0.08# |
低剂量组 | 6 | 12.30±1.50 | 0.1609±0.038 |
中剂量组 | 6 | 15.59±1.88* | 0.172±0.021* |
高剂量组 | 6 | 17.98±1.48** | 0.199±0.062** |
与假手术组比较#P<0.01,与模型组比较,**P<0.05,*P<0.01。
2、本品对脑缺血模型鼠局部葡萄糖利用率的影响
2.1 材料与方法
2.1.1 材料:
健康雄性SD大鼠20只,体重300~350g,随机分为对照组和本品组,每组10只。
2.1.2、方法:
SD大鼠用2%戊巴比妥钠30mg/kg体重腹腔注射麻醉后制作大脑中动脉闭塞模型,缺血3小时后拔出线栓,缺血1小时后按1g/kg体重的剂量用微量输液泵腹腔滴注本品溶液,对照组富腹腔滴注等量生理盐水。缺血后24小时用过量戊巴比妥钠处死动物。进行LCGU测定。
2.1.3、统计学方法:采用方差分析。
2.2、结果:
局部脑葡萄糖利用率14c去氧葡萄糖渗出少表明葡萄糖利用率低,本品组缺血中心区LCGU明显高于对照组(P<0.05),缺血周边区LCGU也明显高于对照组及对侧大脑半球同源区(P<0.05),表明本品能增加局灶性脑缺血模型及其周边区的LCGU。
表4:本品对大鼠局部脑葡萄糖利用率的影响(umol.100g-1,X±S)
组别 | 缺血中心区 | 缺血周边区 | 对侧相同区域 |
对照组 | 49.87±23.20 | 183.6±24.01 | 135.0±29.0 |
本品组 | 126.80±13.5* | 255.32±40.1** | 172.6±23.65 |
与对照组比较*P<0.05,与对侧大脑半球相同区域比较**P<0.05
3、对于大鼠脑缺血再灌注中白细胞浸润情况的影响
3.1 材料和方法
3.1.1 动物分组:
健康Wister大鼠40只,体重在250~300g雌雄各半。随机将大鼠均分成4组,每组10只:正常组、假手术组、对照组和给药组。正常组无手术操作。
3.1.2 脑缺血再灌注模型制备:
假手术组腹腔注射20g/L戊巴比妥钠(50mg/kg)进行麻醉。将麻醉后的大鼠仰卧固定于大鼠定位仪上,展平颈部,,常规消毒,在喉头于胸骨之间正中线处作一纵向切口,长约2.5cm,沿胸锁乳突肌内侧缘钝性分离肌肉,暴露双侧颈总动脉,分离两侧颈总动脉穿线备用,在两侧颈总动脉下垫一小硅胶管但不结扎,消毒,缝合伤口。对照组和给药组手术操作通假手术组,但结扎两侧颈总动脉,阻断大脑血液供应。1小时后撤出硅胶管,恢复血流供应。假手术组、对照组于缺血后再灌注2小时腹腔注射生理盐水(10mg/kg);给药组术前灌胃给药7天,每日一次,造模后缺血再灌注1天后快速腹主动脉取血后再断颈开颅取脑。对照组和给药组大鼠一侧大脑半球用于制备脑匀浆,一侧大脑半球用于制备组织病理切片。3.1.3 药物及试剂
丙二醛(MDA)试剂盒、超氧化物岐化酶(SOD)试剂盒、TNF试剂盒本品原料药。
3.1.4 仪器:
大鼠定位仪、800型离心机、721分光光度计、显微镜、图象分析仪。
3.1.5 统计学处理方法
使用SPSS10.0统计软件包进行数据分析。
3.2 结果
3.2.1 脑匀浆中MDA、SOD及血清中TNF的含量,结果见表5、表6。
表5:大鼠脑缺血再灌注后脑匀浆中SOD活性和MDA含量(X±S n=10)
组别 | 剂量(10mg/kg) | SOD(U/mg pr) | MDA(nmol/mg pr) |
正常组 | 0 | 43.19±4.30 | 13.49±2.17 |
假手术组 | 10(生理盐水) | 39.70±4.18 | 12.84±2.71 |
对照组 | 10(生理盐水) | 35.30±7.40 | 47.58±8.30 |
给药组 | 10(本品) | 49.20±4.75* | 13.65±3.20** |
注:与对照组相比*P<0.01,**P<0.05
表5可以看出,药物组与对照组比较,脑匀浆中SOD活性明显升高(P<0.01),而MDA的含量明显下降(P<0.05),都具有统计学意义。
表6:大鼠脑缺血再灌注后血清中TNF含量(X±S n=10)
组别 | 剂量(10mg/kg) | TNF(ng/ml) |
正常组 | 0 | 0.94+0.13 |
假手术组 | 10(生理盐水) | 1.13±0.34 |
对照组 | 10(生理盐水) | 1.71±0.35 |
给药组 | 10(本品) | 0.92±0.15* |
注:与对照组比较*P<0.05
表6可以看出,给药组与对照组比较,血清中TNF含量明显下降(P<0.05)。
3.2.2 脑梗塞区白细胞的计数
各组大鼠在脑缺血再灌注1天后处死,取一侧大脑半球永体积分数为10%福尔马林溶液固定,石蜡包埋,沿冠状位在视交叉平面连续切片5张(5um),常规HE染色,随机抽取1张作为光镜观察,光镜400倍视野下,用标准的10*10镜栏栅计数缺血组织中的白细胞,每张切片计数5各视野。切片中性白细胞典型及未受缺血影响者,结果见表7。
3.2.3 脑梗塞灶面积计算
利用图象分析系统计算视交叉平面处脑梗塞灶面积,结果见表7。
表7:大鼠脑缺血再灌注后脑梗塞区白细胞个数及脑梗塞面积结果
组别 | 剂量(10mg/kg) | 白细胞个数 | 脑梗塞面积(mm2) |
正常组 | 0 | 0 | 0 |
假手术组 | 10(生理盐水) | 0 | 0 |
对照组 | 10(生理盐水) | 11.20±1.82 | 47.35±5.60 |
给药组 | 10(本品) | 7.01±2.30* | 29.78±2.86* |
注:与对照组比较*P<0.01
表7可以看出,给药组大鼠脑梗塞区白细胞计数和脑梗塞面积与对照组比较明显减小(*P<0.01)。
从上述实验可以看出本品能显著抑制白细胞的浸润,减少氧化损伤,减小梗塞面积。
4、对脑缺血大鼠软脑膜微循环的影响
4.1 材料和方法
4.1.1 实验动物
SD大鼠,体重250~300g。按性别分笼饲养。自由饮水。
4.1.2、仪器与实验药品、试剂
MCIP微循环图象系统,生物信号采集处理系统。本品、脑心通、人工脑脊液。
4.1.3、分组与给药方法
取SD大鼠40只,按性别随机分为5组,每组8只,雌雄各半,分别十二指肠给药本品30mg/kg、60mg/kg、120mg/kg,脑心通100mg/kg,及等容量生理盐水,给药容积均为2ml/kg。
4.1.4 脑缺血模型的建立
取SD大鼠,腹腔注射戊巴比妥钠40ml/kg,麻醉,沿腹正中线切开,行十二指肠插管,荷包缝合。仰卧位固定,分离两侧颈总动脉,一侧颈总动脉结扎,另一侧颈总动脉插管,连接三通,一端与生物信号采集处理系统连接,以描记血压,另一端与注射器相连以备放血。然后将大鼠俯卧位固定,暴露颅骨,在离矢状缝约0.2~0.3cm处用手术刀刮薄骨板,逐层分离硬脑膜、蛛网膜、暴露软脑膜,形成一椭圆形窗口,以人工脑脊液保持软脑膜湿润,用MCIP微循环图象处理系统选取管径为20~50um的微血管进行观察。控制室温。
待血压平稳后,快速从颈总动脉放血,平均动脉压下降为45±5毫米汞柱,以此作为地压低灌注性脑缺血的开始。稳定10分钟后,分别十二指肠给药,用MCIP微循环图象处理系统测量给药前及给药后30、60、120、180分钟微血管的管径及血流速度,计算血流速度和血管管径的变化率。
血流速度变化率=(给药后血流速度—给药前血流速度)/给药前血流速度×100%
血管管径变化率=(给药后血管管径—给药前血管管径)/给药前血管管径×100%
4.1.5 统计处理
实验结果以均数±标准差(X±S)表示,采用成组设计的二样本均数比较的t检验。
4.2 结果
模型组大鼠软脑膜微循环血流速度持续性减慢,而给与脑安康胶囊后,大鼠软脑膜微循环血流速度明显加快,给药30分钟后即开始起效(P<0.01),60分钟后达最大作用,最大增幅可以达52%,随后作用逐渐减弱。各时间点血流速度变化率与模型组比较均有显著性差异(P<0.05,P<0.01)。实验结果见表8、9
表8:本品对脑缺血大鼠软脑膜微循环血流速度的影响(X±S,n=8)
注:与正常比较,*P<0.01,与生理盐水组比较**P<0.01。
模型组大鼠软脑膜微循环微血管持续性收缩,而给与本品后,大鼠软脑膜微循环血管明显扩张,给药后30分钟后即开始起效(P<0.05),60分钟后达到最大作用,最大扩张率达到35.0%,随后扩血管作用逐渐减弱。各时间点管径变化率与模型组比较均显著性差异(P<0.01,P<0.05)。
表9:对脑缺血大鼠软脑膜微循环血管管径的影响(X±S,n=8)
注:与正常比较:##P<0.01,与生理盐水组、对照组比较,**P<0.01,*P<0.05。
本实验结果表明,本品具有较好的改善脑缺血软脑膜微循环障碍作用,且起效快,维持时间长,能够很好的治疗脑梗死疾病。
5、对中风后遗症的作用的研究
5.1、材料与方法
5.1.1、动物与分组
雄性SD大鼠180只,重250~300g。随机分为缺血性中风后遗症模型组、药物组、假手术组,每组60只。
5.1.2、药物本品。
5.1.3、缺血性中风后遗症模型的制备
按TAMURA的方法稍加改进行右侧近端大脑中动脉电凝术制成MCAO模型,MCAO5周后即为缺血性中风后遗症大鼠模型。假手术组大鼠行相同的开颅手术而不凝闭MCA。
5.1.4、给药方法
模型成功后,3组同时进行灌胃治疗。药物组按60mg/kg给药,余两组分别给予同等量生理盐水,每日1次,共14天。
5.1.5、观测指标的测定
5.1.5.1、额叶皮质、海马区rCBF的测定
3组大鼠分别于治疗前、后1周和2周各取8只进行测定,每只大鼠均测定梗死灶对侧半球额叶皮质及同侧海马rCBF。采用激光多普勒血流仪。大鼠麻醉后固定于立体定位仪,剪开颅顶皮肤,用牙科钻钻透颅骨。以微型支架固定光纤探头,测定梗死灶对侧额叶rBCF时选择距离前囟门后1.2mm,顶缝右侧2mm点,进针1mm;测定海马rCBF时选择前囟门后5mm,顶缝右侧3mm点,进针2.54mm,连续测定10分钟,记录LDP输出信号,经PERISOFT程序处理,计算平均值。
5.1.5.2、大鼠神经行为学改变的测定
采用FEENEY等大鼠走横木实验1~7分法评价大鼠四肢精细运动功能恢复情况。3组大鼠分别于治疗前、治疗后1周和2周,各取12只大鼠进行测评。
5.1.5.3、大鼠脑组织GAP-43、SYN表达的测定
大鼠运动功能评分后,于观察各时相从3组中各取6只迅速断头取脑,沿冠状面平均每隔2mm分成数层,4%多聚甲醛固定,梯度酒精脱水,石蜡包埋。切片机上行厚度为5um连续冠状切片,严格按照试剂盒说明行免疫组化染色。观察时,随机取上、下、左、右、中5各视野,用自动病理图文分析系统免疫组化染色阳性信号的面积占当时视野面积的百分比,即为所要测定的免疫反应产物阳性信号的密度值。
5.1.5.4、大鼠脑微血管内皮细胞ET-1、eeNOS、P-gpmRNA表达的测定。
大鼠运动功能评分后,于观察各时相从3组中各取6只迅速断头取脑。固定、脱水、浸腊包埋及切片操作同上,根据试剂盒说明行原位杂交。切片从各实验组每个观察时点所得切片中随机选取,每张切片随机观察10条微血管(×400),统计血管内皮细胞阳性率及染的深度。
表10:大鼠脑微血管内皮细胞染色评分标准
5.1.6、统计学方法
实验结果以均数±标准差(X±S)表示,应用SPSS软件包进行统计学分析,以P<0.05为差异有显著意义。
5.2、结果
5.2.1、额叶皮质、海马区rCBF均显著低于假手术组(P<0.05);治疗1周后,药物组额叶皮质rCBF即升至假手术组水平,知道观察结束;海马区rCBF与治疗第2周叶显著高于模型组,见表11。
表11:大鼠额叶皮质、海马区rCBF的测定[ml/(100g/min)X±S]
注:额叶皮质区:与模型组比较#P>0.05,##P<0.05;与假手术组比较*P<0.05,**P<0.05;海马区:与模型组比较#P>0.05,##P<0.05,与假手术组比较**P<0.05。
5.2.2、对大鼠神经功能恢复的影响
治疗前模型组与药物组评分显著低于假手术组(P<0.05);治疗1周时,药物组评分与模型组比较无显著性差异;2周后,药物组积分较模型组有显著提高。见表12。
表12:大鼠运动功能测试结果(X±S)
组别 | N | 0周 | 1周 | 2周 |
模型组 | 36 | 5.10±013 | 512±0.15 | 5.10±0.12 |
给药组 | 30 | 5.11±0.13 | 5.22±0.18 | 5.76±0.12*# |
假手术组 | 36 | 7.01±0.00 | 700±0.00 | 7.00±0.00 |
注:药物组与模型组相比较*P<0.05;药物组和假手术组比较#P<0.05。
5.2.3 对大鼠脑组织GAP-43、SYN表达的影响
实验结果见表13。
假手术组GAP—43在大脑皮层及部分脑区有表达,且呈对称性分布,各时点无显著性差异。模型组在梗死灶中心区GAP-43未见表达,梗死灶周围区GAP-43阳性信号密度值与假手术组比较无显著性差异。药物治疗1周时,同模型组比较GAP-43表达不显著,第2周梗死灶周围区GAP-43表达明显提高,与其他两组比较均有显著性差异。
SYN阳性表达产物在假手术组可见于皮质、纹状体、海马等处,各观察时点比较无显著差异。模型组在梗死灶周围区可见SYN阳性表达,但各时点其阳性密度值均低于假手术组。药物组治疗1周后,梗死灶周围区SYN阳性密度值明显高于模型组,2周时则达假手术组水平。
表13、大鼠GAP-43、SYN阳性信号密度值的变化(%,X±S)
注:GAP-43阳性信号密度值的变化:药物组2周时分别与0周和1周时相比较,均为*P<0.05;与同时段模型组比较,P<0.05;与同时段假手术组比较△P<0.05;SYN阳性信号密度值的变化:与假手术组比较△P<0.05,▲P>0.05;与模型组比较,**P<0.05,*P<0.05。
5.2.4、大鼠脑微血管内皮细胞ET-1mRNA、eeNOSmRNA、P-gpmRNA的表达。
实验结果见表14。
模型组ET-1mRNA表达积分显著高于假手术组,而eeNOSmRNA、P-gpmRNA表达积分均显著低于假手术组。药物治疗1周时ET-1mRNA表达积分明显低于模型组,2周时积分继续下降。药物治疗1周时eeNOSmRNA表达积分较模型组显著提高,2周时继续增高。药物治疗1周时P-gpmRNA表达积分与模型组比较未见明显变化,2周时则显著高于模型组。
表14:大鼠脑微血管内皮细胞ET-1mRNA、eeNOSmRNA、P-gpmRNA的表达(n=45,X±S)
注:ET-1mRNA阳性表达积分:与模型组比较*P<0.05,**P<0.05;与假手术组比较
#P<0.05,##P<0.05。eeNOSmRNA阳性表达积分:与模型组比较*P<0.05,**P<0.05;与假手术组比较#P<0.05,##P<0.05。P-gpmRNA阳性表达积分:与模型组比较*P<0.05,与假手术组比较#P<0.05。
实验表明本品对缺血性中风后遗症大鼠模型神经功能有显著改善作用,而激活下调脑区时其治疗缺血性中风后遗症的重要机制:(1)改善rCBF。治疗前模型组和给药组病灶对侧额叶皮质及同侧海马区较之假手术组均有明显的低灌注现象,提示存在功能抑制。特别时病灶对侧额叶皮质rCBF的降低,时脑梗死的远隔效应。用本品治疗后,低灌注现象均有显著改善,而模型组应用生理盐水后则位发生显著性变化,提示本品改善rCBF是其激活下调脑区的重要机制之一。(2)提高脑神经机能活动。下调脑区激活的外在表现是神经缺损症状的恢复,而其内在效应则是神经机能活动的提高。大鼠BWT测评表明,给药组经过本品治疗后大鼠四肢精细运动功能较之,模型组有显著恢复,说明中风病即使进入后遗症期神经功能仍然可以继续改善。(3)上调GAP-43、SYN表达。下调脑区机能活动与神经元、突触活性密切相关。GAP-43是代表神经生长和再生的特异性指标;SYN作为突出囊泡的结构成分,是反应突出活性和突出重建的分子标志物。本品可显著上调两者的表达,而对照组均为发现明显改变。(4)调节脑微血管内皮细胞功能。本实验以eeNOSmRNA、ET-1mRNA的表达反应脑血管内皮细胞合成NO和ET-1的能力,分别反映脑微血管内皮细胞功能和参与构成血脑屏障的ET-1mRNA、eeNOSmRNA、P-gpmRNA的变化进行了观察,发现本品能上调eeNOSmRNA、P-gpmRNA的表达,而降低ET-1mRNA的表达,表明本品在调节血管舒缩功能、改善脑微循环功能状态、增强血脑屏障保护以及保持大脑内环境的稳定性方面具有重要作用。
6、对脑缺血模型大鼠脑含水量及脑指数的影响
6.1、方法:
雄性大鼠60只随机分为6组,于实验前1天上、下午及实验当天术前1小时各灌胃给药1次。双侧颈总动脉结扎3小时后断头开颅取脑,用滤纸吸去脑表面的水分,称量湿重,然后置于干燥箱内110℃烘至恒重,称量干重。脑含水量(%)=(湿重—干重)/湿重×100%,实验数据以t检验方式进行统计。结果见表15。
6.2 实验结果显示:
本品能明显降低脑缺血模型大鼠的脑含水量及脑指数。上述缺血脑组织固定后,冠状切取大脑,常规脱水,石腊包埋制片,AE染色,光镜检验(×400)。镜下观察,假手术对照组脑组织神经细胞和血管周围腔隙不大,脑缺血模型组血管周围腔隙明显变大,神经细胞周围腔隙变化不十分明显。而本品中、高剂量组能明显抑制造模型所致血管周围腔隙扩大,说明本品对大鼠缺血性脑组织的病理变化有一定的保护作用。
表15:本品对急性不完全性脑缺血模型大鼠脑含水量及脑指数的影响
组别 | 剂量(mg/kg) | 鼠数(只) | 脑含水量(%) | 脑指数 |
假手术组模型组本品低剂量组本品中剂量组本品高剂量组脑心通对照组 | 3060120100 | 101010101010 | 69.33±1.98**75.48±1.7072.56±1.90**71.63±2.31**70.82±1.67**71.51±1.43* | 0.64±0.04**0.78±0.080.72±0.03**0.71±0.06**0.71±0.05**0.71±0.05* |
与模型组比较*P<0.05,**P<0.01
7、对大鼠脑缺血再灌注损伤的影响
7.1、方法:
取SD大鼠50只,平均分为5组.,给药组本品低(30mg/kg)、中(60mg/kg)、高(120mg/kg)剂量组,对照组灌服等容量生理盐水,假手术组除不结扎颈总动脉,其余处理同对照组。末次给药后1小时,大鼠乙醚麻醉行颈部正中手术,分离双侧颈总动脉,待动物清醒后,结扎双侧颈总动脉,30分钟后再恢复脑供血,24小时后,断头取脑备用。大鼠断头取脑,去除小脑和脑干,制成10%匀浆,按TBA比色法测定MDA含量,用邻苯三酚自氧化方法测定SOD活性,用光电比色法测定LDH活性,用Hartree法测定脑组织中蛋白质含量。实验数据以t检验方式进行统计。实验数据见表16。
7.2、实验结果说明:
大鼠全脑缺血30分钟再灌注24小时,对照组大鼠脑组织LDH,SOD活性明显降低,MDA含量明显升高,本品中、高剂量组能提高缺血再灌注大鼠脑组织的LDH、SOD活性,降低MDA含量。
表16:对大鼠脑缺血再灌注损伤的影响
组别 | LDH(U/mg蛋白) | SOD(umol/mg) | MDA(umol/mg) |
假手术组生理盐水组本品低剂量组本品中剂量组本品高剂量组 | 179±-22.9105±18.0*133±28.6**145±27.1##168±45.3# | 25.84±2.3513.14±1.24*20.01±2.21**18.99±2.25##15.34±2.21* | 1.86±0.245.42±0.81*4.69±0.50**3.58±0.27##2.85±0.26# |
与假手术组比较*P<0.01,**P<0.05;与对照组比较#P<0.01,##P<0.05。
8、对体内静脉血栓形成的影响。
8.1 方法:
大鼠50只随机分为5组,分别为模型组、高剂量组(120mg/kg)、中剂量组(60mg/kg)、低剂量组(30mg/kg)和阳性对照步长脑心通组(100mg/kg),每组10只。除模型组外,各组连续灌胃给药10天,于末次给药后2h,动物麻醉,腹部正中切开腹腔,剥离下腔静脉备用。在左肾静脉下方用粗线结扎下腔静脉,缝合腹腔,结扎4h后,处死大鼠,打开腹腔,在结扎下方2cm处夹闭管腔,取出瘀血段血管,剖开管腔,取出血栓,放在滤纸上,吸干血液,用分析天平称取血栓湿重(mg)实验数据的统计方法用方差分析。实验数据见表17。
8.2、实验结果:
与模型组比较,各治疗组大鼠静脉血栓湿重明显减轻(P<0.05,P<0.01);本品高、中剂量组血栓湿重均低于步长脑心通组(P<0.05),说明本品具有抑制大鼠体内血栓形成的作用。
表17:各组大鼠体内静脉血栓湿重
组别 | 剂量(mg/kg) | 动物数(n) | 血栓湿重 |
模型组高剂量组中剂量组低剂量组脑心通组 | —1206030100 | 1010101010 | 32.43±5.6124.80±9.32**#26.31±8.01*27.15±7.43*26.39±6.95* |
注:与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01;与脑心通组比较#P<0.05。
9、对大鼠体外血栓形成的影响
9.1、方法:
SD大鼠50只,随机分为5组,每组10只。本品高剂量组120mg/kg,本品中剂量组60mg/kg,本品低剂量组30mg/kg,步长脑心通组100mg/kg,空白对照组等容量生理盐水。各组大鼠均每日灌胃给药1次,连续7天,于末次给药后1小时,以10%乌拉坦1ml/100g麻醉,手术剥离颈总动脉,取血1.8ml,注入标好刻度线的血栓硅胶管中,套紧血栓管装入人体外血栓形成仪,启动转盘,计时,转动15min后,停机,取下血栓管,将管内血液及形成的血栓迅速倒在预先铺好滤纸的平皿中,在移放干燥滤纸上,用分规刻度尺测血栓长度,后提起血栓重新放在称量好的滤纸上,称其湿重后,置恒温烤箱60℃烘烤30min,分析天平称其干重,实验结果见表18。
9.2、实验结果表明:
本品高、中、低剂量组血栓长度显著短于生理盐水组,P<0.05;血栓干重t检验,本品高、中、低剂量组显著低于盐水组,P<0.05,表明本品高、中、低剂量组有抑制血栓形成的作用。
表18:本品对大鼠体外血栓形成的影响
组别 | 动物数(n) | 剂量(mg/kg) | 血栓长度(mm) | 血栓湿重(mg) | 血栓干重(mg) |
生理盐水组高剂量组中剂量组低剂量组脑心通组 | 1010101010 | —1206030100 | 1.96±0.321.72±0.25*1.60±0.48*1.51±0.49*1.58±0.52* | 88.60±13.3575.30±13.81*76.48±15.58*76.18±15.36*76.49±15.60* | 27.56±2.3024.89±2.34*24.60±2.34*24.49±3.08*24.34±4.01* |
注:各给药组与生理盐水组比较*P<0.05。
10、对小鼠凝血时间的影响
10.1、方法:
昆明种小鼠50只,体重18~22g,雌雄各半,随机分为5组,每组10只。本品低剂量组(60mg/kg)、中剂量组(120mg/kg)、高剂量组(240mg/kg),阳性对照脑心通组(200mg/kg),空白对照组给等量生理盐水。各组小鼠均每日灌胃给药1次,连续7天,末次给药后1小时,用毛细玻璃管将各鼠做眼眶内眦取血,测定方法如下:
玻片法:用毛细玻管将各鼠做眼眶内眦取血,迅速滴血于载玻片上,血滴直径约5~10mm,立即开始计时,此后每隔30s用干燥洁净针头挑动血液1次至针头能挑起纤维蛋白丝为止,即为凝血时间。
毛细玻管法:各组小鼠给药10min后,均用内径为1mm的玻璃毛细管插入小鼠内眦球后静脉丛取血,至毛细玻璃内血栓达5cm。每隔30s折断毛细玻管1小段,检查有无出现血凝丝。计算从毛细玻璃管采血到出现血凝丝的时间,即为凝血时间。实验结果见表19。
10.2、实验结果表明:
本品各剂量组与生理盐水组比较均能显著延长凝血时间,P<0.01,P<0.05。
表19:本品对小鼠凝血时间的影响
注:和对照组比较**P<0.01,*P<0.05。
11、对血小板聚集功能的影响
11.1方法:
取昆明小鼠50只,雌雄兼用,小鼠随机分成5组,为本品高、中、低剂量组,脑心通组即生理盐水组。给药剂量见表4。小鼠连续给药7天,每天灌胃给药1次。末次给药后40min,取抗凝血,离心分离出血小板血浆0.1ml,置于硅化处理载玻片上,血浆中放入铁心玻璃球1个,将载玻片放在加热磁力搅拌器上,37℃预热2min,启动搅拌器,以1000r/min转5min,取下载玻片,先肉眼观察血小板聚集个数,后置显微镜下观察血小板聚集个数。实验结果见表20。
11.2、实验结果:
表明本品高、中剂量组与生理盐水组比较,血小板聚集能力明显降低,P值<0.05。
表20:本品对小鼠血小板聚集功能的影响
组别 | 动物数(n) | 剂量(mg/kg) | 血小板聚集个数 | P值 |
高剂量组中剂量组低剂量组脑心通组生理盐水组 | 1010101010 | 240mg/kg120mg/kg60mg/kg200mg/kg- | 0.90±0.910.91±0.440.99±0.360.91±0.401.40±0.38 | <0.01<0.05>0.05<0.05 |
12、对断头小鼠喘息时间的影响。
12.1 方法:
小鼠50只随机分为5组,分别是生理盐水组、高剂量组、中剂量组、低剂量组和阳性对照脑心通组,每组10只,除生理盐水组外,各治疗组分别连续给药10天,末次给药后半小时,小鼠一次性断头,观察小鼠喘息次数及喘息持续时间。实验数据的统计方法用方差分析。实验数据见表21。
12.2、实验结果:
与生理盐水组比较,各治疗组小鼠断头喘息次数及持续时间明显增加(P<0.01),本品高剂量组断头喘息次数及持续时间明显长于步长脑心通组(P<0.05),说明本品可明显增加断头小鼠脑功能的维持时间。
表21:各组小鼠断头喘息次数及持续时间的比较
组别 | 剂量(g/kg) | 喘息次数 | 断头喘息持续时间 |
生理盐水组高剂量组中剂量组低剂量组脑心通组 | -240mg/kg120mg/kg60mg/kg200mg/kg | 11.21±2.9416.89±2.09*#15.23±2.89#14.98±3.01#15.23±2.96# | 19.01±3.7824.05±5.13*#21.84±2.38#20.75±2.19#21.83±2.40# |
注:与对照药脑心通组比较,*P<0.05;与生理盐水组比较,#P<0.01。
具体实施例
实施例1:淫羊藿提取物的制备方法:
称取40kg淫羊藿,加入0.01%碳酸钠50%乙醇约800L,回流2小时,然后过滤,滤渣继续用0.01%碳酸钠50%乙醇约800L,回流2小时,过滤,再重复一次,合并三次滤液。将滤液于65℃减压浓缩至相对密度约为1.15~1.20,趁热滤过,滤液用稀盐酸调pH至中性,通过预先处理过的HPD100大孔吸附树脂柱,依次用水、30%乙醇、60%乙醇洗脱,收集60%乙醇洗脱液,回收乙醇,于70℃减压浓缩至相对密度为1.30~1.35(60℃)的稠膏,真空干燥,粉碎,即得淫羊藿提取物。
实施例2:硬胶囊剂
处方(1000粒):
淫羊藿提取物 100g
微晶纤维素 150g
将淫羊藿提取物与微晶纤维素混合,过筛,使其混匀,加入适量的水或适宜浓度的乙醇制粒,干燥后,整粒,灌装胶囊。
实施例3 片剂
淫羊藿提取物 10~400mg/粒
羧甲基淀粉钠 4~12mg/粒
硬脂酸镁 0.1~0.3mg/粒
淀粉 50~600mg/粒
将淫羊藿总黄酮过筛,与羧甲基淀粉钠、乳糖混合,过筛,加入适量的水或适宜浓度的乙醇制粒,干燥后,整粒,加入适量的硬脂酸镁,用适当的冲压装置压片。可以通过改变活性成分与载体的比例或者通过改变压缩重量而制备成不同强度的片剂。
实施例4 颗粒剂
淫羊藿提取物 10~500mg/袋
糊精 2~10克
蔗糖 2~15克
矫味剂 适量
甜味剂 适量
将药用成份和蔗糖、糊精、矫味剂、甜味剂混合均匀,加入适量的水或适宜浓度的乙醇制粒,干燥后,整粒,分装。
实施例5 软胶囊剂
淫羊藿提取物 10~400mg/粒
稀释剂 300~450mg/粒
助悬剂 5~7.5mg/粒
乳化剂 5~7.5mg/粒
水 60~90mg/粒
每粒囊壳的组份和含量如下:
明胶 100~150毫克
甘油 30~50毫克
水 100~150毫克
防腐剂 适量
将明胶置于胶罐中,加入可溶解明胶量的纯化水,胶罐温度适宜,溶化后,加入甘油、防腐剂,搅拌均匀,抽真空脱气后保温静置;按比例将淫羊藿提取物与稀释剂、乳化剂、助悬剂混合均匀,将内容物和制备好的明胶置旋转压囊机,压制成软胶囊,定型、干燥即可。可以按照不同需要,改变内容物制备成不同规格的软胶囊。
实施例6 滴丸
淫羊藿提取物 2~100毫克/粒
基质 40~400毫克
冷凝液 甲基硅油(适量)
在淫羊藿提取物中加水制成均匀糊状,再加入熔融的基质液,加热熔融成澄清液体,倒入已预热的滴丸器中,控制滴制温度和滴速,滴入冷凝液中,成丸后吸干冷凝液,收集滴丸,置干燥器内即得。
实施例7 糖浆剂
淫羊藿提取物 20~500毫克
羟丙基甲基纤维素 适量
缓冲剂 适量
矫味剂 适量
防腐剂 适量
甜味剂 适量
着色剂 适量
纯化水 至 10~100毫升
将羟丙基甲基纤维素分散在热水中,冷却,然后与含有活性成分和制剂中其他成分的含水悬浮液混合。将所得溶液调制需要体积并混合均匀,灭菌后分装。
Claims (8)
1、一种淫羊藿提取物,它是以碱—醇—水溶液作为溶剂,从中提取得到的以淫羊藿苷、淫羊藿总黄酮为主要活性物质的提取物,该提取物是按以下方法制备而成的:
(1)将药材淫羊藿粗粉,以10~40倍量碱—乙醇—水溶液作为溶媒,回流提取2~3次,每次提取时间在1~2小时;
(2)过滤,弃去药渣,合并滤液,在50℃~70℃下减压浓缩至相对密度为1.0~1.5的浸膏;
(3)过滤,滤液中加稀酸调节pH值至中性;
(4)将调过pH值后的药液上HPD100大孔吸附树脂柱,用水洗脱至无色后,用5%~35%乙醇水溶液洗脱,弃去洗脱液;再用40%~80%乙醇水溶液洗脱,收集乙醇洗脱液;
(5)洗脱液在50℃~70℃下减压浓缩,浓缩至比重约为1.20~1.40,干燥即得。
2、权利要求1所述的淫羊藿提取物,其特征在于该提取物是优选以下方法制备而成:
(1)将药材淫羊藿粗粉,加入20倍量0.01%碳酸钠50%乙醇水溶液回流提取3次,每次提取时间2小时,合并三次滤液;
(2)滤液在65℃下减压浓缩至相对密度1.15~1.20;
(3)过滤,滤液用稀盐酸调pH至中性;
(4)上HPD100大孔树脂柱,用水洗脱至无色,再用30%乙醇洗脱后,用60%乙醇洗脱,收集60%乙醇洗脱液;
(5)洗脱液于70℃减压浓缩,浓缩至比重约为1.30~1.35,真空干燥即得。
3、权利要求1或2所述的淫羊藿提取物,其特征在于该提取物中淫羊藿总黄酮的含量在65%以上,淫羊藿苷的含量在20%以上。
4、一种权利要求1所述的淫羊藿提取物的用途,其特征在于在制备脑组织保护剂的药物中的应用。
5、根据权力要求5所述的淫羊藿提取物的用途,其特征在于特别是用于制备预防和治疗脑梗死、脑梗塞后遗症等缺血性脑血管疾病的药物中的应用。
6、一种含有淫羊藿提取物的中药制剂,其特征在于是由权利要求1所述的淫羊藿提取物和药剂学上可接受的药用辅料制备而成的任何一种可能的药物制剂。
7、权利要求7所述的中药制剂,其特征在于可以制备成口服制剂和注射用制剂。
8、权利要求8所述的中药制剂,其特征在于所述的口服制剂可以是硬胶囊剂、软胶囊剂、普通片剂、口腔崩解片、含片、分散片、缓释制剂、控释制剂、颗粒剂、水丸、滴丸、蜜丸等,且所述淫羊藿提取物中淫羊藿总黄酮的含量在65%以上,淫羊藿苷的含量在20%以上。
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