CN101744806B - 松属素外消旋体在制备治疗脑卒中药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药领域，公开了松属素的外消旋体、松属素的盐的外消旋体、松属素前体的外消旋体或松属素水合物的外消旋体在制备预防和治疗脑卒中药物中的用途，进一步的是松属素外消旋体用于预防和治疗急性缺血性脑卒中。

Description

松属素外消旋体在制备治疗脑卒中药物中的用途

技术领域

本发明涉及松属素外消旋体在制备预防和治疗脑卒中药物中的用途。

背景技术

(S)-松属素，化学名称(S)-2，3-二氢-5，7-二羟基-2-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮(英文化学名称为：(S)2，3-dihydro-5，7-dihydroxy-2-benyl-4H-1-benzopyran-4-one)，是一种不溶于水的二氢黄酮类化合物，见式II，是从蜂胶(propolis)中提取出的一种天然化合物。另外在瑞士五针松、桉树叶、阿拉伯树胶等很多植物的提取物中也发现了这种化合物。

自80年代起，国内外研究发现了(S)-松属素的多种药理活性，包括抗菌、抗病毒、抗氧化、抗炎等方面的作用。中国医学科学研究院首先发现(S)-松属素具有抑制多种因素所致的血管收缩的作用，对多种神经细胞的损伤也具有保护作用。具体见中国专利CN200410037860.9，在该申请中公开了用于治疗脑缺血、脑缺血后遗症、神经细胞损伤和功能改变的相关疾病的用途，机制主要是通过抑制Calpain、NO、CRP以及通过启动大脑内热休克蛋白的表达，发挥对脑缺血脑组织、神经细胞的保护作用，概括说就是(S)-松属素可用于治疗脑梗塞。同时，中国医学科学院药物研究所的刘睿等公开了通过大鼠体内、外脑缺血再灌注模型导致的脑组织缺血缺氧和细胞凋亡试验，发现(S)-松属素具有缺血再灌注及类似损伤中的神经保护作用(Pinocembrin protects rat brain against oxidation and apoptosis induced byischemia-reperfusion both in vivo and in vitro.Brain Res.2008Jun24；1216：104-15.)。

程永浩等公开了消旋松属素(结构见式I)的合成方法(程永浩，段亚波，戚燕等，5，7，-二羟基黄烷酮的合成，化学试剂.2006，28(7)：437)。

从现有技术可以得知，对映异构体和药效并无直接或者必然的关系，总体来说它们之间的关系存在以下几种情况：以外消旋体给药有利的光学异构体；对映体药理活性相等或相似；对映体无药理活性或者药理活性很低；对映体药理活性相反；对映体药理活性不同。下面举例详述：

1、对映体具有协同作用，外消旋体给药有利：

多巴酚丁胺(Dobutamine)的左旋体为α-受体激动剂，对β-受体激动作用较轻微，而右旋体为β-受体激动剂，对α-受体激动作用较轻微，消旋体给药后，能增加心肌收缩力，但不加快心率和升高血压；

氮异丙嗪(Isohipendyl)是一种抗组胺药，消旋体口服比(-)异构体强1.4倍，比(+)异构体高2.5倍，消旋体药效作用强的原因可能是一个对映体改善了另一个对映体的吸收，使得生物利用度提高，或者是一个对映体降低了另一个对映体的代谢速度，使得作用时间延长。

2、对映体具有等同的活性：

抗组胺药异丙嗪具有一个手性分子，其两种对映体药理作用相同且具有等同的活性强度，因其受体对药物的对映体没有选择性。

3、对映体活性强弱不同：

β受体阻断剂普萘洛尔，其阻断作用主要依赖于左旋体，因为它具有与β受体激动剂相同的构型，可以选择与β受体结合，而右旋体作用很弱。

抗高血压药L-甲基多巴具有活性，而D-型则没有活性，这是对映体活性强弱不同的极端的例子。

4、对映体具有相反药理活性：

硝苯吡啶结构类似物Bay k8644，其右旋体为钙拮抗剂，而其左旋体却是钙激动剂，二者的药理活性完全不同。

5、对映体具有不同的药理活性：

丙氧芬的右旋体具有强烈的镇痛活性，是左旋体的6倍，几乎没有镇咳作用，而丙氧芬的左旋体却具有强烈的镇咳作用。(《药物化学》，仉文升，李安良主编，高等教育出版社：25-26).

从上述例子可以进一步知道，由已知的(S)-松属素的药理活性，无法判断松属素外消旋体、(R)-松属素是否具有与(S)-松属素相同的药理药效，需要发明人进行进一步的试验。通过检索现有技术，发现了以下几篇文献：

竺晓鸣等揭示了松属素可以扩张胸主动脉的血管，机制包括内皮依赖及非内皮依赖两种。(Zhu XM，Fang LH，Li YJ，Du GH.Endothelium-dependent and Endothelium-independent relaxation induced by pinocembrin inrat aortic rings.Vascul Pharmacol.2007；46(3)：160)。

高梅等揭示了松属素能够改善谷氨酸所导致的细胞形态学及凋亡形态学损伤，降低细胞凋亡率，为其抗脑缺血的作用提供了神经细胞保护方面的证据。(Mei Gao，Wen-cui Zhang，Qing-shan Liu，Juan-juan Hu，Geng-taoLiu，Guan-hua Du.Pinocembrin prevents glutamate-induced apoptosis in SH-SY5Y neuronal cells via bax/bcl-2ratio decrease.Eur J Pharmacol.2008，591(1-3)：73-9.)

高梅等公开了松属素对永久性脑缺血鼠的神经血管保护作用(Acuteneurovascular unit protective action of pinocembrin against permanent cerebralischemia in rats.J Asian Nat Prod Res.2008May-Jun；10(5-6)：551-8.)这是首次证实松属素对永久性局灶性脑缺血具有明显的神经血管保护作用，其机制尚在研究中。

光红梅等通过双侧颈动脉结扎获得脑供血不足模型，采用Morris watermaze试验对其认知功能进行检测。发现松属素可以改善脑供血不足导致的鼠认知功能障碍，而其机制是由于松属素可以保护脑线粒体的结构和功能。(Protections of pinocembrin on brain mitochondria contribute to cognitiveimprovement in chronic cerebral hypoperfused rats.Eur J Pharmacol.2006 Aug7；542(1-3)：77-83.)。

以上文献不同程度公开了消旋松属素的药理作用，但是仅限于血管扩张作用和对神经血管的保护作用。

现有技术教导：急性缺血性脑卒中发病率、死亡率、致残率均较高，溶栓治疗是其最为有效的方法，溶栓越早，治疗效果越好。临床的多年经验表明，脑卒中抢救需要争分夺秒。脑动脉一旦闭塞，缺血区域的脑细胞快速发生电化学链式瀑布样反应，大量氧自由基产生、钙离子内流，使细胞内钙超载，导致脑组织不可逆损伤。因此，应尽量缩短发病到抢救的时间。

缺血性脑卒中在临床上分为超早期，为发病的6小时内；早期，发病的6-72小时；急性后期，发病的72小时-1周内；恢复期，发病的1周后。在缺血性脑卒中的超早期，发病时间段，未形成脑梗死，若及时恢复正常供血，清除缺血组织内有害代谢产物，病人可能得到完全恢复，是缺血性脑卒中治疗的最理想时机，会收到较好的效果。而到了缺血性脑卒中的早期，由于持续性缺血缺氧，特别是血脑屏障的破坏，趋向形成“中心梗死区”，本期应用溶栓的效果与超早期相比，已经失去了相当的治疗价值。

重组组织型纤溶酶原激活剂(tPA)于1996年通过FDA临床验证，被批准在急性缺血性脑卒中发病后3h内使用，这是迄今为止唯一一种被证明能够治疗缺血性脑卒中的药物，由于治疗时间窗的限制，在国外有95％的急性脑卒中患者由于治疗时间窗的问题得不到及时溶栓治疗，我国能够得到溶栓治疗的患者不足1％。

近十几年来，神经保护剂的研究是脑卒中治疗的研究热点，但在全世界114项卒中试验(涉及多达49种神经保护剂)中，却极少有试验证明其有效性，也就是说目前还没有一种神经保护剂被证明对于治疗急性缺血性脑卒中是有效和安全的。

由上述分析可知，目前临床上除tPA外，尚缺乏有效治疗脑卒中的药物，并且，即使是tPA，因其治疗时间窗仅有3h而使其应用受到很大限制。

发明内容

本发明通过试验研究，意外的发现：松属素外消旋体可以用于治疗脑卒中，并且与(S)-松属素相比，在脑卒中发生后的更长时间内仍然可以起到治疗作用，即具有更宽的治疗时间窗(约为6h)。治疗窗的扩大，为缺血性脑卒中患者争取到了更多的获得救治的机会。动物试验表明松属素外消旋体对于脑卒中具有显著的治疗作用。

本发明的发明目的是提供松属素的外消旋体、松属素的盐的外消旋体、松属素前体的外消旋体或松属素水合物的外消旋体用于制备治疗脑卒中药物中的用途。

术语外消旋体是指一种具有旋光性的手性分子与其对映体的等摩尔混合物。它由旋光方向相反、旋光能力相同的分子等量混合而成，其旋光性因这些分子间的作用而相互抵消。

所述松属素的盐是指松属素的可药用盐，例如盐酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐等。

所述松属素的前体是指松属素的前体药物，即经过生物体内转化后才转变成松属素并发挥药理作用的化合物。

优选地，所述脑卒中为急性缺血型脑卒中。

通过试验发现：

1)松属素外消旋体可以治疗脑卒中；

2)松属素外消旋体可以改善急性缺血性脑卒中引起的行为学改变；

3)松属素外消旋体可以改善急性缺血性脑卒中引起的脑血流下降；

4)松属素外消旋体可以减少急性缺血性脑卒中引起的脑梗塞体积；

5)松属素外消旋体可以改善急性缺血性脑卒中引起的脑水肿；

6)松属素外消旋体可以改善急性缺血性脑卒中引起能量代谢；

7)松属素外消旋体可以改善急性缺血性脑卒中引起急性炎症；

8)松属素外消旋体可以保护急性缺血性脑卒中的神经细胞损害。

本发明因此还涉及松属素外消旋体的药物组合物，该组合物由松属素的外消旋体、松属素的盐的外消旋体、松属素前体的外消旋体或松属素水合物的外消旋体与药学上可接受的辅料组成。

本发明的组合物可以通过口服、透皮、肌肉、静脉、粘膜等用药途径。

本发明的组合物可以是固体、液体制剂，该剂型可以通过常规制备方法制备。

本发明的组合物是液体制剂，优选注射剂。注射剂是由环糊精或环糊精衍生物包合松属素外消旋体，然后添加适当的辅料制备而成。

本发明的目的还在于提供(R)-松属素或其盐、前体、水合物用于制备预防和治疗脑卒中疾病药物中的用途，其中脑卒中为缺血性脑卒中或出血性脑卒中。

本发明的松属素外消旋体具有毒性小的优点，可以应用于急性缺血性脑卒中的治疗。

附图说明

图1示松属素外消旋体对脑梗塞体积的影响；

图2示松属素外消旋体对MCAO后24h缺血脑组织中TNF-α、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1、iNOS及AQP-4表达的影响；

A图示DL0108对TNF-α、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1、iNOS及AQP-4表达的影响；

B图示以β-actin为内参进行蛋白定量，对TNF-α、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1、iNOS、AQP-4的表达进行量化的统计图。

图3为皮层CA1区及海马尼氏染色图(200×)；

A：假手术组；B：模型组；C：尼莫地平3mg/kg；

D：DL0108(松属素外消旋体)1mg/kg；

E：DL0108(松属素外消旋体)3mg/kg；F：DL0108(松属素外消旋体)10mg/kg。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的具体说明。

实施例一、对卒中倾向型自发性高血压大鼠(SHRSP)脑卒中的预防与治疗作用

1、试验药物：注射用松属素外消旋体、注射用(R)-松属素和注射用(S)-松属素，由中国医学科学院药物所新药开发室提供，(批号20050601，含量2.36％)，采用200810084682.3公开的方法即环糊精或者环糊精衍生物包合消旋和异构体松属素制备而成，用时溶解于生理盐水；阳性药物尼莫地平注射剂购于Bayer公司(德国)。

2、试验动物及分组：

试验动物：6周龄SHRSP大鼠110只和正常的Wistar大鼠10值。

试验分组：分为正常组即Wistar大鼠组，SHRSP大鼠随机分为模型组、尼莫地平组、松属素外消旋体低、中、高剂量组(剂量分别为3、10、30mg/kg/d)、(R)-松属素低、中、高剂量组(剂量与外消旋体相同)、(S)-松属素低、中、高剂量组(剂量与外消旋体相同)。

3、试验方法：除正常组之外，所有SHRSP大鼠每日饮1％的氯化钠盐水，尼莫地平组(3mg/kg/d)、松属素外消旋体低、中、高剂量组(剂量分别为3、10、30mg/kg/d)、(R)-松属素低、中、高剂量组(剂量与外消旋体相同)、(S)-松属素低、中、高剂量组(剂量与外消旋体相同)分别按照各组的剂量给药，模型组给予同等剂量的生理盐水，至脑卒中发生后14天止。

4、脑卒中发作标准：

①单肢或前双肢或全身抽动；②出现偏瘫或全身瘫痪，腹部贴地，不能站立；③较重者全身细小震颤，最后爬伏，软瘫，甚至死亡。以上各项中有些动物伴有激惹现象(跳或蹿)，凡出现以上一项症状者，评定为脑卒中发作，记录每只动物脑卒中发作时间。

5、标本采集

1)最后一次给药后，大鼠禁食6小时，采用摘眼球取血法收集血液标本。断头后于冰盘上剥取全脑组织。

2)将3ml血液迅速滴入装有0.074％肝素钠溶液1ml的试管内混匀。按照规则操作血液流变检测仪进行全血粘度、血浆比粘度、红细胞聚集指数、红细胞变形指数的检测。

3)将2ml血液迅速滴入装有0.13mol/L枸橼酸钠溶液0.2ml的试管内混匀。1000rpm离心10min，按操作规则，用血小板聚集仪测定血小板聚集率。

4)将1ml血液迅速滴入装有0.109mol/L构椽酸钠溶液0.1ml的试管内混匀。3000rpm离心15min，取上清液应用酶联免疫检测血浆纤维蛋白原含量。

5)将2ml血液迅速滴入含7.5％EDTA-Na₂30ul和抑肽酶40ul的试管中，混匀后3000rpm离心5min，取上清液应用同位素放免法测定血浆ET-1含量。

6)所取全脑组织用电子天平逐一称重，随后放入真空干燥箱中烘烤，温度控制在110±5℃，持续48h后再次称重。

6、观测指标

1)造模后各组动物机体状态观察：包括机体外观、精神状态、反应能力、运动姿势、自发活动量、进食进水量、体重等方面。

脑卒中发作后神经症状评分标准：

级别症状

0正常

1少动或轻度激惹

2一侧前肢或头抽动，钻笼角不动或激惹性亢奋(表现为跳蹿)

3单侧前、后肢或单侧前肢瘫痪，身体歪斜，行走困难

4腹部贴地不能站立，四肢瘫痪，全身细小震颤

自卒中发作后，记录每只动物14天的分数值，然后给药各组与对照组比较。

2)血液流变学：包括全血粘度、血浆比粘度、红细胞聚集指数、红细胞变形指数、血小板聚集率。

3)血浆纤维蛋白原含量

4)血浆ET-1含量

5)脑组织水含量：根据全脑组织进入真空干燥箱前后称重的结果，分别代入公式：脑组织水含量＝(湿重-干重)/湿重×100％，进行计算。

6、统计方法：结果以x±SD表示，各组间数据比较采用单因素方差分析(one-way analysis of variance，ANOVA)

7、试验结果：

1)大鼠死亡情况：

试验过程共有24只大鼠死亡，经过病理解剖分析，发现：4只死于出血性脑卒中，剩余20只为缺血性脑卒中死亡，具体见表1。

表1：大鼠死亡情况及分析表

与模型组相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01

2)大鼠的精神状态

正常组机体状况、进食、活动等均正常。

自第4周开始，除松属素外消旋体高、中剂量组和尼莫地平组外，其他各组不断出现脑卒中大鼠。表现为激惹、阵发性抽搐、瘫痪、头大、进食少、尿失禁、竖毛、消瘦等症状。根据上述脑卒中发作后神经症状评分标准，松属素外消旋体高、中剂量组自脑卒中发作之日起，分数明显下降，在发作后2-14天内一直稳定在1.6分和2.3分以下，说明有显著地改善神经功能的作用。松属素外消旋体低剂量组和(R)-松属素高剂量组不仅脑卒中发作后前几天的分数较高，而且14天内一直维持在2.5分以上，提示无改善作用。尼莫地平组自脑卒中发作后，分数较低，6天后一直稳定在2.2分以下。

3)血液流变学检测分析

表2：血液流变学指标变化(x±s)

与正常组相比，^#P＜0.05，^##＜0.01；与模型组相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01

结果表明：与正常组比较，模型组在血液流变学各指标中均呈现极显著性差异(P＜0.01)，说明该模型血液呈高粘性、高聚状态。与模型组比较，松属素外消旋体高、中、低剂量组和(R)-松属素高剂量组均能不同程度的降低血液凝聚状态(P＜0.01，P＜0.05)，尤其表现在松属素外消旋体的低全血粘度、红细胞聚集指数方面(P＜0.01)，(S)-松属素则完全没有效果。尼莫地平具有降低血液粘稠的效果。具体见表3。

说明：松属素外消旋体剂量依赖性的降低血液粘稠度，高剂量的(R)-松属素具有类似效果。

4)血小板凝聚

表3中的抗血小板凝聚提示，模型组大鼠血小板聚集率较正常组高

(P＜0.01)。与模型组比较，松属素外消旋体高、中剂量组和(R)-松属素高剂量组能明显降低血小板聚集率(P＜0.01，P＜0.05)，(S)-松属素则没有效果。

说明：松属素外消旋体能够剂量依赖性的抗血小板聚集，高剂量的(R)-松属素也有效果。

5)血浆纤维蛋白原含量测定分析

模型组的血浆纤维蛋白原含量较正常组有显著升高(P＜0.01)，与模型组相比，松属素外消旋体高、中、低剂量组和(R)-松属素高剂量组能够明显降低血浆中纤维蛋白原含量，从而改变血液高凝状态(P＜0.01)，(S)-松属素没有效果。具体结果见表3。

表3：血小板聚集变化，血浆纤维蛋白原含量、ET-1含量、脑组织水含量

与正常组比较，^#P＜0.05，^##P＜0.01；与模型组相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01

6)血浆ET-1

如表3所示：模型组大鼠血浆ET-1急剧升高，与正常组比较有显著性差异(P＜0.01)。与模型组相比，松属素外消旋体高剂量组和(R)-松属素高剂量组的ET-1均降低(P分别小于0.01和0.05)，其他剂量和(S)-松属素高、中、低剂量组则没有效果。

7)脑组织水肿含量测定分析

如表3所示：模型组大鼠脑组织水含量明显升高，与正常组比较有显著性差异(P＜0.05)。与模型组相比，松属素外消旋体高剂量组大鼠脑组织中的含水量明显降低(P＜0.05)，其他各组均没有显著效果。

8、结论：

与模型组相比，松属素外消旋体剂量依赖性的延缓脑卒中发作的时间(P＜0.01)，松属素外消旋体的低剂量组和(R)-松属素的高剂量也延缓了脑卒中的发作时间(P＜0.05)，尼莫地平可以延缓脑卒中的发作(P＜0.01)，表明松属素有预防脑卒中发作的作用，且外消旋体的作用大于(R)-松属素，(S)-松属素高、中、低剂量组无作用。具体结果见表1。

松属素外消旋体可剂量依赖性的显著增加脑卒中发作后的存活率，表明其对卒中易发性高血压大鼠的脑卒中有治疗作用。

(R)-松属素只在高剂量时有此作用，其作用与尼莫地平相似，说明松属素外消旋体的作用强于(R)-松属素，而(S)-松属素作用不明显。提示：1)松属素外消旋体对脑卒中有预防和治疗作用；2)(R)-松属素对脑卒中亦有预防和治疗作用，效果较差；3)消旋松属素的治疗作用优于(R)-松属素可能是由于没有作用的(S)-松属素促进(R)-松属素的治疗效果。

实施例二、对大脑中动脉栓塞引起的急性缺血性脑卒中的影响

受试物：注射用松属素，由中国医学科学院药物所新药开发室提供，

(批号20050601，含量2.36％)，采用200810084682.3公开的方法即环糊精或者环糊精衍生物包合松属素外消旋体制备而成，用时溶解于生理盐水；阳性药物尼莫地平注射剂购于Bayer公司(德国)。

试验动物：雄性SD大鼠，体重250-280克，100只，购自中国医学科学院试验动物所。随机将大鼠分为：假手术组、模型组、松属素给药组、尼莫地平给药组(3mg/kg)。

试验模型：采用大脑中动脉栓塞(MCAO)制备急性缺血性脑卒中模型

参照Zea Longa等建立的大鼠大脑中动脉内栓线阻断方法，作适当改进。10％水合氯醛溶液400mg/kg，腹腔注射。分离颈外动脉，在颈外动脉(ECA)发出约0.8cm处结扎。于颈总动脉近心端夹一动脉夹，在ECA结扎处与分叉处之间做一直径约2mm的“V”形切口，将尼龙线自切口处轻轻插入CCA，松开动脉夹，经颈内、颈外动脉分叉部进入颈内动脉，将尼龙线缓慢地向颈内动脉(ICA)入颅内的方向推进，插入深度约18.5±0.5mm至微感阻力，使尼龙线头端通过大脑中动脉(MCA)起始处，到达较细的大脑前动脉，结扎ICA，缝合，尼龙线残端留1cm于皮外。

假手术组只进行术前麻醉和血管分离术，不结扎及导入线栓。

数据统计方法：结果以x±SD表示，各组间数据比较采用单因素方差分析(one-way analysis of variance，ANOVA)。

检测指标及结果：

1.神经行为学检查(Bederson’s评分)

动物于处死前进行神经行为学观察，提鼠尾离开地面约1尺，观察两前肢状况；将大鼠置于水平地面，推动其双肩，观察两侧抵抗力有无差异；大鼠置于地面，观察其行走情况。采用四级评分法(0-5分)，分数越高，说明其神经行为损伤越严重。

Bederson’s评分标准：

(1)行为完全正常者，记0分；

(2)提起鼠尾离开地面，手术对侧前肢内旋、内收者，记1分；

(3)大鼠至地面，用手挤压两侧检查其抗力，手术对侧抗力下降者，记2分；

(4)大鼠至地面，观察其行走，围绕手术对侧转圈者，记3分；

(5)损伤极其严重，已无法自主活动者，记4分。

结果见表4：假手术组动物行为学评分为0分。模型组动物神经学评分平均值为3.4±0.6分，其中，多数动物表现为手术对侧前肢内旋或内收，侧向挤压对侧肌伸力量减弱，转圈或偶尔转圈行走，评为3分；另外少数动物仅出现前肢内旋和抗力下降，评为2分；个别动物症状较重，缺乏自主活动，评为4分。

松属素外消旋体组(3mg/kg、10mg/kg、30mg/kg)能显著改善动物脑缺血后的神经损伤症状(P＜0.05，P＜0.01)，并呈现剂量-效应关系。

表4：松属素外消旋体对神经症状评分(Bederson’s value)及脑梗塞体积的影响。(x±s，n＝10)

与假手术组相比，^##＜0.01；与模型组相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01。

2、脑梗死体积的测定：

评分后大鼠断头处死，迅速将取出的脑组织置于-20℃冰箱，10min后置室温环境，切除嗅球、小脑和低位脑干后按间隔2mm冠状切四刀，切成5个大脑连续冠状粗切片。第一刀在脑前极与视交叉连线中点处；第二刀在视交叉处；第三刀在漏斗柄部位；第四刀在漏斗柄与厚叶尾核之间，然后迅速将脑片置于5ml含4％TTC及1mol·L^-1K₂HPO₄0.1ml的溶液中，37℃恒温、避光孵育30min，期间每隔5min将脑片翻动一次。经TTC染色后，正常组织呈玫瑰红色，梗死组织未被染色而呈白色。将每组脑片排列整齐，拍照保存，应用图像分析系统软件处理并作统计，计算每张脑片的梗塞面积，乘以每片脑片的厚度2mm，每只动物所有脑片梗塞面积乘以厚度相加，即为脑梗塞体积。梗塞体积以所占大脑半球的百分率来表示，以消除脑水肿的影响。

脑梗塞体积(％)＝(手术对侧半球的体积-手术侧半球未梗塞部分的体积)/手术对侧半球的体积×100％

结果：大鼠脑组织缺血损伤后，假手术组无脑梗塞出现，模型组的脑梗塞体积为(33.6±4.3)％(P＜0.01)。与模型组相比，松属素外消旋体(3、10、30mg/kg)显著缩小脑梗塞体积(P＜0.01)，脑梗塞的体积分别为(23.1±3.4)％、(21.4±2.1)％、(14.6±1.1)％，尼莫地平组脑梗塞体积为(16.7±1.3)％，与模型组相比具有显著性差异(P＜0.01)。见表4和图1。

结果表明，松属素外消旋体能够减少缺血性脑卒中导致的脑梗塞面积。

3.局部脑血流量测定

大鼠俯卧位固定于立体定位仪上，开颅窗并清理手术视野，以前囟为坐标原点，选取前囟后2mm、右侧3mm为测定点，周围直径约2-3mm区域用牙科钻打薄，保持硬脑膜的完整并避开较大的血管，定位并固定好探头座。

动物仰卧位于手术台上，进行MCAO手术，当线插入ICA后先不插入颅内，稳定LDF读数后，记录10min内血流值，以其平均值作为脑血流的基础值(baseline value)。完成MCAO手术，把线插入颅内，当血流值突然下降至基础值的20％-30％时，提示中脑动脉血流已被阻断。每组MCAO前的血流值为本组的基础值(100％)，手术后血流值均以此基础值的百分率表示。动物于处死前在同一位置测定LDF值。

大鼠脑组织缺血30min后，模型组rCBF值为基础值的31.09±5.35％，化合物松属素(3、10、30mg/kg)给药组、尼莫地平(3mg/kg)组rCBF值分别为基础值的(40.76±6.58)％、(50.09±7.09)％、(53.28±8.03)％和(55.58±6.09)％，可见给药各组均可快速恢复脑血流，较模型组均有明显提高，其中松属素(10、30mg/kg)给药组、尼莫地平(3mg/kg)组与模型组相比具有显著性差异(P＜0.05)。随着缺血时间的延长，由于侧枝循环的逐步代偿，这种局部脑血流升高的幅度减小，但仍然保持高于模型组的水平。

表5：松属素外消旋体对缺血局部脑血流(rCBF)的影响。(x±sd，n＝10)

与假手术组比较，^##＜0.01，与模型组比较，^*P＜0.05

4、脑水肿及脑组织中伊文氏兰(EB)/荧光素钠(NF)含量的测定

动物手术后即刻(给药组于给药后即刻)尾静脉注射EB/NF混合液0.25ml(0.5％，溶于生理盐水)。24h后，用生理盐水对大鼠进行心脏灌流，以除去未结合的染料，断头处死，迅速取脑，分成缺血半球和非缺血半球，分别称重后，以7.5％(w/v)三氯乙酸(TCA)匀浆。匀浆液分成2份，其中1ml匀浆液以52μl 5N NaOH调pH值至中性，取200μl于微孔板测定荧光强度(excitation 485nm，emission 535nm)，以NF系列浓度溶液制作标准曲线，进行NF定量。另一份匀浆液于12000g，4℃，离心20min，取200μl上清液于微孔板中，于620nm处测定吸光度，以EB系列浓度溶液制作标准曲线，进行EB定量。结果以μgEB或NF/g脑湿重表示。脑水肿百分比以(缺血半球脑重-非缺血半球脑重)/非缺血半球脑重×100％表示。

如表6所示，模型组水肿比例为(8.3±1.9)％，而松属素(3mg/kg、10mg/kg、30mg/kg，iv)的水肿比例分别为(5.5±1.7)％，(4.1±1.5)％，(3.2±2.1)％，与模型组相比均有显著差异(p＜0.05，p＜0.01)。松属素(3mg/kg、10mg/kg、30mg/kg，iv)也同样显著减少了EB/NF的组织渗漏。这一结果表明，松属素能够减轻缺血性脑卒中导致的组织水肿。

表6：松属素外消旋体对MCAO大鼠脑水肿及EB/NF漏出量的影响。

(x±sd，n＝6)

与模型组相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01。

5.大鼠脑缺血组织能量代谢指标的检测

结果见表7，脑组织缺血24h后，模型组能量指数下降为手术前的42.6％(P＜0.05)，与模型组相比，松属素外消旋体(3、10、30mg/kg)剂量组能量指数明显提高，分别比模型组组提高了34.6％和45.8％(P＜0.05)，呈现剂量依赖性。

回收试验和重复性试验结果表明ATP、ADP和AMP进样量与峰面积呈良好的线性关系，所得r值分别为r_ATP＝0.9897，r_ADP＝0.9896，r_AMP＝0.9893，r_CrP＝0.9981。四种标准物质回收率分别为：(86.6±5.6)％，(94.45±7.5)％，(83.4±6.1)％，(78.69±7.3)％。

表7：松属素外消旋体对MCAO后脑缺血组织能量代谢指标的影响。

(x±s，n＝10)

与假手术组比，^#P＜0.05，与模型组比，^*P＜0.05。

6、松属素对脑缺血急性期炎症的作用(缺血后24h)

6.1血清中NO及TNF-α的含量

如表8所示，模型组大鼠血清中NO及TNF-α的含量显著增加，松属素外消旋体3、10、30mg/kg给药组对缺血24h的大鼠血清中NO及TNF-α的含量有明显的降低作用(P＜0.05，P＜0.01)。

表8松属素外消旋体对MCAO大鼠血清NO及TNF-α的影响

(x±sd，n＝8)

与正常组相比，^#P＜0.05，^##P＜0.01；与模型组相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01。

6.2松属素对缺血组织中细胞因子TNF-α、IL-1β表达的影响

由图2可以看出，脑缺血24h后，组织中细胞因子TNF-α、IL-1β表达显著增加，松属素3、10、30mg/kg于缺血后早期给药对于ICAM-1、VCAM-1的表达均有不同程度的抑制作用。

6.3松属素对缺血组织中粘附分子ICAM-1、VCAM-1表达的影响

由图2可以看出，脑缺血24h后，组织中粘附分子ICAM-1、VCAM-1蛋白表达显著增加，松属素3、10、30mg/kg于缺血后早期给药对于ICAM-1、VCAM-1的表达均有不同程度的抑制作用。

6.4松属素对iNOS和AQP-4蛋白表达的影响

由图2可以看出，脑缺血24h后，组织中iNOS和AQP-4蛋白表达显著增加，而松属素3、10、30mg/kg于缺血后早期给药对于iNOS和AQP-4蛋白的表达有不同程度的抑制作用。

以β-actin为内标，对TNF-α、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1、iNOS、AQP-4的表达进行量化，可以直观地看出松属素外消旋体对以上几种蛋白表达的抑制作用。松属素10、30mg/kg给药表现出较好的作用。

以上结果表明：松属素外消旋体可以减轻急性缺血性脑卒中引起的急性炎症。

7.大鼠脑缺血组织神经元形态观察结果

大鼠脑缺血24h后，10％的水合氯醛溶液腹腔注射麻醉。经心脏灌注肝素化生理盐水10min，4％多聚甲醛350ml持续灌注30min，小心取出脑组织，置于4％多聚甲醛固定，冰冻切片机连续冠状切片(6μm)，每20片取一片进行HE染色，在多聚赖氨酸处理的载玻片上展开，-40℃冰箱中保存待用。

尼氏(Nissel)染色：(1)冰冻切片从-40℃冰箱中取出，室温放置晾干；(2)放入丙酮中固定30min，PBS冲洗，3min×3次；(3)甲苯胺蓝染料中浸染20-30min，水洗15min；(4)梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片；(5)光镜下观察、照相、分析；(6)每只大鼠取位置大致相同的4张脑片，每张脑片在200倍光镜下随机测海马区各5个视野(共20个视野/只)，计视野内细胞数与假手术组相比，取所得比值的平均值，进行统计学分析。

结果见图3：海马是大脑对缺血敏感的部位，尼氏染色结果显示，脑组织缺血损伤后，海马区神经细胞受损严重，出现明显细胞缺失，神经细胞排列松散，定量结果显示，神经细胞比假手术组减少了79.5±9.7％，差异具有显著性(P＜0.01)；松属素(3mg/kg，10mg/kg，30mg/kg)能够改善缺血神经细胞形态，减少神经细胞的丢失，细胞数量分别比模型组提高了11.5±8.9％，36.8±4.9％及51.7±6.6％，与模型组相比具有显著性差异(P＜0.05)，并且呈现其剂量依赖性，提示其对急性脑缺血损害后具有神经保护作用。

总结：

1)松属素外消旋体可以改善缺血性脑卒中引起的行为学改变；

2)松属素外消旋体可以改善缺血性脑卒中引起的脑血流下降；

3)松属素外消旋体可以减少缺血性脑卒中引起的脑梗塞面积；

4)松属素外消旋体可以改善缺血性脑卒中引起的脑水肿；

5)松属素外消旋体可以改善缺血性脑卒中引起的能量代谢障碍；

6)松属素外消旋体可以减轻缺血性脑卒中引起的急性炎症；

7)松属素外消旋体可以改善缺血性脑卒中引起的神经细胞损伤。

实施例三、急性毒性研究结果及评价

试验结果表明，SD大鼠单次静脉注射松属素外消旋体毒性反应的LD50值为490.9(367.6-746.7)mg/kg，(S)-松属素毒性反应的LD50值为375.3(271.2-538.5)mg/kg，(R)-松属素毒性反应的LD50值为347.8(257.4-466.3)mg/kg。由上可知，松属素外消旋体具有较大的安全用药范围。所有药物对动物体重无明显影响，主要毒性表现有四肢瘫痪、肝脏与肺脏轻度淤血。

实施例四、松属素对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的治疗时间窗研究

1.本试验采用短暂性大鼠大脑中动脉栓塞(tMCAO)模型，在实施MCAO局灶性缺血后2h进行再灌注，考察松属素在急性脑缺血后的治疗时间窗。于再灌注后1h、4h、6h(即缺血后3h、6h、8h)给予松属素外消旋体(1mg/kg，5mg/kg，静脉注射)，再灌注后1h、4h(即缺血后3h、6h)给予(R)、(S)-松属素(1mg/kg，5mg/kg，静脉注射)，通过考察药物对大鼠tMCAO后24h的神经症状学评分、脑梗塞体积及脑含水量的的影响，评价了药物对大鼠急性脑缺血的治疗时间窗。

2.材料与方法

2.1试验动物

雄性SD大鼠240-280g，100只，购自北京维通利华试验动物技术有限公司。合格证号：SCXK(京)2007-0001。手术前、后常规饲养，室温保持23-25℃，自由进食、进水。

2.2药品与试剂

注射用松属素外消旋体、注射用(R)、(S)-松属素，由中国医学科学院药物所新药开发室提供，(批号20050601，含量2.36％)，采用200810084682.3公开的方法即环糊精或者环糊精衍生物包合消旋和异构体松属素制备而成，用时溶解于生理盐水；阳性药物尼莫地平注射剂购于Bayer公司(德国)；羟丙基β环糊精由中国医学科学院药物所新药开发室提供。TTC：购自sigma公司，其它试剂为市售分析纯。

2.3大脑中动脉栓塞(tMCAO)模型的制备

大鼠麻醉：10％水合氯醛溶液400mg/kg，腹腔注射，至翻正反射消失。

大鼠仰卧位固定，颈部正中切开皮肤，钝性分离各层组织，暴露右侧颈总动脉(CCA)。分离CCA至颈内动脉(ICA)和颈外动脉(ECA)分叉后一段，仔细分离避免损伤迷走神经和气管，分别于颈总动脉和颈外动脉下置线备用。

用动脉夹夹闭颈总动脉和颈内动脉，于颈外动脉远端间隔2-3毫米结扎2条0号手术线，于两结扎线中间剪断血管。将颈外动脉游离端拉至与颈内动脉成一条直线，并在颈外动脉处剪口，插入尼龙线，由颈外动脉一直插入颈内动脉，打开颈内动脉处动脉夹，将尼龙线插入颈内动脉，继续插入至颅内，插入深度约18.5±0.5mm至微感阻力，使尼龙线头端通过MCA起始处，到达较细的大脑前动脉，此时即实现右侧大脑中动脉的血流阻塞。栓塞过程中动物保持麻醉状态，栓塞2h后缓慢拔出栓线至颈外动脉残段实现再灌注。手术过程中，用普通台灯(100w)照射，以保持动物体温。室温保持在23-25℃。

假手术组只进行术前麻醉和血管分离术，不结扎不导入线栓。

2.4试验分组及给药

假手术组(缺血3h静脉注射生理盐水)

模型组(缺血3h静脉注射辅料羟丙基β-环糊精50mg/kg)

尼莫地平组(1mg/kg，缺血3h给药)

松属素外消旋体组(1mg/kg，5mg/kg，缺血3、6、8h给药)

(R)-松属素组(1mg/kg，5mg/kg，缺血3、6h给药)

(S)-松属素组(1mg/kg，5mg/kg，缺血3、6h给药)

首次采用静脉注射，12h后腹腔注射1次，剂量给予静脉注射剂量的1.5倍。

2.5神经行为学检查

分别于动物手术清醒后及再灌注24h处死前进行神经行为学评分，评分采用Bederson’s评分标准(详见实施例二1.神经行为学检查)。

2.6脑梗死体积的测定：

评分后大鼠断头处死，迅速将取出的脑组织置于-20℃冰箱，10min后置室温环境，将脑置于大鼠脑切片模具中，切除嗅球、小脑和低位脑干后按间隔2mm冠状切五刀，切成6个大脑连续冠状粗切片。然后迅速将脑片置于5ml含2％TTC的溶液中，37℃恒温、避光孵育30min，期间每隔5min将脑片翻动一次。经TTC染色后，正常组织呈玫瑰红色，梗死组织未被染色而呈白色。将每组脑片排列整齐，拍照保存，应用图像分析系统软件处理并作统计，计算每张脑片的梗塞面积，乘以每片脑片的厚度2mm，每只动物所有脑片梗塞面积乘以厚度相加，即为脑梗塞体积。以病侧脑梗塞体积/病侧脑总体积即为脑梗塞百分比。

2.7脑含水量的测定

每只动物的大脑在切片前称取湿重，染色后收集切片于105℃，干燥24h后，称取每只动物大脑干重，比较各组动物的脑含水量。脑含水量＝(大脑湿重-大脑干重)/大脑湿重×100％。

2.8数据处理

定量测定数据以mean±SD标示，进行t’检验。计数资料以％标示，进行X²检验。

3.试验结果

3.1松属素对tMCAO大鼠神经行为学评分(Bederson’s Value)的影响

假手术组动物行为学评分为0分。溶剂对照组动物神经学评分平均值为3.4±0.6分，其中，多数动物表现为手术对侧前肢内旋或内收，侧向挤压对侧肌伸力量减弱，转圈或偶尔转圈行走，评为3分；另外少数动物仅出现前肢内旋和抗力下降，评为2分；个别动物症状较重，缺乏自主活动，评为4分。

松属素外消旋体组(1mg/kg、5mg/kg)在缺血后3h、6h能显著改善动物脑缺血后的神经损伤症状(P＜0.05，P＜0.01)，于缺血后8h给药作用不显著。药物作用表现出一定的剂量依赖性。(R)、(S)-松属素组(1mg/kg、5mg/kg)在缺血后3h能改善动物脑缺血后的神经损伤症状(P＜0.05)，于缺血后6h给药作用不显著。而对照药物尼莫地平(1mg/kg)在缺血3h给药即无改善作用。

3.2松属素对tM CAO大鼠脑梗塞体积的影响

大鼠tMCAO后24h，大脑顺序冠状切片行TTC染色，每组动物均有一定比例存在未染出梗塞区(白色)动物，表明在再灌24h内动物有一定程度的自动恢复。统计过程中各组均去除梗塞面积小于5％的样本。松属素外消旋体1mg/kg在缺血后3h给药能显著降低大鼠脑梗塞体积，在缺血后6h给药有一定的改善作用但不显著；松属素外消旋体5mg/kg在缺血后3h、6h给药均能显著降低大鼠脑梗塞体积(P＜0.05，P＜0.01)，于缺血后8h给药作用不显著。药物作用表现出一定的剂量依赖性。(R)、(S)-松属素组(1mg/kg、5mg/kg)在缺血后3h能降低大鼠脑梗塞体积(P＜0.05)，于缺血后6h给药作用不显著。而对照药物尼莫地平(1mg/kg)在缺血3h给药未表现出改善作用。

3.3松属素对tMCAO大鼠脑水肿的影响

模型组大鼠的脑含水量显著增加，松属素外消旋体组(1mg/kg、5mg/kg)在缺血后3h、6h能显著降低大鼠脑缺血后脑组织中的含水量(P＜0.05，P＜0.01)，于缺血后8h给药作用不显著。药物作用表现出一定的剂量依赖性。(R)、(S)-松属素组(1mg/kg、5mg/kg)在缺血后3h能降低大鼠脑缺血后脑组织中的含水量(P＜0.05)，于缺血后6h给药作用不显著。而阳性药物尼莫地平(1mg/kg)在缺血3h给药未表现出改善作用。结果见表9。

表9匹诺塞林对大鼠脑缺血2h再灌24h后神经症状学评分、

脑梗塞体积及脑含水量的影响。(x±s)

与假手术组相比，^##P＜0.01；与模型组相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01。

4.结论：

结果显示，大鼠于缺血后3h、6h后注射用松属素外消旋体(1、5mg/kg)，均能够改善大鼠神经行为学损伤，减小脑梗塞体积，减轻脑水肿，作用显著，并有良好的量效关系。大鼠于缺血3h后注射(R)、(S)-松属素作用显著；而于缺血6h后给药，药物没有治疗作用。尼莫地平在本试验条件下未表现出明显的作用。松属素外消旋体(1、5mg/kg，iv)对大鼠急性缺血性脑卒中具有良好的治疗作用，其治疗作用的有效时间窗约为6小时。

Claims (2)

1.松属素的外消旋体或松属素的盐的外消旋体用于制备治疗高血压引起的脑卒中的药物的用途。

2.(R)-松属素或其盐用于制备预防和治疗高血压引起的脑卒中的药物的用途。

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