CN105287614B - 一种灯银脑通药物组合物及其制备方法、制剂与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种灯银脑通药物组合物及其制备方法、制剂与应用。所述的灯银脑通药物组合物由质量份的灯盏花乙素2~60份、银杏内酯B 1~20份、人参皂苷Rg1 5~80份、人参皂苷Rb1 5~80份组成。制备方法包括前处理、配制、后处理步骤。制剂为所述的灯银脑通药物组合物中加入药学上可接受的辅料制备得到的冻干粉针剂。应用为所述的灯银脑通药物组合物在制备预防/治疗缺血性心脑血管疾病药物中的应用。本发明灯银脑通药物组合物具有药效强，可有效减轻缺血性脑血管疾病的病理变化、认知和行为障碍；安全性好，在规定的剂量范围内使用，不会出现因化合物不纯而引起的不良反应；质量可控性好，有效避免了中药注射剂的批间差异；稳定性好，就可以制成包括注射剂在内的制剂。

Description

一种灯银脑通药物组合物及其制备方法、制剂与应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种灯银脑通药物组合物及其制备方法、制剂与应用。

背景技术

缺血性脑血管病是现代社会致死、致残的最主要疾病之一。在中国，因高同型半胱氨酸血症基因为主，成为了缺血性脑血管疾病的高发区。缺血性脑血管病是由于脑部供血障碍引起脑组织相应区域缺血、低氧造成脑组织破坏所出现的一系列生化代谢失常、生理功能丧失、病例形态软化改变等疾病，是一种在脑组织上多层次、多方面损害的疾病。其中脑组织缺血性引起的脑组织梗塞、血管性痴呆、缺血区血流再通导致的脑再灌注损伤是较为常见的脑缺血性疾病。

美国超过180 个用于治疗中风的神经保护药物的临床试验全部失败了。tPA 溶栓治疗仍是目前唯一被FDA 批准用于治疗急性缺血性脑中风的药物。1000个新的候选神经保护药物等待临床试验。脑中风不仅是大脑中枢神经系统疾病，而且也是全身系统性疾病，脑中风后存在许多动态变化和进展的病理生理机制和相互作用机制；脑中风的病理转归包括脑组织损伤和相拮抗的内源性的神经保护或者恢复机制，单个化合物的多靶点或者多个化合物的联合应用是必要的，从而有可能获得最佳疗效，治疗靶点不应仅仅局限于抵抗损伤的因素，而且更应该着眼于内源性的神经保护机制和长期的恢复过程。

神经血管单元（Neurovascular unit，NVU）是美国国立神经病学与卒中研究所（NINDS）提出的一个中风治疗的概念模型，是神经系统的结构和功能单位，由神经元、血脑屏障（Blood Brain Barrier，BBB）、小胶质细胞（microglia）以及维持脑组织完整性的细胞外基质构成，BBB的组分包括星形胶质细胞、血管内皮细胞、周围细胞（pericyte）和基底膜。脑缺血损伤与神经元、小胶质细胞和微血管关系密切。

灯盏花[Erigeron breviscapus(vant. ) Hand.-Mazz.]药材首载于《滇南本草》，目前已收载在《中国药典》2015年版，云南民间常用于治疗跌打损伤、风湿疼痛、牙痛、胃痛、感冒等。二十世纪70年代经临床验证治疗脑血栓形成、脑栓塞、多发性神经炎，慢性蛛网膜炎等脑血管意外所致瘫痪症具有较好疗效。经过长期的临床研究，确定了治疗心脑血管疾病的主要活性成分为灯盏花素（Breviscapine）。1980年云南省药物研究所张人伟和上海医药工业研究院段士道认为，灯盏花素主要含灯盏花甲素（Apigenin-7-O-glucuronside）和灯盏花乙素（Scutellarin，又名野黄芩苷，分子式C₂₁H₁₈O₁₂，分子量：462.37），以灯盏花乙素为主。目前，《中国药典》2015年版规定供口服灯盏花素中灯盏花乙素含量不得低于90.0%（HPLC测定），供注射用的灯盏花素中灯盏花乙素含量不得低于98.0%（HPLC测定）。灯盏花乙素在神经保护方面的机制为能改善能量代谢，清楚自由基，抑制细胞内Ca2+超载、兴奋性氨基酸毒性、炎症反应、调节脑内血管活性物质的产生，抑制神经元凋亡等（颜娟、郑茂东，灯盏花素神经保护作用及其机制研究进展，神经药理学报，2014，4（3）：31-38）。灯盏花乙素在血管内的作用表现在抗凝血作用，特别是通过影响PF3和凝血因子V而实现，并能显著提高纤溶活性（王影、杨祥良、刘宏等，灯盏花素抗凝血作用研究，中药材，26（9）656-658）。

灯盏花乙素结构式

银杏叶（Ginkgo bilola L.）药材标准收载在《中国药典》2015年版。银杏内酯B为天然的最强血小板活化因子（PAF）受体拮抗剂，是从银杏叶中提取的一种二萜内酯。动物实验表明，在脑缺血再灌注0.5、1.0、2.0hr后均可显著减少脑水肿与梗死体积，增加脑血流，改善神经功能评分，其机制可能是通过抑制细胞内钙超载，下调iNOS，细胞间粘附分子（ICAM-1）及间质金属蛋白酶（MMP-9）的表达，保护血脑屏障，通过增强组织中自由基清除能力，抑制脂质过氧化反应，增加Na⁺-K⁺-ATP酶的释放，从而减轻脑损伤，最佳治疗时间窗可持续到缺血4hr以后，有益于临床应用（林红军、方伟蓉、李运曼，缺血脑卒中治疗时间窗的创新药物研究进展，药学与临床研究，2014，22（2）：134-139）。

银杏内酯B结构式

三七（panax notoginseng (Burk.F.H.Chen)）药材标准收载在《中国药典》2015年版。现在药理学研究显示，三七具有延缓衰老与抗氧化、改善脑循环和对抗脑缺血的作用，其主要有效成分为三七总皂苷。三七总皂苷中以人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1含量最高。人参皂苷Rb1可显著降低乳酸脱氢酶含量，清除氧自由基；人参皂苷Rg1可阻碍脂质过氧化反应，抑制过氧化物产生，从而抑制炎症反应。人参皂苷Rg1和Rb1具有不用的作用靶点，在缺血性脑卒中药物中发挥协同神经保护作用（宋志斌、张丹参，人参皂苷和三七皂苷五种成分神经保护作用的均匀设计——高通量筛选研究，神经药理学报，2011，1（3）：7-15）。

人参皂苷Rb1结构式 人参皂苷Rg1结构式

现有技术公开了灯盏花20~50%、满山香25~50%、银杏叶25~55%、三七提取物5~30%的复方中药口服制剂。

上述现有技术存在以下缺点：①灯盏花乙素、银杏内酯B和人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1单独使用，不能有效对抗缺血脑血管这类复杂多机制多靶点的疾病，所以疗效不佳；②药品成分纯度不高，不能制成化学成分明确的制剂，特别是无法制成化学成分明确且纯度很高的注射剂，产品质量和安全性均无法保障；③虽然有含有上述成分的复方制剂，但为口服，而灯盏花乙素、银杏内酯B和人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1口服生物利用度均很低，不能快速充分发挥药效。因此，开发一种能解决上述技术问题的药物是非常必要的。

发明内容

发明的目的在于提供一种灯银脑通药物组合物；第二目的在于提供所述的灯银脑通药物组合物的制备方法；第三目的在于提供所述的灯银脑通药物组合物的制剂；第四目的在于提供所述的灯银脑通药物组合物的应用。

本发明的第一目的是这样实现的，所述的灯银脑通药物组合物由质量份的灯盏花乙素2~60份、银杏内酯B 1~20份、人参皂苷Rg1 5~80份、人参皂苷Rb1 5~80份组成。

本发明的第二目的是这样实现的，包括前处理、配制、后处理步骤，具体包括：

A、前处理：

1）将配方配比的银杏内酯B中加入质量体积比1:10~100的助溶剂溶解得到溶液a；

2）将配方配比的银杏内酯B重量比1:30~200的增溶剂中加入增溶剂质量体积比1:2~5的水溶解得到溶液b；

3）将溶液a滴加到溶液b中，并于20~80℃下恒温搅拌1~6h至无助溶剂残留得到溶液c；

4）将配方配比的灯盏花乙素摩尔比1:0.95~1.05的碱中加入碱质量体积比1:50~500的水溶解得到溶液d，再将配方配比的灯盏花乙素加入到溶液d中，调整pH值为6.5~7.2得到溶液e；

B、配制：将溶液c和溶液e混合得到溶液f，再将配方配比的人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1加入到溶液f中，加入质量体积百分比的0.00~0.05%的稳定剂搅拌溶解得到目标物溶液g；

C、后处理：将目标物溶液g中和0.01~0.05%的活性炭，经搅拌、过滤、灌装、冷冻干燥得到目标物。

本发明的第三目的是这样实现的，所述的灯银脑通药物组合物中加入药学上可接受的辅料制备得到的冻干粉针剂。

本发明的第四目的是这样实现的，所述的灯银脑通药物组合物在制备预防/治疗缺血性心脑血管疾病药物中的应用。

本发明优点和有益效果：①药效强，可有效减轻缺血性脑血管疾病的病理变化和行为障碍，药效明显好于临床用药；②起效快，由于制备成注射剂，活性物质能有效充分进入血管，导致起效快；③安全性好，由于采用高纯度的灯盏花乙素、银杏内酯B和人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1单体入药，大大降低的因不纯物质引起的如过敏等不良反应；④由于是单体组合入药，质量视同化学复方制剂，质量可控性高；⑤采用冻干粉针制剂，大大降低了四个活性成分因在水溶液中降解反应，最终提升了产品的稳定性好。

附图说明

图1为大鼠局灶性脑缺血脑梗塞体积结果图；

图2为大鼠局灶性脑缺血行为学评分图；

图3为小鼠全脑缺血脑梗体积结果图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

本发明所述的灯银脑通药物组合物，由质量份的灯盏花乙素2~60份、银杏内酯B 1~20份、人参皂苷Rg1 5~80份、人参皂苷Rb1 5~80份组成。

所述的灯盏花乙素、银杏内酯B、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1为天然植物提取或化学合成制备。

本发明所述的灯银脑通药物组合物的制备方法，包括前处理、配制、后处理步骤，具体包括：

A、前处理：

1）将配方配比的银杏内酯B中加入质量体积比1:10~100的助溶剂溶解得到溶液a；

2）将配方配比的银杏内酯B重量比1:30~200的增溶剂中加入增溶剂质量体积比1:2~5的水溶解得到溶液b；

3）将溶液a滴加到溶液b中，并于20~80℃下恒温搅拌1~6h至无助溶剂残留得到溶液c；

4）将配方配比的灯盏花乙素摩尔比1:0.95~1.05的碱中加入碱质量体积比1:50~500的水溶解得到溶液d，再将配方配比的灯盏花乙素加入到溶液d中，调整pH值为6.5~7.2得到溶液e；

B、配制：将溶液c和溶液e混合得到溶液f，再将配方配比的人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1加入到溶液f中，加入质量体积百分比的0.00~0.05%的稳定剂搅拌溶解得到目标物溶液g；

C、后处理：将目标物溶液g中加入质量体积百分比的0.01~0.05%的活性炭，经过滤、灌装、冷冻干燥。

A步骤1）中所述的助溶剂为乙醇、丙酮和乙酸乙酯中的一种或几种。

A步骤2）中所述的增溶剂为羟丙基β环糊精和/或磺丁基醚β环糊精。

A步骤4）中所述的碱为碳酸氢钠、氢氧化钠、精氨酸和葡甲胺中的一种或几种。

B步骤中所述的稳定剂为亚硫酸氢钠、盐酸半胱氨酸、维生素C中的一种或几种。

C步骤中所述的过滤是经0.2μm的滤膜过滤。

本发明所述的灯银脑通药物组合物的制剂为所述的灯银脑通药物组合物中加入药学上可接受的辅料制备得到的冻干粉针剂。

本发明所述的灯银脑通药物组合物的应用为所述的灯银脑通药物组合物在制备预防/治疗缺血性心脑血管疾病药物中的应用。

所述的缺血性心脑血管疾病为椎基底动脉供血不足、短暂性脑缺血发作、缺血性脑卒中、脑血管痴呆。

所述的灯银脑通药物组合物的临床有效剂量为1~20mg/Kg/d。

如无特殊说明，本发明所述的质量体积比的单位均为mg/ml。

本发明的制备方法具体操作如下：

步骤1：将处方量的银杏内酯B用10~100倍（质量/体积比，mg/ml）的助溶剂溶解。

步骤2：将银杏内酯B处方量30~200倍的增溶剂用2~5（质量/体积比,mg/ml）水溶解。

步骤3：将步骤1所得溶液缓慢滴加到步骤2的溶液中，并在20~80℃恒温搅拌1~6小时，至无助溶剂残留。

步骤4：将灯盏花乙素处方摩尔量0.95~1.05倍的碱用50~500倍（质量/体积比,mg/ml）水溶解，再将处方量灯盏花乙素加入上述溶液中，至该溶液pH值为6.5~7.2。

步骤5：将步骤3与步骤4所得溶液混合，再称取处方量的人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1于上述混合溶液中，加入0.00~0.05%（质量/体积比，mg/ml）的稳定剂，搅拌溶解，补充注射用水至处方量。

步骤6：将步骤5所得溶液用0.01~0.05%（质量/体积比，mg/ml）活性炭处理，搅拌，0.2μml滤膜过滤，灌装，冷冻干燥。

下面以具体实施案例对本发明做进一步说明：

实施例1——制备本发明灯银脑通药物组合物的冻干粉针剂

处方组成：

灯盏花乙素 23g

银杏内酯B 6g

人参皂苷Rg1 26g

人参皂苷Rb1 45g

羟丙基β环糊精 480g

葡甲胺 10g

注射用水 2000ml 适量（最终除去）

制备方法：将处方量的银杏内酯B用20倍（质量/体积比，mg/ml）的丙酮溶解，所得溶液缓慢滴加到30%（质量/体积比，mg/ml）处方量的羟丙基β环糊精的水溶液中，并在60℃恒温搅拌6小时，至无助溶剂残留。将处方量的灯盏花乙素用处方量的葡甲胺加适量水溶液溶解，至该溶液pH值为6.8备用。将灯盏花乙素溶液与银杏内酯溶液混合，再称取处方量的人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1于上述混合溶液中，补充注射用水至处方量，加0.05%的活性炭，搅拌，0.2μm滤膜过滤；分装1000支，灌装2ml；冷冻干燥。

实施例2——制备本发明灯银脑通药物组合物的冻干粉针剂

处方组成：

灯盏花乙素 10g

银杏内酯B 5g

人参皂苷Rg1 55g

人参皂苷Rb1 30g

羟丙基β环糊精 420g

葡甲胺 4g

盐酸半胱氨酸 1g

注射用水 2000ml 适量（最终除去）

制备方法：将处方量的银杏内酯B用20倍（质量/体积比，mg/ml）的乙酸乙酯溶解，所得溶液缓慢滴加到30%（质量/体积比，mg/ml）处方量的羟丙基β环糊精的水溶液中，并在40℃恒温搅拌6小时，至无助溶剂残留。将处方量的灯盏花乙素用处方量的葡甲胺加适量水溶液溶解，至该溶液pH值为7.2备用。将灯盏花乙素溶液与银杏内酯溶液混合，再称取处方量的人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1于上述混合溶液中，补充注射用水至处方量，加盐酸半胱氨酸，加0.05%的活性炭，搅拌，0.2μm滤膜过滤；分装1000支，灌装2ml；冷冻干燥。

实施例3——制备本发明灯银脑通药物组合物的冻干粉针剂

处方组成：

灯盏花乙素 20g

银杏内酯B 10g

人参皂苷Rg1 25g

人参皂苷Rb1 45g

磺丁基醚β环糊精 640g

精氨酸 7g

注射用水 2000ml 适量（最终除去）

制备方法：将处方量的银杏内酯B用20倍（质量/体积比，mg/ml）的丙酮溶解，所得溶液缓慢滴加到40%（质量/体积比，mg/ml）处方量的磺丁基醚β环糊精的水溶液中，并在30℃恒温搅拌4小时，至无助溶剂残留。将处方量的灯盏花乙素用处方量的精氨酸加适量水溶液溶解，至该溶液pH值为7.0备用。将灯盏花乙素溶液与银杏内酯溶液混合，再称取处方量的人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1于上述混合溶液中，补充注射用水至处方量，加0.05%的活性炭，搅拌，0.2μm滤膜过滤；分装1000支，灌装2ml；冷冻干燥。

实施例4——制备本发明灯银脑通药物组合物的冻干粉针剂

处方组成：

灯盏花乙素 57g

银杏内酯B 8g

人参皂苷Rg1 10g

人参皂苷Rb1 25g

磺丁基醚β环糊精 560g

氢氧化钠 5g

盐酸半胱氨酸 0.5g

注射用水 2000ml 适量（最终除去）

制备方法：将处方量的银杏内酯B用25倍（质量/体积比，mg/ml）的丙酮溶解，所得溶液缓慢滴加到40%（质量/体积比，mg/ml）处方量的磺丁基醚β环糊精的水溶液中，并在50℃恒温搅拌2小时，至无助溶剂残留。将处方量的灯盏花乙素用处方量的氢氧化钠加适量水溶液溶解，至该溶液pH值为6.9备用。将灯盏花乙素溶液与银杏内酯溶液混合，再称取处方量的人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1于上述混合溶液中，补充注射用水至处方量，加盐酸半胱氨酸，加0.05%的活性炭，搅拌，0.2μm滤膜过滤；分装1000支，灌装2ml；冷冻干燥。

实施例5——制备本发明灯银脑通药物组合物的冻干粉针剂

处方组成：

灯盏花乙素 25g

银杏内酯B 5g

人参皂苷Rg1 50g

人参皂苷Rb1 20g

羟丙基β环糊精 350g

氢氧化钠 3g

亚硫酸氢钠 1g

注射用水 1000ml 适量（最终除去）

制备方法：将处方量的银杏内酯B用40倍（质量/体积比，mg/ml）的乙醇溶解，所得溶液缓慢滴加到40%（质量/体积比，mg/ml）处方量的羟丙基β环糊精的水溶液中，并在50℃恒温搅拌5小时，至无助溶剂残留。将处方量的灯盏花乙素用处方量的氢氧化钠加适量水溶液溶解，至该溶液pH值为6.9备用。将灯盏花乙素溶液与银杏内酯溶液混合，再称取处方量的人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1于上述混合溶液中，补充注射用水至处方量，加亚硫酸氢钠，加0.05%的活性炭，搅拌，0.2μm滤膜过滤；分装1000支，灌装1ml；冷冻干燥。

实施例6——制备本发明灯银脑通药物组合物的冻干粉针剂

处方组成：

灯盏花乙素 6g

银杏内酯B 4g

人参皂苷Rg1 65g

人参皂苷Rb1 25g

磺丁基醚β环糊精 270g

碳酸氢钠 1g

注射用水 2000ml 适量（最终除去）

制备方法：将处方量的银杏内酯B用25倍（质量/体积比）的乙醇溶解，所得溶液缓慢滴加到25%（质量/体积比）处方量的磺丁基醚β环糊精的水溶液中，并在40℃恒温搅拌6小时，至无助溶剂残留。将处方量的灯盏花乙素用处方量的碳酸氢钠加适量水溶液溶解，至该溶液pH值为7.0备用。将灯盏花乙素溶液与银杏内酯溶液混合，再称取处方量的人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1于上述混合溶液中，补充注射用水至处方量，加0.05%的活性炭，搅拌，0.2μm滤膜过滤；分装1000支，灌装2ml；冷冻干燥。

实施例7——制备本发明灯银脑通药物组合物的冻干粉针剂

处方组成：

灯盏花乙素 25g

银杏内酯B 4g

人参皂苷Rg1 45g

人参皂苷Rb1 26g

羟丙基β环糊精 320g

碳酸氢钠 4g

维生素C 0.1g

注射用水 1000ml 适量（最终除去）

制备方法：将处方量的银杏内酯B用35倍（质量/体积比，mg/ml）的乙酸乙酯溶解，所得溶液缓慢滴加到40%（质量/体积比，mg/ml）处方量的羟丙基β环糊精的水溶液中，并在40℃恒温搅拌6小时，至无助溶剂残留。将处方量的灯盏花乙素用处方量的碳酸氢钠加适量水溶液溶解，至该溶液pH值为6.9备用。将灯盏花乙素溶液与银杏内酯溶液混合，再称取处方量的人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1于上述混合溶液中，补充注射用水至处方量，加维生素C，加0.05%的活性炭，搅拌，0.2μm滤膜过滤；分装1000支，灌装1ml；冷冻干燥。

实施例8 本发明灯银脑通药物组合物对大局灶性脑缺血大鼠脑梗塞体积及神经功能的影响的试验

受试药物1

名称：本实施例5制备得到的灯银脑通药物组合物的冻干粉针（规格：100mg/支）

受试药物2

名称：注射用灯盏花素（规格：50mg）

提供单位：昆明龙津药业有限责任公司

批号：20130423-1

受试药物3

名称：银杏二萜内酯葡胺注射液（规格：5ml:25mg）

提供单位：江苏康缘集团有限责任公司

批号：130201

受试药物4

名称：注射用血塞通冻干粉针（规格：400mg）

提供单位：昆药集团股份有限公司

批号：20140305-02

动物

来源，种属，品系：SD大鼠，由昆明医科大学实验动物中心提供，体重：280±20g，性别：♂，动物总数：80只

方法和结果：

暂时性局部脑缺血模型的制备

雄性SD大鼠，饲养室室温保持在25℃，12/12hr昼夜节律，自由进食。大鼠用用7%水合氯醛（300mg/kg，ip）麻醉后，仰位固定于手术板上，75%酒精消毒颈部皮肤。颈部正中切口，分离左侧颈总动脉（CCA）至暴露颈内动脉（ICA）、颈外动脉（ECA）分支，仔细分离ECA并将其枕动脉、甲状腺上动脉分支用电凝并剪断，分离到舌动脉和颌动脉分叉处结扎；分离ICA并将其颅外段唯一分支翼腭突动脉结扎。用动脉夹夹住ECA自CCA发出的起始处，在ECA远端靠结扎处剪开小口，插入一根直径为0.26mm的尼龙丝并疏松结扎，剪断ECA；以镊子夹住ECA断端并拉直使尼龙丝在ICA部分的长度应为22mm左右，说明尼龙丝已到达ICA分支到大脑中动脉（MCA）处，阻断了MCA的血液供应。缺血2hr后，将尼龙丝拉出实现再灌注24hr。术中室温保持在25℃，动物体温保持在37℃。麻醉清醒后出现右侧霍纳氏综合症、运动旋转追尾现象作为模型成功的标准。

分组与给药：

分为8组，每组10只，分别为：假手术组，空白溶媒；MCAO模型对照组，空白溶媒；本发明实施例5制备的灯银脑通药物组合物高剂量组：缺血2hr及再灌注4hr尾静脉注射本发明实施例5制备的灯银脑通药物组合物20mg/kg；本发明实施例5制备的灯银脑通药物组合物中剂量组：缺血2hr及再灌注4hr尾尾静脉注射本发明实施例5制备的灯银脑通药物组合物10mg/kg；本发明实施例5制备的灯银脑通药物组合物低剂量组：缺血2hr及再灌注4hr尾静脉注射本发明实施例5制备的灯银脑通药物组合物5mg/kg。注射用灯盏花素组：缺血2hr及再灌注4hr尾静脉注射灯盏花素50mg/kg；银杏二萜内酯葡胺注射液组：缺血2hr及再灌注4hr尾静脉注射银杏二萜内酯10mg/kg；注射用血塞通组：缺血2hr及再灌注4hr尾静脉注射血塞通50mg/kg。

神经行为学评分

测定时动物均处于清醒状态，分别在缺血2hr和再灌注24hr时进行评定。

评分标准：

0分：无神经功能缺损，肢体活动正常；

1分：神经功能轻度局灶性损伤，不能完全伸展左前肢；

2分：神经功能轻度局灶性损伤，轻抓尾巴时，左前肢肌力明显下降；

3分：神经功能轻度局灶性损伤，各个方向活动自如，抓尾巴时向左侧转圈；

4分：神经功能中度局灶性损伤，活动时向左侧转圈；

5分：神经功能重度局灶性损伤，刺激后才能行走，向左侧倾倒或转圈；

6分：神经功能极重度局灶性损伤，无自主行走及意识障碍，对刺激无反应。

7分：死亡

分数越高，说明动物的行为障碍越严重。

脑梗塞体积的测定

再灌24hr后，大鼠用水合氯醛（300mg/kg）麻醉，用生理盐水及4%多聚甲醛心脏灌注固定，快速取出大脑并于-20℃保存，冻存5hr后将大脑从前卤起作冠状切成6片（每片厚2mm），迅速置于1%TTC-磷酸盐缓冲液中，避光、37℃孵育30min，将TTC染色后的脑组织切片置于4%的福尔马林中固定，染色后的正常脑组织呈玫瑰红色，而梗塞组织呈白色，数码相机拍摄保存。每张脑片采用计算机图像分析系统处理（SPOT3.5软件），梗塞面积叠加计算梗塞体积，梗塞体积的计算公式：

脑梗塞体积%=（未手术侧半球体积-手术侧未梗塞部分的体积）/未手术侧半球的体积

统计分析：

所有结果采用均数±标准差表达，行为学评分、脑梗塞体积实验采用单因素方差分析（one-way AVOVA），组间差异采用LSD检验，p＜0.01为显著性差异。结果见图1、图2。

图1结果显示，缺血2hr及再灌注4hr时，尾静脉注射给予本发明实施例5制备的灯银脑通药物组合物10mg/kg体重或20mg/kg体重，均能够剂量依赖性显著减少脑梗塞体积，与模型组比较有显著差异，与注射用灯盏花素、银杏二萜内酯葡胺注射液和注射用血塞通比较，有显著差异。其中高剂量作用最为明显，缩小梗塞体积达到61%以上。

图2结果显示，模型组动物出现明显的神经功能障碍，活动时间向左侧转圈，多数动物评分为4分。缺血2hr及再灌注4hr，尾静脉注射本发明实施例5制备的灯银脑通药物组合物10mg/kg体重或20mg/kg体重，均能明显改善神经症状，评分与模型组比较有显著的差异，与注射用灯盏花素、银杏二萜内酯葡胺注射液和注射用血塞通比较，有显著的差异。其中高剂量组改善神经功能的作用最为明显，多数动物只出现轻微的神经功能局灶性损伤，表现为左侧肌力下降，不能完全伸展左前肢等。

实施例9 本发明灯银脑通药物组合物对全脑缺血再灌注小鼠脑梗塞体积的影响试验

受试药物1

名称：本实施例5制备得到的灯银脑通药物组合物的冻干粉针（规格：100mg/支）

受试药物2

名称：注射用灯盏花素（规格：50mg）

提供单位：昆明龙津药业有限责任公司

批号：20130423-1

受试药物3

名称：银杏二萜内酯葡胺注射液（规格：5ml:25mg）

提供单位：江苏康缘集团有限责任公司

批号：130201

受试药物4

名称：注射用血塞通冻干粉针（规格：400mg）

提供单位：昆药集团股份有限公司

批号：20140305-02

动物

来源，种属，品系：KM小鼠，由昆明制药集团股份有限公司实验动物中心提供，体重：30±2g，性别：♂，动物总数：80只。

全脑缺血再灌注模型的制备：

小鼠水合氯醛（350mg/kg）腹腔麻醉，仰卧位固定于37℃恒温手术台上。颈正中切开皮肤，分离两侧颈总动脉，用微型动脉夹夹闭血管，造成大脑缺血状态。30min后松开动脉夹恢复血流，缝合切口，再灌注24hr。术中室温保持在25℃，动物体温保持在37℃。自由饮水进食。

分组与给药

分为8组，每组10只，分别为：a正常对照组，空白溶媒；b全脑缺血再灌注模型对照组，空白溶媒；c本发明实施例5制备的灯银脑通药物组合物高剂量组，缺血30min后，单次腹腔注射20mg/kg；d本发明实施例5制备的灯银脑通药物组合物中剂量组，缺血30min后，单次腹腔注射10mg/kg；e本发明实施例5制备的灯银脑通药物组合物低剂量组，缺血30min后，单次腹腔注射5mg/kg。f注射用灯盏花素组，缺血30min后，单次腹腔注射50mg/kg；g银杏二萜内酯葡胺注射液组，缺血30min后，单次腹腔注射10mg/kg；h注射用血塞通组，缺血30min后，单次腹腔注射50mg/kg。

脑梗塞体积的测定：

再灌注24hr后，小鼠水合氯醛（350mg/kg）腹腔麻醉，用生理盐水及4%多聚甲醛心脏灌注固定，快速取出大脑并于-20℃保存，冻存3hr后将大脑从前卤起作冠状切成6片（每片厚2mm），迅速置于0.05%TTC-磷酸盐缓冲液中，避光、37℃孵育30min，将TTC染色后的脑组织切片置于4%的福尔马林中固定，染色后的正常脑组织呈玫瑰红色，而梗塞组织呈白色，数码相机拍摄保存。每张脑片采用计算机图像分析系统处理（SPOT3.5软件），梗塞面积叠加计算梗塞体积，结果见图3。

图3结果显示在小鼠脑缺血30min后单次腹腔给予10、20mg/kg体重灯银脑通组合物均能够明显剂量依赖性减少脑梗塞体积，与模型组和三个阳性对照比较有显著的差异（p＜0.01）。

上述整体动物水平、生化水平、组织病理学的研究结果表明，本发明实施例5制备的灯银脑通药物组合物能够非常显著地缩小全脑缺血及局灶性缺血脑梗塞体积，可用于防治缺血性脑梗塞，从而可将本发明实施例5制备的灯银脑通药物组合物应用于制备预防和治疗缺血性脑血管疾病的药物。

实施例10

分别用实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例6、实施例7制备得到的灯银脑通药物组合物进行试验，试验方法同实施例8和实施例9。结果均表明本发明制备的灯银脑通药物组合物能够非常显著地缩小全脑缺血及局灶性缺血脑梗塞体积，可用于防治缺血性脑梗塞，从而可将本发明制备的灯银脑通药物组合物应用于制备预防和治疗缺血性脑血管疾病的药物。

Claims (4)

1.一种灯银脑通药物组合物，其特征在于用于制备预防/治疗缺血性脑血管疾病药物，所述灯银脑通药物组合物的活性成分由以质量份计的灯盏花乙素2~60份、银杏内酯B 1~20份、人参皂苷Rg1 5~80份、人参皂苷Rb1 5~80份组成，所述灯银脑通药物组合物的制备方法包括前处理、配制、后处理步骤，具体为：

A、前处理：

1）将配方配比的银杏内酯B中加入质量体积比1:10~100的助溶剂溶解得到溶液a，助溶剂为乙醇、丙酮和乙酸乙酯中的一种或几种；

2）将配方配比的银杏内酯B重量比1:30~200的增溶剂中加入增溶剂质量体积比1:2~5的水溶解得到溶液b，增溶剂为羟丙基β环糊精和/或磺丁基醚β环糊精；

3）将溶液a滴加到溶液b中，并于20~80℃下恒温搅拌1~6h至无助溶剂残留得到溶液c；

4）将配方配比的灯盏花乙素摩尔比1:0.95~1.05的碱中加入碱质量体积比1:50~500的水溶解得到溶液d，碱为碳酸氢钠、氢氧化钠、精氨酸和葡甲胺中的一种或几种，再将配方配比的灯盏花乙素加入到溶液d中，调整pH值为6.5~7.2得到溶液e；

B、配制：将溶液c和溶液e混合得到溶液f，再将配方配比的人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1加入到溶液f中，加入质量体积百分比的0.00~0.05%的稳定剂搅拌溶解得到目标物溶液g，稳定剂为亚硫酸氢钠、盐酸半胱氨酸、维生素C中的一种或几种；

C、后处理：在目标物溶液g中加入质量体积百分比的0.01~0.05%的活性炭，经搅拌、过滤、灌装、冷冻干燥得到目标物。

2.根据权利要求1所述灯银脑通药物组合物，其特征在于C步骤中所述过滤是经0.2μm的滤膜过滤。

3.一种权利要求1所述灯银脑通药物组合物的应用，其特征在于所述灯银脑通药物组合物在制备预防/治疗缺血性脑血管疾病药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述缺血性脑血管疾病为椎基底动脉供血不足、短暂性脑缺血发作、缺血性脑卒中、脑血管痴呆。