CN108042555A - 一种淫羊藿苷的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种淫羊藿苷的应用，即淫羊藿苷在制备预防或治疗左旋多巴诱导的异动症的药物中应用。淫羊藿苷既能改善异动症的临床症状，又能延缓异动症出现的时间。不仅对帕金森病的症状有一定的治疗效果，更大的程度上能对长期服用左旋多巴诱导的异动症的延缓或者改善效果，降低了帕金森治疗过程中因药物导致的副作用—异动症，发挥单一化合物与药物的协同作用，治疗帕金森病。适宜在临床中推广使用。

Description

一种淫羊藿苷的应用

技术领域

本发明涉及一种淫羊藿苷的应用，具体属于医药技术领域。

背景技术

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是以中脑黑质致密部多巴胺能神经元进行性丢失、变性和死亡为主要病理特征的一种神经系统退行性疾病，多发于中老年。其典型的临床表现为静止性震颤、肌强直、运动迟缓、姿态不稳等。PD是仅次于阿尔兹海默病造成中老年人神经变性的杀手，给社会和家庭带来沉重的负担。目前PD发病机制不明确，治疗现状因疗效不佳或副作用明显受限制。因此，寻找有效的治疗方案和药物，来缓解PD患者的症状，具有重要的临床意义。

左旋多巴目前仍是PD治疗药物中的金标准，左旋多巴是多巴胺的代谢前体，可以通过血脑屏障，进入基底节后经脱羧而成多巴胺，发挥补充多巴胺神经递质缺乏的作用。左旋多巴能够有效改善运动不能和僵直状态，临床常用复方左旋多巴或左旋多巴与其他辅助药物联合治疗。但在应用左旋多巴治疗2～5年后，半数以上的病例开始出现药效的波动性。每次服药后症状改善持续的时间愈来愈短，附加出现多动现象，使病人经常在严重的动作缺失与无法控制的多动状态之间来回摆动，这种症状称为异动症。

左旋多巴可通过反复刺激多巴胺D1受体引起蛋白激酶活性增强，蛋白激酶通路被激活后可导致一系列底物如多巴胺和环磷腺苷调节的磷酸化蛋白-32(DARP-32)、细胞外信号调节激酶(ERK1/2)等磷酸化并最终引起即早基因如△FOS表达增加，从而导致异动症发生。还有研究发现长时程增强参与了PD大鼠异动症的发生，在正常情况下长时程增强的意义在于清除异常运动信息传递，阻止异常运动的发生，而△FOS B可能通过拮抗蛋白磷酸酶1干扰异常信息的清除，改变PD大鼠神经元和行为学的可塑性，参与异动症的发生。此外，△FosB作为转录因子，还可以通过对谷氨酸受体基因的调控，增强黑质纹状体直接通路的活性而参与异动症的发生。左旋多巴能使PD患者的临床症状减轻，但并不能改变疾病的进展过程。

淫羊藿为贵州省道地中药材，具有“补肾阳，强筋骨，祛风湿”等功效，中医用于治疗“筋骨挛急，风湿痹痛，半身不遂，四肢不仁”等，使用历史悠久。淫羊藿苷(Icariin,ICA)是淫羊藿的主要活性成分之一，现代药理学研究发现淫羊藿苷的药理作用较多，包括抗炎、磷酸二酯酶抑制、促进血管新生及神经再生等。发明人前期研究表明，淫羊藿苷对抑制小胶质细胞介导的神经炎症有显著作用，进而抑制多种炎症介质的释放，从而对帕金森病发挥重要的保护作用，保护多巴胺能神经元的损伤，改善多巴胺能神经元损伤导致的运动障碍。现有技术中，尚未有将淫羊藿苷应用于制备治疗异动症药物的相关报道。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种淫羊藿苷的新应用，即将淫羊藿苷应用于制备预防或治疗左旋多巴诱导的异动症的药物中。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

淫羊藿苷在制备预防或治疗左旋多巴诱导的异动症的药物中应用。

前述淫羊藿苷的应用中，药物是以淫羊藿苷作为活性成分，加入药用载体或赋形剂制成的片剂、胶囊剂、颗粒剂、软胶囊、滴丸剂或舌下含片。

前述淫羊藿苷的应用中，片剂通过以下步骤制备：取淫羊藿苷10-400毫克、硬脂酸镁0.1～0.40毫克、羧甲基淀粉钠4～12毫克、微晶纤维素50～100毫克，淫羊藿苷与羧甲基淀粉钠、微晶纤维素混合，过筛，使其混匀，加入适量水或乙醇制粒，干燥后，整粒，加入硬脂酸镁，然后用冲压装置将颗粒压制成片，即得。

前述淫羊藿苷的应用中，胶囊剂通过以下步骤制备：取淫羊藿苷50～400毫克、硬脂酸镁0.1～0.30毫克、羧甲基淀粉钠4～12毫克、淀粉50～100毫克，将淫羊藿苷与羧甲基淀粉钠、淀粉混合均匀，加入适量乙醇制粒，干燥，整粒，加入硬脂酸镁，然后装入明胶胶囊中，即得。

前述淫羊藿苷的应用中，颗粒剂通过以下步骤制备：取淫羊藿苷1～10克、糊精或蔗糖1～10克、矫味剂和甜味剂适量，将淫羊藿苷与蔗糖/糊精、矫味剂和甜味剂混合均匀，加入适量水或乙醇制成软材，过筛制粒，干燥，整粒，分装，即得。

前述淫羊藿苷的应用中，软胶囊通过以下步骤制备：取淫羊藿苷10～400毫克、聚乙醇或豆油100～400毫克、助悬剂3～10毫克、乳化剂3～10毫克和明胶50～100毫克、甘油10～20毫克、纯化水50～100毫克及防腐剂适量，将明胶置于溶胶罐中，加入纯化水，70℃下加热使溶解，加入甘油和防腐剂，搅拌均匀，真空除去气泡后保温静置，按比例将淫羊藿苷与聚乙醇/豆油、乳化剂、助悬剂混合均匀，再和制备好的明胶置旋转压囊机，压制成软胶囊，定型，干燥，即得。

前述淫羊藿苷的应用中，滴丸通过以下步骤制备:取淫羊藿苷1～10毫克、基质20～40毫克、甲基硅油适量，将淫羊藿苷加水制成均匀糊状，再加入溶融的基质液，加热熔融成澄清液体，倒入已预热的滴丸器中，控制滴制温度和速度，滴入甲基硅油冷凝液中，成丸后吸干冷凝液，收集滴丸，置干燥器内，即得。

前述淫羊藿苷的应用中，糖浆剂的制备方法为:取淫羊藿苷1～20克、羧甲基纤维素纳1.5克、糖精钠0.1克、矫味剂适量、防腐剂适量和纯化水100毫升，将羧甲基纤维素纳分散在热水中，冷却，然后与含有淫羊藿苷、糖精钠、矫味剂和防腐剂的含水混悬液混合，将溶液调配成所需体积并混合均匀，灭菌后分装，即得。

前述淫羊藿苷的应用中，以淫羊藿苷活性成分计，给药量为5-50mg/kg。

左旋多巴是目前治疗帕金森病的一线用药，能够有效改善运动不能和僵直状态，但在应用左旋多巴治疗2～5年后，会出现异动症状，也称异动症。淫羊藿苷具有抗炎作用，能够通过血脑屏障，抑制小胶质细胞介导的神经炎症，从而对帕金森病发挥重要的保护作用。因此本发明中将淫羊藿苷应用于治疗长期服用左旋多巴诱导的异动症，不仅对帕金森病的症状有一定的治疗效果，更大的程度上能对长期服用左旋多巴诱导的异动症的延缓或者改善效果，降低了帕金森治疗过程中因药物导致的副作用—异动症，发挥单一化合物与药物的协同作用，治疗帕金森病。因此适宜在临床中推广使用。

为了确保本发明技术方案的科学、合理、有效，发明人进行了一系列实验。

一、实验材料和仪器

1.1、实验动物

SD雄性大鼠，体重200-250g，购自于第三军医大学大坪医院动物实验中心(许可证：SCXK(渝)2012-0005)，动物饲养于遵义医学院基础药理教育部重点实验室SPF动物房，各组实验动物自由进食、饮水。

1.2、主要仪器设备

大鼠脑立体定位仪(美国Narishige公司)，OLYMPUS光学显微镜(日本OLYMPUS公司)，BSS－110电子分析天平(北京赛多利斯电子天平有限公司)，Milli QA纯水处理器(Millipore公司)等。

1.3、主要实验试剂

淫羊藿苷，纯度≥98％(南京泽朗医药科技公司)；左旋多巴，纯度≥98％，(Sigma公司)，BCA试剂盒，RIPA裂解液，β-actin小鼠抗大鼠多克隆抗体，ΔFosB、ERK1/2、phospho-ERK1/2多克隆抗体。

二、实验方法

2.1、实验分组

30只SD大鼠，雄性，体重200-250g，随机分为5组，每组6只，分别设为：空白组、模型组、6-羟多巴胺(6-OHDA，8μg)组、6-OHDA+左旋多巴(L-DOPA，25mg/kg)组、6-OHDA+L-DOPA(25mg/kg)+ICA(20mg/kg)组。造模后21天，灌胃给予ICA及腹腔注射L-DOPA，连续给药21天。

2.2、制备动物模型

用7％水合氯醛(0.5mL/100g)麻醉SD大鼠，在无菌条件下，以前囟为坐标原点，前囟后5.2mm，中线旁2.2mm，硬膜下8.0mm，匀速注入4μL浓度为2μg/μL的6-OHDA。

2.3、行为学检测

2.3.1、AIM评分

大鼠在给药第7、14、21天进行AIM评分，在用药后每30min评估1次，持续120min钟，共4次。AIM评分：分成4个部分进行评定(上肢AIM、口面部AIM、轴性AIM和运动AIM)，每部分又根据其有无和严重程度分5个等级(0～4)：理论上1只大鼠1次用药后最大平均积分为16分。0：无；1：AIM存在不到观察时间的50％；2：AIM存在大于观察时间的50％；3：持续存在,刺激使之停止；4：持续存在,刺激不能使之停止。

2.3.2、对侧旋转行为实验

观察并记录左旋多巴注射结束2h内的旋转行为特点，并计算用药后每5min的旋转圈数，将大鼠旋转圈数增至平均旋转圈数一半时的首个5分钟与降至该值时的首个5分钟之间的时间段视为药效期，计算药效期的长短及该时间段内平均每5min的旋转圈数。

2.4、取材

各组大鼠分别用7％水合氯醛麻醉后，打开其腹腔，夹闭腹主动脉，剪开胸腔，充分暴露心脏，将透灌针经心尖插至主动脉，止血钳固定并剪开右心耳，以一定的速度灌注0.1mol/L PBS液，至大脑内的血液冲洗干净，直接断头取脑，分离出中脑，于-80℃保存。

2.5、蛋白测定

1)蛋白提取：取出中脑加入适量配置好的RIPA裂解液，研磨匀浆，冰上静置20min后，12000转/min，4℃离心15min，收集上清，-80℃保存。

2)BCA法检测样品的蛋白浓度。

3)样本蛋白变性：根据各组样本蛋白浓度和体积，确定样本检测的蛋白质量，计算出同质量的蛋白下各组样本检测体积。

4)加样：取出10％NuPAGE凝胶，将其固定在电泳槽中，电泳槽内加满电泳液，垂直拔掉凝胶上的梳子，将检测样品分别加到凝胶孔内，盖上电泳槽盖，连接好正负电极，开始电泳。

5)电泳：首先电压调至70V，电泳约40min，待Maker条带开始分离后，电压调至110V，直到Maker条带到达下层胶底部，停止电泳。

6)电转：用半干转进行电转，切取所需分子量的凝胶，按滤纸—聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)—凝胶—滤纸的顺序，放入电转盒，设定25V，1.0A，30min开始电转。

7)洗涤：取出PVDF膜，用TBST洗涤，10min一次，洗3次；

8)封闭：5％的脱脂奶粉封闭3h，用TBST洗涤，10min一次，洗3次；

9)加一抗：4℃孵育过夜，用TBST洗涤，10min一次，洗3次；

10)加二抗：室温孵育1h，用TBST洗涤，10min一次，洗3次；

11)曝光；

12)采用Quantity One定量分析软件系统对条带进行灰度计算。

2.6、数据的统计分析

实验数据用SPSS21.0统计软件统计，所有数据以均数±标准差表示，采用单因素方差分析(ANOVA)比较均数的组别差异，方差齐使用LSD法，方差不齐，采用Dunnett’s T3比较均数的组别差异，P<0.05有统计学意义。

三、实验结果

1、淫羊藿苷对左旋多巴诱导的异动症大鼠AIM评分的影响

采用分成4个部分进行评定(上肢AIM、口面部AIM、轴性AIM和运动AIM)，总分的结果如图所示(图1)。与6-OHDA组比较，给予L-DOPA后动物的各时间点的各AIM评分均有所增加，给药时间越长，AIM评分逐步增高；而给予ICA治疗，能在一定程度改善大鼠AIM评分，在给药期间，上肢AIM、口面部AIM有下降的趋势，但无统计学差异；轴性AIM和运动AIM在给药第21天与6-OHDA+L-DOPA组比较明显降低，有统计学差异。由此可知，给予淫羊藿苷能够改善长期服用左旋多巴导致的异动症。

2、淫羊藿苷对左旋多巴诱导的异动症大鼠单侧旋转的影响

观察并记录左旋多巴注射结束2h内的旋转行为特点，单侧旋转实验结果如图2所示。与6-OHDA组比较，给予L-DOPA后各时间点的单侧旋转的次数随给药时间的延长旋转次数增加，特别是给予左旋多巴90min后明显增加；而给予ICA治疗，能改善大鼠单侧旋转的行为，与6-OHDA+L-DOPA组比较，旋转次数明显降低，90min及120min两个点有统计学差异。由此可知，给予淫羊藿苷能够改善长期服用左旋多巴导致的大鼠单侧旋转行为改变。

3、淫羊藿苷对左旋多巴诱导的异动症大鼠△FosB表达的影响

异动症的发生与△FOS表达密切相关，其结果如图3。与6-OHDA组的大鼠相比，长期给予左旋多巴，大鼠的△FOS表达会增加，有统计学差异；但是给予淫羊藿苷后，能在一定程度减少△FOS表达，与6-OHDA+L-DOPA组比较，有统计学差异。由此可知，给予淫羊藿苷能减少左旋多巴诱导的异动症大鼠△FOS表达。

4、淫羊藿苷对左旋多巴诱导的异动症大鼠磷酸化ERK1/2的影响

细胞外信号调节激酶(ERK1/2)磷酸化会使△FOS表达增加，其结果如图3。与6-OHDA组的大鼠相比，长期给予左旋多巴，磷酸化ERK1/2表达会增加，有统计学差异；但是给予淫羊藿苷后，能减少ERK1/2的磷酸化，与6-OHDA+L-DOPA组比较，有统计学差异。由此可知，给予淫羊藿苷能够通过减少左旋多巴诱导的异动症大鼠ERK1/2的磷酸化，从而减少△FOS表达。

总结：本发明从整体实验角度，通过AIM评分等方法，验证淫羊藿苷可以延缓或治疗长期服用左旋多巴导致的异动症，改善运动功能。从而证明淫羊藿苷对异动症具有治疗作用，并能延缓其发生和发展。

本发明的有益之处在于：本发明提供的一种淫羊藿苷的应用，即淫羊藿苷在制备预防或治疗左旋多巴诱导的异动症的药物中应用。淫羊藿苷对长期服用左旋多巴诱导的异动症具有防治作用。

(1)在一定程度改善大鼠AIM评分，轴性AIM和运动AIM在给药后明显降低，能够改善长期服用左旋多巴导致的异动症。

(2)能够改善长期服用左旋多巴导致的大鼠单侧旋转行为改变。

(3)能减少左旋多巴诱导的异动症大鼠△FOS表达。

淫羊藿苷既能改善异动症的临床症状，又能延缓异动症出现的时间。不仅对帕金森病的症状有一定的治疗效果，更大的程度上能对长期服用左旋多巴诱导的异动症的延缓或者改善效果，降低了帕金森治疗过程中因药物导致的副作用—异动症，发挥单一化合物与药物的协同作用，治疗帕金森病。适宜在临床中推广使用。

附图说明

图1是本发明的淫羊藿苷对左旋多巴诱导的异动症大鼠AIM评分的影响图

图2是淫羊藿苷对左旋多巴诱导的异动症大鼠单侧旋转的影响图

图3是淫羊藿苷对左旋多巴诱导的异动症大鼠△FosB及磷酸化ERK1/2表达的影响图

图中附图标记的含义：图1：A-轴性AIM,B-上肢AIM，C-口面部AIM，D-运动AIM；图1～图3：与6-OHDA组比较，^*P＜0.05；与6-OHDA+L-DOPA组比较：^#P＜0.05。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步的介绍。

实施例1

淫羊藿苷在制备预防或治疗左旋多巴诱导的异动症的药物中应用。药物是以淫羊藿苷作为活性成分，加入药用载体或赋形剂制成的片剂。片剂通过以下步骤制备：取淫羊藿苷10-400毫克、硬脂酸镁0.1～0.40毫克、羧甲基淀粉钠4～12毫克、微晶纤维素50～100毫克，淫羊藿苷与羧甲基淀粉钠、微晶纤维素混合，过筛，使其混匀，加入适量水或乙醇制粒，干燥后，整粒，加入硬脂酸镁，然后用冲压装置将颗粒压制成片，即得。用量：以淫羊藿苷活性成分计，给药量为5-50mg/kg。

实施例2

淫羊藿苷在制备预防或治疗左旋多巴诱导的异动症的药物中应用。药物是以淫羊藿苷作为活性成分，加入药用载体或赋形剂制成的胶囊剂。胶囊剂通过以下步骤制备：取淫羊藿苷50～400毫克、硬脂酸镁0.1～0.30毫克、羧甲基淀粉钠4～12毫克、淀粉50～100毫克，将淫羊藿苷与羧甲基淀粉钠、淀粉混合均匀，加入适量乙醇制粒，干燥，整粒，加入硬脂酸镁，然后装入明胶胶囊中，即得。用量：以淫羊藿苷活性成分计，给药量为5-50mg/kg。

实施例3

淫羊藿苷在制备预防或治疗左旋多巴诱导的异动症的药物中应用。药物是以淫羊藿苷作为活性成分，加入药用载体或赋形剂制成的颗粒剂。颗粒剂通过以下步骤制备：取淫羊藿苷1～10克、糊精或蔗糖1～10克、矫味剂和甜味剂适量，将淫羊藿苷与蔗糖/糊精、矫味剂和甜味剂混合均匀，加入适量水或乙醇制成软材，过筛制粒，干燥，整粒，分装，即得。用量：以淫羊藿苷活性成分计，给药量为5-50mg/kg。

实施例4

淫羊藿苷在制备预防或治疗左旋多巴诱导的异动症的药物中应用。药物是以淫羊藿苷作为活性成分，加入药用载体或赋形剂制成的软胶囊。软胶囊通过以下步骤制备:取淫羊藿苷10～400毫克、聚乙醇或豆油100～400毫克、助悬剂3～10毫克、乳化剂3～10毫克和明胶50～100毫克、甘油10～20毫克、纯化水50～100毫克及防腐剂适量，将明胶置于溶胶罐中，加入纯化水，70℃下加热使溶解，加入甘油和防腐剂，搅拌均匀，真空除去气泡后保温静置，按比例将淫羊藿苷与聚乙醇/豆油、乳化剂、助悬剂混合均匀，再和制备好的明胶置旋转压囊机，压制成软胶囊，定型，干燥，即得。用量：以淫羊藿苷活性成分计，给药量为5-50mg/kg。

实施例5

淫羊藿苷在制备预防或治疗左旋多巴诱导的异动症的药物中应用。药物是以淫羊藿苷作为活性成分，加入药用载体或赋形剂制成的滴丸。滴丸通过以下步骤制备:取淫羊藿苷1～10毫克、基质20～40毫克、甲基硅油适量，将淫羊藿苷加水制成均匀糊状，再加入溶融的基质液，加热熔融成澄清液体，倒入已预热的滴丸器中，控制滴制温度和速度，滴入甲基硅油冷凝液中，成丸后吸干冷凝液，收集滴丸，置干燥器内，即得。用量：以淫羊藿苷活性成分计，给药量为5-50mg/kg。

实施例6

淫羊藿苷在制备预防或治疗左旋多巴诱导的异动症的药物中应用。药物是以淫羊藿苷作为活性成分，加入药用载体或赋形剂制成的糖浆剂。糖浆剂的制备方法为:取淫羊藿苷1～20克、羧甲基纤维素纳1.5克、糖精钠0.1克、矫味剂适量、防腐剂适量和纯化水100毫升，将羧甲基纤维素纳分散在热水中，冷却，然后与含有淫羊藿苷、糖精钠、矫味剂和防腐剂的含水混悬液混合，将溶液调配成所需体积并混合均匀，灭菌后分装，即得。用量：以淫羊藿苷活性成分计，给药量为5-50mg/kg。

Claims (9)

1.淫羊藿苷在制备预防或治疗左旋多巴诱导的异动症的药物中应用。

2.根据权利要求1所述的淫羊藿苷的应用，其特征在于：所述药物是以淫羊藿苷作为活性成分，加入药用载体或赋形剂制成的片剂、胶囊剂、颗粒剂、软胶囊、滴丸剂或糖浆剂。

3.根据权利要求2所述的淫羊藿苷的应用，其特征在于：所述片剂通过以下步骤制备：取淫羊藿苷10-400毫克、硬脂酸镁0.1～0.40毫克、羧甲基淀粉钠4～12毫克、微晶纤维素50～100毫克，淫羊藿苷与羧甲基淀粉钠、微晶纤维素混合，过筛，使其混匀，加入适量水或乙醇制粒，干燥后，整粒，加入硬脂酸镁，然后用冲压装置将颗粒压制成片，即得。

4.根据权利要求2所述的淫羊藿苷的应用，其特征在于：所述胶囊剂通过以下步骤制备：取淫羊藿苷50～400毫克、硬脂酸镁0.1～0.30毫克、羧甲基淀粉钠4～12毫克、淀粉50～100毫克，将淫羊藿苷与羧甲基淀粉钠、淀粉混合均匀，加入适量乙醇制粒，干燥，整粒，加入硬脂酸镁，然后装入明胶胶囊中，即得。

5.根据权利要求2所述的淫羊藿苷的应用，其特征在于：所述颗粒剂通过以下步骤制备：取淫羊藿苷1～10克、糊精或蔗糖1～10克、矫味剂和甜味剂适量，将淫羊藿苷与蔗糖/糊精、矫味剂和甜味剂混合均匀，加入适量水或乙醇制成软材，过筛制粒，干燥，整粒，分装，即得。

6.根据权利要求2所述的淫羊藿苷的应用，其特征在于：所述软胶囊通过以下步骤制备:取淫羊藿苷10～400毫克、聚乙醇或豆油100～400毫克、助悬剂3～10毫克、乳化剂3～10毫克和明胶50～100毫克、甘油10～20毫克、纯化水50～100毫克及防腐剂适量，将明胶置于溶胶罐中，加入纯化水，70℃下加热使溶解，加入甘油和防腐剂，搅拌均匀，真空除去气泡后保温静置，按比例将淫羊藿苷与聚乙醇/豆油、乳化剂、助悬剂混合均匀，再和制备好的明胶置旋转压囊机，压制成软胶囊，定型，干燥，即得。

7.根据权利要求2所述的淫羊藿苷的应用，其特征在于：所述滴丸通过以下步骤制备:取淫羊藿苷1～10毫克、基质20～40毫克、甲基硅油适量，将淫羊藿苷加水制成均匀糊状，再加入溶融的基质液，加热熔融成澄清液体，倒入已预热的滴丸器中，控制滴制温度和速度，滴入甲基硅油冷凝液中，成丸后吸干冷凝液，收集滴丸，置干燥器内，即得。

8.根据权利要求2所述的淫羊藿苷的应用，其特征在于：所述糖浆剂的制备方法为:取淫羊藿苷1～20克、羧甲基纤维素纳1.5克、糖精钠0.1克、矫味剂适量、防腐剂适量和纯化水100毫升，将羧甲基纤维素纳分散在热水中，冷却，然后与含有淫羊藿苷、糖精钠、矫味剂和防腐剂的含水混悬液混合，将溶液调配成所需体积并混合均匀，灭菌后分装，即得。

9.根据权利要求2～8任一项所述所述的淫羊藿苷的应用，其特征在于：以淫羊藿苷活性成分计，给药量为5-50mg/kg。