CN106755241A - 一种促进骨细胞生长的金枪鱼骨胶原多肽及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种促进骨细胞生长的金枪鱼骨胶原多肽及其制备方法，包括脱钙处理、复合酶鱼骨脱脂酶解及纯化干燥步骤，该制备方法制备得到的金枪鱼骨胶原多肽的分子量为500~2000 Da，接触角为10.0~25.0°其在5~200 μg/mL浓度下可以促进MC3T3‑E1细胞生长。本发明制备工艺科学合理，充分利用水产品加工中未利用的鱼骨为原料，开发具有潜在市场价值的胶原多肽，并采用复合酶脱脂酶解的方法，调节复合酶酶解条件，得到一种可促进骨细胞生长的且安全无毒副作用等优点的金枪鱼骨胶原多肽，提高生产效率，降低能耗，工艺科学合理、易于操作。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种鱼类骨胶原多肽及其制备方法，尤其涉及一种促进骨细胞生长的金枪鱼鱼骨胶原多肽及其制备方法。
背景技术
骨质酥松是人类常见病，由于其严重的危害着人类的健康，所以人们越来越关注骨质酥松的治疗。骨是由有机/无机复合材料即胶原蛋白和羟基磷灰石组成，因此胶原蛋白的流失必然会影响骨中钙的含量。因此提高骨中胶原蛋白的含量是治疗骨质酥松的一个可靠方法。胶原多肽是胶原蛋白在一定条件下水解而得到的水解物。与胶原蛋白相比，胶原多肽的分子量低、水溶解性较好，易被人体吸收。与此同时，胶原蛋白的水解物也具有了更多的生物活性，如：抗氧化性，延缓衰老，补钙促进骨骼发育提高免疫力，促进骨细胞再生等。
目前的胶原水解物主要来源于猪、牛等动物。但是，这些胶原水解物可能存在免疫原性、宗教信仰等问题。随着国内水产加工业的发展，水产加工企业产生的下脚料如鱼头、鱼皮、鱼鳞、鱼骨、鱼鳍等逐年增长。但是，水产加工下脚料的利用并不充分，造成资源浪费。来源于鱼类的胶原水解物无疾病危害且没有宗教限制。
胶原多肽制备的传统工艺可分为三类，即酸法、碱法以及酶法。其基本原理都是根据胶原蛋白的特性，改变蛋白质的外界环境，把胶原蛋白从其他蛋白质中分离出来。酸法和碱法是将胶原蛋白在酸性和碱性环境下提取出来，酸法比较广泛，而碱法报道较少。生物酶法是利用酶反应的温和高效益在一定的环境条件下将胶原蛋白从不同的原料中提取出来。随着酶制剂工业的不断发展与应用领域的不断拓宽，酶制剂产量迅速增长，市场竞争优势不断增加。
在复合酶的选择中，主要选择用胶原酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶。胶原酶酶切位点为脯氨酸与甘氨酸的之间肽键，木瓜蛋白酶应用范围广主要由于其作用位点、切割位点多，如赖氨酸、精氨酸甘氨酸的羧基端；碱性蛋白酶的作用位点则主要以羧基侧为疏水性芳香族氨基酸的肽键；中性蛋白酶的作用位点为羧基侧的亮氨酸、苯丙氨酸的肽键。有研究者认为末端含有甘氨酸、脯氨酸、赖氨酸的氨基酸序列可以显著促进成骨细胞的增长粘附。
金枪鱼是鱼中的名贵品种，是温水鱼。其通过调节自身温度适应环境温度，其胶原蛋白含量较多（36%-54%），是胶原多肽提取的合适原料。本发明从鱼骨中提取胶原多肽，其鱼骨氨基酸中甘氨酸较多，有利于成骨细胞生长。
发明内容
为了克服现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种促进骨细胞生长的金枪鱼骨胶原多肽及其制备方法，本发明制备工艺科学合理，充分利用水产品加工中未利用的鱼骨为原料，开发具有潜在市场价值的胶原多肽，并采用复合酶脱脂酶解的方法，调节复合酶酶解条件，得到一种可促进骨细胞生长的且安全无毒副作用等优点的金枪鱼骨胶原多肽，提高生产效率，降低能耗，工艺科学合理、易于操作。
本发明采用如下技术方案：
一种促进骨细胞生长的金枪鱼骨胶原多肽的制备方法，包括如下步骤：
（1）脱钙处理：将金枪鱼的鱼骨清洗干净并置于酸性溶液中浸泡；
（2）复合酶鱼骨脱脂酶解：将处理后的鱼骨用脂肪酶和蛋白酶复合酶解，酶解温度为30~60℃，酶解5~12小时；酶解液加热到90~95℃灭酶10~15min，热水提取，得到金枪鱼骨胶原多肽溶液；
（3）纯化干燥步骤：过滤，经过冷冻干燥得到金枪鱼骨胶原多肽粉末成品。
进一步的，步骤（1）所述的脱钙处理中，酸性溶液为0.3~0.4wt% 盐酸溶液或者硫酸溶液，浸泡时间为4~24h，优选为5~9h，每1.5h更换一次酸溶液。
进一步的，步骤（1）和步骤（2）之间还包括去除杂蛋白步骤：将脱钙鱼骨置于氯化钠溶液中浸泡后，用去离子水反复清洗，其中所述氯化钠溶液的浓度为2~8wt%，优选3~5wt%，浸泡鱼骨时间为8~14小时，优选10~12小时。
进一步的，所述的复合酶脱脂酶解步骤具体为：将处理后的鱼骨与去离子水按重量比例1:5~20混合，优选1:9~20，调节pH为2~10，基于鱼骨的质量，加入0.1~0.6wt%的脂肪酶和0.25~3.0wt%的蛋白酶，优选为0.3~0.5wt%加入脂肪酶和0.5~2.0wt%的蛋白酶，酶解温度为40~55℃，酶解6~10小时。
进一步的，所述的蛋白酶为胶原酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶中的一种或多种，优选为胶原酶和木瓜蛋白酶。
本发明还保护上述制备方法制备得到的金枪鱼骨胶原多肽，当所述的金枪鱼骨胶原多肽的分子量为500~2000 Da，接触角为10.0~25.0°其在5~200 μg/mL浓度下可以促进MC3T3-E1细胞生长。
本发明调节pH的碱性物质并没有特别限制，置于其水溶液显示碱性即可。优选为无机碱性。无机碱的例子包括但不限于氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂或氢氧化钙。
本发明调节pH的酸性物质并没有特别限制，置于其水溶液显示酸性即可。优选为有机酸或无机酸。有机酸例如醋酸、柠檬酸。本发明的酸性物质更优选为无机酸。无机酸的例子包括但不限于盐酸、硫酸、磷酸或硝酸。
本发明中去除脂肪所用的酶没有特别限制。脂肪酶例如碱性脂肪酶、中性脂肪酶和酸性脂肪酶。
相比现有技术，本发明具有如下有益的技术效果：
（1）本发明选用本发明选用脂肪酶、多种蛋白酶和作为复合酶酶解，通过调控复合酶解条件使末端含有甘氨酸、脯氨酸、赖氨酸的氨基酸序列的胶原多肽很大程度地释放出来，得到高性能的胶原多肽，且大大缩短胶原多肽的提取时间，提高生产效率，降低能耗。
（2）金枪鱼鱼骨酶解得到的不同分子量的胶原多肽，安全、无毒副作用，促进成骨细胞生长作用显著。
（3）充分利用水产品加工中未利用的鱼骨为原料，开发具有潜在市场价值的胶原多肽。
附图说明
图1 为24h、48h、72h不同浓度金枪鱼骨胶原多肽对MC3T3-E1细胞粘附性生长的影响。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及有益效果更加清楚，本发明用以下具体实施例进行说明，但本发明绝非限于这些例子。
实施例1
以金枪鱼鱼骨为原料制备促进成骨细胞生长为例，依次进行如下工艺步骤操作：
（1）脱钙处理：解冻金枪鱼鱼骨，用冷水清洗，室温下，将鱼骨用0.4wt%盐酸溶液中浸泡7.5h，每1.5h更换一次酸液，去除钙盐；再以浓度为4wt%的氯化钠浸泡鱼骨12小时，去除杂蛋白（杂蛋白即为非胶原的蛋白）；
（2）复合酶鱼骨脱脂酶解：将鱼骨清洗干净、沥干，鱼骨与去离子水的重量比例1:10加入去离子水，调节pH为7，按照浓度为0.4wt%加入中性脂肪酶(三酰基甘油酰基水解酶)，按照浓度为0.5wt%加入一种胶原酶，按照浓度为0.5wt%加入木瓜蛋白酶，酶解温度调至50℃，酶解4小时；酶解液加热到90~95℃灭酶15min，得到金枪鱼骨胶原多肽溶液；
（3）纯化干燥步骤：过滤，冷冻干燥后得到成品。
将上述指标方法得到的胶原多肽粉末进行检测，其中分子量范围为600~1300Da，接触角为23°，胶原多肽淡黄色，无腥味。
实施例1制备得到的金枪鱼骨胶原多肽对MC3T3-E1细胞粘附性生长的影响见图1所示，如图展示了不同浓度的胶原多肽（5μg/mL, 100μg/mL, 200μg/mL）在24h, 48h, 72h时促进MC373-E1细胞粘附增殖情况，从图中可以看出随着多肽浓度的增加，细胞增殖效果更加明显，而control组（0μg/mL）增殖效果并不明显。可见，实施例1制备得到的金枪鱼骨胶原多肽可促进MC3T3-E1细胞生长。
实施例2
以金枪鱼鱼骨为原料制备促进成骨细胞生长为例，依次进行如下工艺步骤操作：
（1）脱钙处理：解冻金枪鱼鱼骨，用冷水清洗，室温下，将鱼骨用0.5wt%盐酸溶液中浸泡6h，每1.5h更换一次酸液，去除钙盐；再以浓度为6wt%的氯化钠浸泡鱼骨10小时，去除杂蛋白（杂蛋白即为非胶原的蛋白）；
（2）复合酶鱼骨脱脂酶解：将鱼骨清洗干净、沥干，鱼骨与去离子水的重量比例1:10加入去离子水，调节pH为9，按照浓度为0.4wt%加入碱性性脂肪酶(三酰基甘油酰基水解酶)，按照浓度为0.5wt%加入碱性蛋白酶（Novo型丝氨酸蛋白酶），酶解温度调至50℃，酶解3小时；酶解液加热到90~95℃灭酶15min，得到金枪鱼骨胶原多肽溶液；
（3）纯化干燥步骤：过滤，冷冻干燥后得到成品。
将上述指标方法得到的金枪鱼骨胶原多肽粉末进行检测，其中分子量范围为700~1500Da，接触角为14.5°，胶原多肽淡黄色，无腥味。经检测，与实施例1类似，其也可促进MC3T3-E1细胞生长。
尽管通过参照本发明的优选实施例，已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
Claims (6)
1.一种促进骨细胞生长的金枪鱼骨胶原多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）脱钙处理：将金枪鱼的鱼骨清洗干净并置于酸性溶液中浸泡；
（2）复合酶鱼骨脱脂酶解：将处理后的鱼骨用脂肪酶和蛋白酶复合酶解，酶解温度为30~60℃，酶解5~12小时；酶解液加热到90~95℃灭酶10~15min，热水提取，得到金枪鱼骨胶原多肽溶液；
（3）纯化干燥步骤：过滤，经过冷冻干燥得到金枪鱼骨胶原多肽粉末成品。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述的脱钙处理中，酸性溶液为0.3~0.4wt% 盐酸溶液或者硫酸溶液，浸泡时间为4~24h，优选为5~9h，每1.5h更换一次酸溶液。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）和步骤（2）之间还包括去除杂蛋白步骤：将脱钙鱼骨置于氯化钠溶液中浸泡后，用去离子水反复清洗，其中所述氯化钠溶液的浓度为2~8wt%，优选3~5wt%，浸泡鱼骨时间为8~14小时，优选10~12小时。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的复合酶脱脂酶解步骤具体为：将处理后的鱼骨与去离子水按重量比例1:5~20混合，优选1:9~20，调节pH为2~10，基于鱼骨的质量，加入0.1~0.6wt%的脂肪酶和0.25~3.0wt%的蛋白酶，优选为0.3~0.5wt%加入脂肪酶和0.5~2.0wt%的蛋白酶，酶解温度为40~55℃，酶解6~10小时。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的蛋白酶为胶原酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶中的一种或多种，优选为胶原酶和木瓜蛋白酶。
6.权利要求1-5中任一项所述的制备方法制备得到的金枪鱼骨胶原多肽，其特征在于，当所述的金枪鱼骨胶原多肽的分子量为500~2000 Da，接触角为10.0~25.0°其在5~200 μg/mL浓度下可以促进MC3T3-E1细胞生长。
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