CN107523600A - 促进人成骨细胞增殖的骨胶原多肽的制备方法与用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种促进人成骨细胞增殖的骨胶原多肽的制备方法，包括：步骤一、将骨原料进行脱脂、脱钙，然后用乙酸溶解，收集上清液；步骤二、向步骤一得到的上清液中加入0.7～1.2mol/L的NaCl溶液进行盐析，离心，收集沉淀；步骤三、将步骤三得到的沉淀用乙酸溶解，并放入通量为10～14kDa的透析袋中透析，收集透析袋内的骨胶原蛋白；步骤四、向步骤三得到的骨胶原蛋白中加入2～5mg/mL的碱性蛋白酶，收集酶解液；步骤五、将步骤四得到的酶解液装入通量为1kDa的透析袋，并放入水中透析，收集透析液，并冻干。本发明还提供了骨胶原多肽的用途。本发明对人成骨细胞的增殖具有显著的促进作用。
Description
技术领域
本发明涉及骨加工技术领域。更具体地说，本发明涉及一种促进人成骨细胞增殖的骨胶原多肽的制备方法。
背景技术
我国的可食性骨资源丰富，目前我国畜禽骨年产量高达1200多万吨，占世界产量的1/3，折合约200万吨动物蛋白，可满足7500万人的年蛋白需求。我国马上步入老龄化社会，骨质疏松症成为老年人面对最大的慢性威胁病症。在人口压力与养殖环境承载力有限的条件下，加强对骨资源的综合开发利用，具有重要的经济、社会与环境效益。
研究表明，胶原多肽具有明显的增强骨密度、促进骨生长发育、改善骨质疏松的作用，其补钙效果优于常规补钙剂，在帮助钙吸收方面起重要作用。通过口服胶原蛋白肽证明吸收循环后能够在软骨积累，而且刺激软骨细胞分泌胶原蛋白肽，有助于骨关节病的的治疗，每日摄入一定量的胶原蛋白肽可以增加骨密度，减少膝关节或髋关节等骨关节炎患者的疼痛，同时血液中的羟脯氨酸含量增加，而且无副作用。肽段的组成特异性，如肽段的类型，不同浓度与作用之间的联系，以及氨基酸等其他小分子物质的协同作用均为影响肽段活性的重要因素。有研究采用牛骨胶原蛋白肽用于人成骨细胞的培养，通过对人成骨细胞的形态学观察和茜素红染色矿化钙节，证明一定浓度的胶原蛋白肽对人成骨细胞的的增殖有明显的的作用。但是并未提及分子量大小的多肽对其增殖作用的差别。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种促进人成骨细胞增殖的骨胶原多肽的制备方法，其得到的骨胶原多肽能够明显促进人成骨细胞的增殖。
本发明的一个目的是提供一种骨胶原多肽的用途，用于制备促进人成骨细胞增殖的食品、药品或保健品。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种促进人成骨细胞增殖的骨胶原多肽的制备方法，包括：
步骤一、将骨原料进行脱脂、脱钙，然后用乙酸溶解，收集上清液；
步骤二、向步骤一得到的上清液中加入0.7～1.2mol/L的NaCl溶液进行盐析，离心，收集沉淀；
步骤三、将步骤三得到的沉淀用乙酸溶解，并放入通量为10～14kDa的透析袋中透析，收集透析袋内的骨胶原蛋白；
步骤四、向步骤三得到的骨胶原蛋白中加入2～5mg/mL的碱性蛋白酶，收集酶解液；
步骤五、将步骤四得到的酶解液装入通量为1kDa的透析袋，并放入水中透析，收集透析液，并冻干。
优选的是，所述的促进人成骨细胞增殖的骨胶原多肽的制备方法，将骨原料粉碎至粒度为10～20毫米，然后进行脱脂、脱钙。
优选的是，所述的促进人成骨细胞增殖的骨胶原多肽的制备方法，所述脱脂的方法包括：向粉碎后的骨原料加入10倍体积的脱脂剂，然后震摇，脱脂剂每隔6h更换一次；所述脱脂剂为正己烷与丙酮的混合溶液，正己烷的体积分数为10％。
优选的是，所述的促进人成骨细胞增殖的骨胶原多肽的制备方法，所述脱钙的方法包括：向经脱脂处理的骨原料中加入10倍体积的脱钙剂，并震摇；所述脱钙剂为0.25mol/L的EDTA溶液。
优选的是，所述的促进人成骨细胞增殖的骨胶原多肽的制备方法，在所述步骤一中，向经过脱脂、脱钙的骨原料中加入10倍体积的乙酸溶液，震摇24h～5d，使用的乙酸溶液的浓度为0.5mol/L。
优选的是，所述的促进人成骨细胞增殖的骨胶原多肽的制备方法，在所述步骤三中，将沉淀用0.5mol/L乙酸溶解，装入通量为12kDa的透析袋，先用0.1mol/L的乙酸透析2d，然后用蒸馏水透析2d，每隔12h换一次乙酸或蒸馏水。
优选的是，所述的促进人成骨细胞增殖的骨胶原多肽的制备方法，在所述步骤四中，向骨胶原蛋白中加入2mg/mL的碱性蛋白酶，在pH为8、温度为40℃的条件下酶解1h。
优选的是，所述的促进人成骨细胞增殖的骨胶原多肽的制备方法，在所述步骤二中，NaCl溶液的浓度为0.8mol/L。
优选的是，所述的促进人成骨细胞增殖的骨胶原多肽的制备方法，将步骤四得到的酶解液装入通量为1kDa透析袋中，放入纯水中透析72h，收集透析液，然后再将该透析袋放入纯水中透析72h，合并两次透析的透析液，冻干。
优选的是，所述的促进人成骨细胞增殖的骨胶原多肽的制备方法得到的骨胶原多肽的用途，用于制备促进人成骨细胞增殖的食品、药品或保健品。
本发明至少包括以下有益效果：
1、本发明得到的骨胶原多肽对人成骨细胞的增殖作用明显好于用其它方法得到的骨胶原多肽。
2、本发明的脱脂剂脱脂效果好、易去除、残留小，脱钙剂脱钙效果好，且不会对有机成份形成损伤。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1：本发明的工艺流程；
图2：不同盐浓度对胶原蛋白得率的影响；
图3：相同酶浓度和活度条件下得到的胶原多肽含量；
图4：实施例1的胶原蛋白肽浓度对人成骨细胞增殖的影响；
图5：实施例1的胶原蛋白肽浓度对人成骨细胞增殖率的影响；
图6：对比例1的胶原蛋白肽浓度对人成骨细胞增殖的影响；
图7：对比例1的胶原蛋白肽浓度对人成骨细胞增殖率的影响；
图8：对比例2的胶原蛋白肽浓度对人成骨细胞增殖的影响；
图9：对比例2的胶原蛋白肽浓度对人成骨细胞增殖率的影响；
图10：不同的胶原多肽在最佳浓度下对人成骨细胞增殖率影响。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
1、脱脂条件选择
表1不同脱脂剂脱脂效果比较
由表1可知，三种脱脂剂处理后，乙醚表现出最佳的脱脂效果，与其他研究者实验验结果类似，正丁醇的脱脂效果相对最低。但乙醚具有麻醉性，对人体有一定影响，而正己烷的脱脂效果与乙醚相近，且易去除残留小，综上选择10％正己烷作为牛骨胶原蛋白提取的脱脂剂。
2、脱钙条件选择
表2不同脱钙剂对胶原蛋白得率的影响
经过脱脂后的骨料所含无机物高达68％以上，需要脱除后才能获得较纯的胶原蛋白，由于无机矿物的主要成分是磷酸钙与碳酸钙，生产中常常采用盐酸或磷酸作为脱钙剂。由表2可知，在同等浓度条件下EDTA的脱钙效果均优于HCl，由于HCl与骨钙反应速度受HCl浓度影响较大，而且高浓度的HCl会对有机成分形成损伤，而EDTA作为二价金属螯合剂能够与骨钙形成稳定的螯合物。0.50mol/L EDTA作为脱钙剂时，胶原蛋白的得率最高，0.25mol/L EDTA的得率略低于0.50mol/L EDTA组，本试验选择0.25mol/L EDTA作为牛骨胶原蛋白提取的脱钙剂。
3、盐析浓度选择
采用2.6mol/L的NaCl浓度，通过冷冻干燥获得牛骨Ⅰ型胶原蛋白。由图2可知，随着NaCl浓度的增大，胶原蛋白得率呈现先增大后降低，在NaCl浓度>0.9mol/L后又出现增大趋势；当NaCl浓度为0.9mol/L时，胶原蛋白得率显著高于其他各组(P<0.05)。因此本试验选择0.9mol/L NaCl作为牛骨胶原蛋白提取的盐析浓度。
4、酶的优化
如图3所示，经过方差分析表明在相同酶浓度条件下，所测得的多肽浓度排序为风味蛋白酶＞复合蛋白酶＞胰蛋白酶＞碱性蛋白酶＞中性蛋白酶＞木瓜蛋白酶。而相同酶活度条件下，多肽浓度排序为碱性蛋白酶＞风味蛋白酶＞复合蛋白酶＞中性蛋白酶＞胰蛋白酶＞木瓜蛋白酶。通过两步实验，筛选碱性蛋白酶对于胶原蛋白的酶解效果为最佳。
实施例1
本发明提供了一种促进人成骨细胞增殖的骨胶原多肽的制备方法，包括：
步骤一、将牛骨原料进行脱脂、脱钙，然后用乙酸溶解，收集上清液；
步骤二、向步骤一得到的上清液中加入0.8mol/L的NaCl溶液进行盐析，离心，收集沉淀；
步骤三、将步骤三得到的沉淀用0.5mol/L乙酸溶解，装入通量为12kDa的透析袋，先用0.1mol/L的乙酸透析2d，然后用蒸馏水透析2d，每隔12h换一次乙酸或蒸馏水，收集透析袋内的骨胶原蛋白；
步骤四、向步骤三得到的骨胶原蛋白中加入2mg/mL的碱性蛋白酶，在pH为8、温度为40℃的条件下酶解1h，收集酶解液。
步骤五、将步骤四得到的酶解液装入通量为1kDa的透析袋，放入纯水中透析72h，收集透析液，然后再将该透析袋放入纯水中透析72h，合并两次透析的透析液，冻干。
将骨原料粉碎至粒度为10～20毫米，然后进行脱脂、脱钙。
所述脱脂的方法包括：向粉碎后的骨原料加入10倍体积的脱脂剂，然后震摇，脱脂剂每隔6h更换一次；所述脱脂剂为正己烷与丙酮的混合溶液，正己烷的体积分数为10％。
所述脱钙的方法包括：向经脱脂处理的骨原料中加入10倍体积的脱钙剂，并震摇；所述脱钙剂为0.25mol/L的EDTA溶液。
在所述步骤一中，向经过脱脂、脱钙的骨原料中加入10倍体积的乙酸溶液，震摇24h～5d，使用的乙酸溶液的浓度为0.5mol/L。
对比例1
将实施1中的剩余溶液用通量为2kDa的透析袋，放入纯水中进行透析72h两次，收集两次透析液冻干，得到＜2kDa的多肽，其余参数与实施例1中的完全相同，工艺过程也完全相同。
对比例2
将对比例1中的剩余溶液用通量为2kDa的透析袋，放入纯水中进行透析72h两次，收集两次透析液冻干，得到＜4kDa的多肽，其余参数与实施例1中的完全相同，工艺过程也完全相同。
试验
1、细胞铺板
细胞接种、传代后，待细胞密度达80～90％，在生物安全柜内弃去原培养液，PBS清洗一遍，弃掉PBS，加入2mL TE将细胞消化，轻轻拍打皿壁，使细胞从培养皿底部散落，加入4mL培养基终止消化，转入15mL离心管中，800rpm离心5min。生物安全柜内，弃去上清液，加入2mL DMEM/F12完全培养基，轻轻吹吸均匀，使用血球计数板测细胞原液浓度。
用DMEM/F12完全培养基将细胞稀释至8×103个/孔，使用12排手动移液器将其转入96孔细胞培养板，100μL/孔，周围孔加入等体积的PBS封边。置于37℃、5％CO2培养箱内继续培养。
2、次日细胞加多肽
待96孔细胞培养板中细胞贴壁后，生物安全柜内，配制实施例1、对比例1和对比例2得到的骨胶原多肽溶液各六组，浓度分别为0、12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL的待测样品，弃掉原培养液，加入各组待测样品，设置5个复孔，100μL/孔，置于37℃、5％CO2培养箱内继续培养。
3、MTT检测
分别于加入待测样品后第24h、48h、72h、96h、120h各加入5×MTT溶液，20μL/孔，置于37℃、5％CO2培养箱内继续培养4h；取出96孔板，吸去旧培养液，加入150μL/孔DMSO。放于酶标仪中，振荡30s，使得甲瓒结晶充分溶解；测定OD 492处吸收值。
4、实施例1的不同浓度的胶原多肽对人成骨细胞增殖的影响
在不同浓度的实施例1的样品分别作用于人成骨细胞，MTT检测发现人成骨细胞与CN组对比，实施例1的胶原多肽对人成骨细胞增殖具有明显的促进作用。而在50μg/mL(YBCP牛骨胶原多肽)浓度生长在3d，4d，5d后吸光度值出现拐点显著促进细胞增殖活动(P＜0.01)。而随着胶原蛋白肽浓度增加，细胞生长出现抑制，如图4。从人成骨细胞的增殖率，图5可以看出在50μg/mL浓度时，第3d，4d，5d同样表现出拐点规律。由此，实施例1的胶原多肽对于人成骨细胞最适生长浓度为50μg/mL。
5、对比例1的不同浓度对人成骨细胞增殖的影响
在不同浓度的对比例1的样品分别作用于人成骨细胞，MTT检测发现人成骨细胞与CN组对比，对比例1的胶原多肽对人成骨细胞增殖同样具有明显的促进作用。在100μg/mL浓度生长在4d，5d后吸光度值出现拐点，显著促进细胞增殖活动(P＜0.01)。而随着胶原蛋白肽浓度增加到200μg/mL，细胞生长出现抑制，如图6。从图7可以看出在100μg/mL浓度时，第4d，5d出现同样规律。由此，实施例1的胶原蛋白肽对于人成骨细胞最适生长浓度为100μg/mL。
6、对比例2的不同浓度的胶原蛋白肽对人成骨细胞增殖的影响
在不同浓度的对比例2样品分别作用于人成骨细胞，MTT检测发现人成骨细胞在与CN组对比，对比例2的胶原多肽对人成骨细胞增殖同样具有明显的促进作用。而与前两组不同的是，随着浓度的增大对人成骨细胞的抑制作用更加明显。在25μg/mL浓度生长在5d后吸光度值出现拐点，而随着胶原蛋白肽浓度增加到200μg/mL，细胞生长出现抑制，如图8。从图9可以看出，在25μg/mL浓度时，第5d出现同样规律。由此，根据分析，2～4kDa的胶原蛋白肽对于人成骨细胞最适生长浓度为25μg/mL。
7、如图10所示，实施例1、对比例1和对比例2得到的胶原多肽均在最适浓度下，实施例1表现的规律性最强，随着时间延长，增殖表现为正相关。
总之，相比于对比例1和对比例2，实施例1的骨胶原多肽对于人成骨细胞的增殖作用最明显，适合用于制备促进人成骨细胞增殖的食品、药品或保健品。。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
Claims (10)
1.一种促进人成骨细胞增殖的骨胶原多肽的制备方法，其特征在于，包括：
步骤一、将骨原料进行脱脂、脱钙，然后用乙酸溶解，收集上清液；
步骤二、向步骤一得到的上清液中加入0.7～1.2mol/L的NaCl溶液进行盐析，离心，收集沉淀；
步骤三、将步骤三得到的沉淀用乙酸溶解，并放入通量为10～14kDa的透析袋中透析，收集透析袋内的骨胶原蛋白；
步骤四、向步骤三得到的骨胶原蛋白中加入2～5mg/mL的碱性蛋白酶，收集酶解液；
步骤五、将步骤四得到的酶解液装入通量为1kDa的透析袋，并放入水中透析，收集透析液，并冻干。
2.如权利要求1所述的促进人成骨细胞增殖的骨胶原多肽的制备方法，其特征在于，将骨原料粉碎至粒度为10～20毫米，然后进行脱脂、脱钙。
3.如权利要求2所述的促进人成骨细胞增殖的骨胶原多肽的制备方法，其特征在于，所述脱脂的方法包括：向粉碎后的骨原料加入10倍体积的脱脂剂，然后震摇，脱脂剂每隔6h更换一次；所述脱脂剂为正己烷与丙酮的混合溶液，正己烷的体积分数为10％。
4.如权利要求3所述的促进人成骨细胞增殖的骨胶原多肽的制备方法，其特征在于，所述脱钙的方法包括：向经脱脂处理的骨原料中加入10倍体积的脱钙剂，并震摇；所述脱钙剂为0.25mol/L的EDTA溶液。
5.如权利要求4所述的促进人成骨细胞增殖的骨胶原多肽的制备方法，其特征在于，在所述步骤一中，向经过脱脂、脱钙的骨原料中加入10倍体积的乙酸溶液，震摇24h～5d，使用的乙酸溶液的浓度为0.5mol/L。
6.如权利要求1所述的促进人成骨细胞增殖的骨胶原多肽的制备方法，其特征在于，在所述步骤三中，将沉淀用0.5mol/L乙酸溶解，装入通量为12kDa的透析袋，先用0.1mol/L的乙酸透析2d，然后用蒸馏水透析2d，每隔12h换一次乙酸或蒸馏水。
7.如权利要求1所述的促进人成骨细胞增殖的骨胶原多肽的制备方法，其特征在于，在所述步骤四中，向骨胶原蛋白中加入2mg/mL的碱性蛋白酶，在pH为8、温度为40℃的条件下酶解1h。
8.如权利要求1所述的促进人成骨细胞增殖的骨胶原多肽的制备方法，其特征在于，在所述步骤二中，NaCl溶液的浓度为0.8mol/L。
9.如权利要求1所述的促进人成骨细胞增殖的骨胶原多肽的制备方法，其特征在于，将步骤四得到的酶解液装入通量为1kDa透析袋中，放入纯水中透析72h，收集透析液，然后再将该透析袋放入纯水中透析72h，合并两次透析的透析液，冻干。
10.一种如权利要求1所述的促进人成骨细胞增殖的骨胶原多肽的制备方法得到的骨胶原多肽的用途，其特征在于，用于制备促进人成骨细胞增殖的食品、药品或保健品。
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