CN110950930B - 骨肽及其成骨生理活性确证方法与用途 - Google Patents

骨肽及其成骨生理活性确证方法与用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种骨肽的成骨生理活性确证方法，包括：预测骨肽潜在致敏性，分析骨肽的抗原免疫性；建立并模拟机体胃部微环境模型，分析骨肽在胃部消化特性；建立并模拟机体肠部微环境模型，分析骨肽在肠部消化特性；建立并模拟机体Caco‑2小肠上皮细胞单层膜吸收模型，考查骨肽在小肠上皮细胞的可运载特性；分析其对Wnt/β‑catenin通路的影响。若骨肽无抗原免疫性，对胃肠部消化具有一定耐受性，可经过在小肠上皮细胞运载至作用靶点，可激活机体内Wnt/β‑catenin信号通路，则能用于功能食品中。本发明具有较好的预测和评价多肽的成骨生理活性的能力，可为指导今后利用畜禽骨胶原蛋白肽开发生物活性功能食品提供理论依据。

Description

骨肽及其成骨生理活性确证方法与用途
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种骨肽，特别涉及一种骨肽的成骨生理活性确证方法，更涉及骨肽的用途。
背景技术
随着我国进入老龄化社会，居民骨质疏松症的发病率也呈逐年上升的态势，骨质疏松症所诱发的机体骨折不仅增加了老年人病残率和病死率，也加重了社会经济负担，已成为一个严重的公众健康问题。骨质疏松症是一种以骨质量减少、骨显微结构发生退化、骨脆性增加为特征的全身性机体骨代谢性疾病。临床上，治疗骨质疏松症药物包括利塞膦酸盐、对苯二甲酸、阿仑膦酸、二磷酸盐、唑来膦酸、特立帕肽等，但服用这些药物往往存在诸如食道发炎、恶心、腹痛甚至有罹患生殖系统癌变的副作用，其潜在的毒性和副作用在一定程度上限制了大范围应用。因此，寻找能够促进骨形成和逆转骨结构损伤的更安全、食物源的天然替代品正受到越来越多的关注。
畜禽骨中含有丰富的胶原蛋白(主要为I型，含量约占动物鲜骨重的20％)，胶原蛋白是一种独特的结构蛋白，研究表明补充胶原蛋白肽可以增加骨胶原纤维网架的规则性和牢固性，促进钙盐有序沉积，增加骨强度和骨密度，是一种潜在的抗骨质疏松活性肽的理想来源。然而，畜禽来源蛋白质和多肽类食品对人体可能有潜在的毒性和致敏性，这会对人体健康带来不利影响，很大程度上影响消费者认可和食用。已有研究表明，蛋白经水解后产生的多肽通常不具有毒性，且相较亲本蛋白质更不具有致敏性。然而，也有部分报道小分子肽仍保留天然蛋白的部分致敏原性，具有潜在致敏性。因此，在考虑应用生物活性多肽作为功能食品添加剂的同时，明确其潜在毒性及致敏性显得尤为重要。
蛋白质和多肽类食品在食用过程中往往会被广泛降解，随着进入小肠，又会被小肠上皮细胞上各种蛋白酶进一步水解，最终水解为较小的肽段并释放至细胞间质被吸收。已有研究报道，较大分子量肽段也可伴随血液循环并最终被吸收，但这部分剂量相对较低，其消化吸收机制仍不明晰。通常情况吓，生物活性物质在经胃肠消化后，其结构和功能会发生一定改变，甚至失去生物活性，因此，大多数生物活性物质进入体内后往往无法发挥其原有(体外)生物活性功能。如何系统评价和确认骨肽的成骨生理活性，以促进其开发和利用，是目前本领域的研究热点之一。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
本发明再有一个目的是提供一种骨肽。
本发明还有一个目的是提供一种骨肽的成骨生理活性确证方法，克服现有评价骨肽在机体成骨生理活性确证方法研究相对匮乏的缺点。本发明基于生物信息学、胃肠道消化模型、Caco-2小肠上皮细胞吸收模型等系统研究骨肽的消化吸收特性评价及调控细胞通路的确证方法，从而较好的预测和评价多肽的成骨生理活性的能力，为指导今后利用畜禽骨胶原蛋白肽开发生物活性功能食品提供理论依据。
本发明还有一个目的是提供骨肽的用途。
为此，本发明提供的技术方案为：
一种骨肽，所述骨肽具有成骨活性，所述骨肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
一种骨肽的成骨生理活性确证方法，包括依次进行的如下步骤：
步骤一、利用生物信息学方法预测骨肽的潜在致敏性，分析骨肽的抗原免疫性；
步骤二、建立并模拟机体胃部微环境模型，分析骨肽在胃部消化特性；
步骤三、建立并模拟机体肠部微环境模型，分析骨肽在肠部消化特性；
步骤四、建立并模拟机体Caco-2小肠上皮细胞单层膜吸收模型，分析骨肽在小肠上皮细胞的可运载特性；
步骤五、分析所述骨肽对Wnt/β-catenin通路的影响；
若所述骨肽能够满足无抗原免疫性，且对胃肠部消化具有一定耐受性，可经过在小肠上皮细胞运载至作用靶点(可运载性)，且可激活机体内Wnt/β-catenin信号通路，则该骨肽能用于功能食品中。
优选的是，所述的骨肽的成骨生理活性确证方法中，所述步骤二中，建立并模拟机体胃部微环境模型的具体步骤包括：首先配置骨肽溶液，之后将骨肽溶液置于37℃恒温水环境中，然后调节骨肽溶液pH至2.0，再向其中加入胃蛋白酶，启动模拟体外胃部消化，同时磁力搅拌器搅拌，模拟胃部蠕动一段时间，最后取出部分消化液A作为样本，分析该骨肽在胃部的消化特性。
优选的是，所述的骨肽的成骨生理活性确证方法中，所述步骤三中，建立并模拟机体肠部微环境模型的具体步骤包括：首先将步骤二中剩余的溶液的pH调节至7.5，之后按照酶与底物质量比1:50向其中加入胰液素，启动模拟体外肠道消化，同时磁力搅拌器搅拌，模拟肠部蠕动一段时间，最后取出部分消化液B作为样本，分析该骨肽在肠部的消化特性。
优选的是，所述的骨肽的成骨生理活性确证方法中，所述步骤四中，建立并模拟机体Caco-2小肠上皮细胞单层膜吸收模型的具体步骤包括：
首先将Caco-2细胞细胞悬浮液，接种至培养小室，向培养小室顶侧AP加入细胞悬液，向培养小室底侧加入完全培养基，培养一段时间后，测定跨膜电阻值，以跨膜电阻值为参考指标，连续培养细胞12～15天直至跨膜电阻值达到最大值时，表明Caco-2小肠上皮细胞单层膜吸收模型构建成功；
Caco-2细胞单层膜模型构建成功后，进行骨肽的吸收转运试验：用HBSS缓冲液清洗细胞单层膜2次，分别向AP、BP两侧加入0.5mL、1.5mL含0.05％DMSO的HBSS缓冲液，然后于体积比5％CO2、95％空气和温度37℃恒温培养30min，然后除去缓冲液，向AP侧加入0.5mL10mM骨肽，BL侧加入1.5mL含0.05％DMSO的HBSS缓冲液，继续于体积比5％CO2、95％空气和温度37℃恒温培养；
其余组，在加入骨肽之前，首先向AP、BP侧分别加入0.5mL、1.5mL与细胞吸收转运相关通路促进剂和抑制剂：浓度为0.5μg/mL的细胞松弛素D、500nM的渥曼青霉素、25mM的Gly-Sar，以分析其吸收转运机制，同样培养30min后，除去缓冲液，再分别向AP侧加入0.5mL10mM骨肽溶液，向BP侧加入1.5mL含0.05％DMSO的HBSS缓冲液，2h后从BL侧取样100μL，放置-20℃保存用于检测。
优选的是，所述的骨肽的成骨生理活性确证方法中，还包括对骨肽进行序列分析以获得其序列的步骤；
所述步骤一中，利用AlgPred在线数据库预测骨肽的潜在致敏性；步骤二中，胃蛋白酶与骨肽的质量比为1:50，胰液素与骨肽的质量比也为1:50。
优选的是，所述的骨肽的成骨生理活性确证方法中，所述胃部微环境模型于胃部模拟容器中进行，所述胃部模拟容器包括外周壁和与所述外周壁封闭连接的底部，所述外周壁由柔性材料制成，在所述外周壁上相对的两侧设置有一对挤压部，所述挤压部配置成通过同时对其进行压缩操作，而使所述外周壁在其径向上扁平化，于所述外周壁内沿其径向设置有复位弹簧，所述复位弹簧的两端对应于所述一对挤压部的位置处固定于所述外周壁的内侧，其中，所述外周壁在俯视观察下的形状呈椭圆形，所述一对挤压部和复位弹簧沿椭圆的长轴设置，且所述一对挤压部和复位弹簧位于所述胃部模拟容器的下侧，在竖直方向上距离所述底部的高度不超过所述胃部模拟容器总高度的1/3。本发明的胃部模拟容器的外周壁采用柔性材质，且设置有挤压部和复位弹簧，可根据需要按压挤压部使其模拟胃部蠕动，从而能够更好地模拟胃部的实际工作环境，以利于取得更加真实的结果。
优选的是，所述的骨肽的成骨生理活性确证方法中，步骤五中，基于Real-timeqPCR和Western blot方法分析所述骨肽对Wnt/β-catenin通路存在的影响，其中，Real-time qPCR中检测基因的引物包含如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的引物对，如SEQ IDNO：4和SEQ ID NO：5所示的引物对，SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：6所示的引物对，SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示的引物对，SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示的引物对，如SEQ IDNO：12和SEQ ID NO：13所示的引物对，SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15所示的引物对，SEQ IDNO：16和SEQ ID NO：17所示的引物对，SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19所示的引物对。
所述的骨肽在科学研究或成骨研究活性功能食品制作中的用途。
本发明至少包括以下有益效果：
本发明率先通过生物信息学、胃肠道消化模型、Caco-2小肠上皮细胞吸收模型，系统研究其体外致敏性、消化、吸收、转运及成骨活性作用机制确证方法，从而明确其作为成骨活性功能食品添加剂的潜在可行性。在考虑应用骨肽作为成骨活性功能食品添加剂的同时，系统评价了其是否具有抗原免疫性、胃肠消化稳定性、可运载性及靶向成骨活性功能。本发明的方法具有较好的预测和评价多肽的成骨生理活性的能力，可为指导今后利用畜禽骨胶原蛋白肽开发生物活性功能食品提供理论依据。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1A为本发明其中一个实施例中构建的胃肠道消化吸收模型示意图；图1B为俯视观察下的胃部模拟容器的结构示意图；
图2本发明其中一个实施例中构建的Caco-2细胞单层膜转运模型示意图；
图3为本发明其中一个实施例中的骨肽经模拟胃肠道消化吸收后组分分析图；
图4为本发明其中一个实施例中的骨肽经Caco-2细胞内肽酶消化后组分分析图；
图5A为本发明其中一个实施例中的骨肽可能的三种转运机制条件下表观吸收系数比较分析图；
图5B为本发明其中一个实施例中的骨肽跨Caco-2细胞单层膜转运机制分析图；
图6A为本发明其中一个实施例中的骨肽对成骨细胞增殖相关基因表达量的影响；
图6B为本发明其中一个实施例中的骨肽对成骨细胞Wnt/β-catenin通路相关基因表达量的影响；
图6C为本发明其中一个实施例中的骨肽对成骨细胞增殖相关基因蛋白表达的Western blot电泳图；
图6D为本发明其中一个实施例中的骨肽对成骨细胞增殖相关基因蛋白表达量的影响；
图6E为本发明其中一个实施例中的骨肽对成骨细胞Wnt/β-catenin通路相关基因蛋白表达的Western blot电泳图；
图6F为本发明其中一个实施例中的骨肽对成骨细胞Wnt/β-catenin通路相关基因蛋白表达量的影响；
图7为本发明其中一个实施例中的骨肽促成骨细胞增殖活性机制分析图；
图8为本发明其中一个实施例中骨肽的制备及成骨生理活性确认方法的流程示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
申请人实验室从牛骨中分离、纯化制备得到较高纯度的牛骨胶原蛋白肽，并对其氨基酸序列进行结构鉴定，构建了促成骨细胞增殖活性(成骨活性)肽库，依据与靶点蛋白结合力类型、结合位点氨基酸残基个数和种类明确了成骨活性肽氨基酸序列结构特征。然而，牛骨胶原蛋白肽的促成骨细胞增殖生理活性取决于其完整到达靶点的能力，目前尚未见系统评价和确证骨肽的成骨生理活性研究报道，极大地限制了其开发和利用。
本发明提供一种骨肽，所述骨肽具有成骨活性，所述骨肽的氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示。
本发明提供一种骨肽的成骨生理活性确证方法，包括：
一种骨肽的成骨生理活性确证方法，包括依次进行的如下步骤：
步骤一、利用生物信息学方法预测骨肽的潜在致敏性，分析骨肽的抗原免疫性；
步骤二、建立并模拟机体胃部微环境模型，分析骨肽在胃部消化特性；
步骤三、建立并模拟机体肠部微环境模型，分析骨肽在肠部消化特性；
步骤四、建立并模拟机体Caco-2小肠上皮细胞单层膜吸收模型，分析骨肽在小肠上皮细胞的可运载特性；
步骤五、分析所述骨肽对Wnt/β-catenin通路的影响。
若所述骨肽能够满足较低抗原免疫性，对胃肠部消化具有一定耐受性，可经过在小肠上皮细胞运载至作用靶点(可运载性)，且可激活机体内Wnt/β-catenin信号通路，则该骨肽能用于功能食品中。
如图1所示，胃液装置1和肠液装置2可通过各自的导管3、4连通至放置于磁力搅拌装置上的胃部模拟容器或肠部模拟容器中，打开流量开关5即可实现液体流动，从而建立好机体胃部微环境模型和机体肠部微环境模型，通过pH探针6可测定溶液的pH，反应装置中设置有转子7。
本发明率先通过生物信息学、胃肠道消化模型、Caco-2小肠上皮细胞吸收模型，系统研究其体外致敏性、消化、吸收、转运及成骨活性作用机制确证方法，从而明确其作为成骨活性功能食品添加剂的潜在可行性。在考虑应用骨肽作为成骨活性功能食品添加剂的同时，系统评价了其是否具有抗原免疫性、胃肠消化稳定性、可运载性及靶向成骨活性功能。本发明的方法具有较好的预测和评价多肽的成骨生理活性的能力，可为指导今后利用畜禽骨胶原蛋白肽开发生物活性功能食品提供理论依据。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述步骤二中，建立并模拟机体胃部微环境模型的具体步骤包括：首先配置骨肽溶液，之后将骨肽溶液置于37℃恒温水环境中，然后调节骨肽溶液pH至2.0，再向其中加入胃蛋白酶，启动模拟体外胃部消化，同时磁力搅拌器搅拌，模拟胃部蠕动一段时间，最后取出部分消化液A作为样本，分析该骨肽在胃部的消化特性。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述步骤三中，建立并模拟机体肠部微环境模型的具体步骤包括：首先将步骤二中剩余的溶液的pH调节至7.5，之后按照酶与底物质量比1:50向其中加入胰液素，启动模拟体外肠道消化，同时磁力搅拌器搅拌，模拟肠部蠕动一段时间，最后取出部分消化液B作为样本，分析该骨肽在肠部的消化特性。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述步骤四中，建立并模拟机体Caco-2小肠上皮细胞单层膜吸收模型的具体步骤包括：
首先将Caco-2细胞细胞悬浮液，接种至培养小室，向培养小室顶侧AP加入细胞悬液，向培养小室底侧加入完全培养基，培养一段时间后，测定跨膜电阻值，以跨膜电阻值为参考指标，连续培养细胞12～15天直至跨膜电阻值达到最大值时，表明Caco-2小肠上皮细胞单层膜吸收模型构建成功。
Caco-2细胞单层膜模型构建成功后，进行骨肽的吸收转运试验：用HBSS缓冲液清洗细胞单层膜2次，分别向AP、BP两侧加入0.5mL、1.5mL含0.05％DMSO的HBSS缓冲液，然后于体积比5％CO2、95％空气和温度37℃恒温培养30min，然后除去缓冲液，向AP侧加入0.5mL10mM骨肽，BL侧加入1.5mL含0.05％DMSO的HBSS缓冲液，继续于体积比5％CO2、95％空气和温度37℃恒温培养；
其余组，在加入骨肽之前，首先向AP、BP侧分别加入0.5mL、1.5mL与细胞吸收转运相关通路促进剂和抑制剂：浓度为0.5μg/mL的细胞松弛素D、500nM的渥曼青霉素、25mM的Gly-Sar，以分析其吸收转运机制，同样培养30min后，除去缓冲液，再分别向AP侧加入0.5mL10mM骨肽溶液，向BP侧加入1.5mL含0.05％DMSO的HBSS缓冲液，2h后从BL侧取样100μL，放置-20℃保存用于检测。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，还包括对骨肽进行序列分析以获得其序列的步骤；
所述步骤一中，利用AlgPred在线数据库预测骨肽的潜在致敏性。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，胃蛋白酶与骨肽的质量比为1:50，胰液素与骨肽的质量比也为1:50。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述胃部微环境模型于胃部模拟容器8中进行，所述胃部模拟容器8包括外周壁801和与所述外周壁封闭连接的底部，底部可为玻璃或者其他材质，所述外周壁801由柔性材料制成，在所述外周壁801上相对的两侧设置有一对挤压部802a，802b，所述挤压部配置成通过同时对其进行压缩操作，而使所述外周壁801在其径向上扁平化，于所述外周壁801内沿其径向设置有复位弹簧803，所述复位弹簧803的两端对应于所述一对挤压部的位置处固定于所述外周壁801的内侧，其中，所述外周壁801在俯视观察下的形状呈椭圆形，所述一对挤压部802a，802b和复位弹簧803沿椭圆的长轴设置，且所述一对挤压部802a，802b和复位弹簧803位于所述胃部模拟容器8的下方，在竖直方向上距离所述底部的高度不超过所述胃部模拟容器总高度的1/3。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，步骤五中，基于Real-time qPCR和Westernblot方法分析所述骨肽对Wnt/β-catenin通路存在的影响，其中，Real-time qPCR中检测基因的引物包含如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的引物对，如SEQ ID NO：4和SEQID NO：5所示的引物对，SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：6所示的引物对，SEQ ID NO：8和SEQ IDNO：9所示的引物对，SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示的引物对，如SEQ ID NO：12和SEQID NO：13所示的引物对，SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15所示的引物对，SEQ ID NO：16和SEQID NO：17所示的引物对，SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19所示的引物对。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述一定耐受性是骨肽在胃部消化后仍存在完整的肽段。
本发明首次公开了通过生物信息学、胃肠道消化模型和Caco-2小肠上皮细胞吸收模型系统评价骨肽的抗原免疫性、胃肠稳定性、可运载性及靶向成骨活性的方法。此方法具有较好的预测和评价多肽的成骨生理活性的能力，可为指导今后利用畜禽骨胶原蛋白肽开发生物活性功能食品提供理论依据。
在本发明的其中一个实施例中，一种骨肽的成骨生理活性确证方法，包含以下主要步骤：
步骤一、利用生物信息学预测多肽的潜在致敏性，考查骨肽的抗原免疫性；
步骤二、建立并模拟机体胃部微环境模型，考查骨肽在胃部消化特性；
步骤三、建立并模拟机体肠部微环境模型，考查骨肽在肠部消化特性；
步骤四、建立并模拟机体Caco-2小肠上皮细胞单层膜吸收模型，分析骨肽在小肠上皮细胞的可运载特性；
步骤五、基于Real-time qPCR和Western blot技术考查骨肽对Wnt/β-catenin通路的影响。
本发明所述骨肽的成骨生理活性确证方法中，利用生物信息学预测多肽的潜在致敏性的方式为AlgPred在线数据库预测(http://crdd.osdd.net/raghava/algpred/submission.html)。
本发明所述骨肽的成骨生理活性确证方法中，建立并模拟机体胃部和肠部微环境模型为：准确称取骨肽(100mg)于100mL烧杯中，加入5mL超纯水均质搅拌配置成20mg/mL浓度的骨肽溶液，置于37℃恒温水浴锅，用2M HCl溶液调节其pH至2.0；加入胃蛋白酶(E/S为1:50)启动模拟体外胃部消化，磁力搅拌器搅拌(模拟胃部蠕动)2h后，取出部分消化液A备用。其余反应液，首先用0.5M NaHCO3溶液调节pH至5.3，然后用2MNaOH溶液调节pH至7.5；加入胰液素(E/S为1:50)启动模拟体外肠道消化，磁力搅拌器搅拌(模拟肠部蠕动)2h后，取出部分消化液B备用；上述所有操作重复试验3次。将收集消化液A、B分别经95℃恒温水浴加热10min灭酶，4℃、8000×g离心20min，上清液经冷冻干燥机冻干后保存于-20℃以备后续分析。
本发明所述骨肽的成骨生理活性确证方法中建立并模拟机体Caco-2小肠上皮细胞单层膜吸收模型为：将Caco-2细胞消化后制备成浓度为2×105cells/mL细胞悬浮液，接种至12孔培养小室，缓慢向培养小室顶侧AP(Apical side)加入500μL细胞悬液，细胞接种量1.5×105cells/insert，同时向培养小室BL(Basolateral side)侧缓慢加入完全培养基1.5mL。在Caco-2细胞接种后第三天更换AP、BL两侧培养基，以后每2天更换一次培养基，一周后每天更换培养基直至10-15天。注意，更换培养液时首先小心缓慢吸走培养小室BL侧培养液再快速移去AP侧培养液，加培养基时顺序先加AP侧后加BL侧。
使用Millicecll ERS-2型电阻仪对Caco-2细胞单层模型两侧电阻值进行测定，将电极较短的一端插入Transwell insert培养小室的内部(AP侧)，长端浸入外部(BL侧)，短端严禁触碰Caco-2细胞单层膜上生长的细胞，长端垂直于培养板底侧，确保电极平稳，待仪器示数稳定后准确记录电阻值。Caco-2细胞单层膜的跨膜电阻以单位膜面积跨膜电阻(Ω*cm2)表示：
Caco-2细胞跨膜电阻(Ω*cm2)＝(Ω1–Ω0)×0.3
其中，Ω1为有Caco-2细胞生长时的跨膜电阻值；Ω0为无Caco-2细胞生长时的空白电阻值；0.3为24孔Tanswell insert小室膜面积。
以跨膜电阻值为参考指标，测定不同天数(每2天测定一次，如1、3、5～～)电阻值并记录数据，保证模型构建成功，约12天。
步骤四中为了考查骨肽跨膜转运特性及机制，采用了不同的小分子物质转运通路抑制剂和促进剂，具体试验设计如下：
Caco-2细胞单层膜模型构建成功后，进行骨肽GP-12的吸收转运试验。用HBSS缓冲液清洗细胞单层膜2次，分别向AP、BP两侧加入0.5mL、1.5mL含0.05％DMSO的HBSS缓冲液，5％CO2、95％空气、37℃恒温培养箱(Stericycle CO2incubator,Thermo FisherScientificInc.,Waltham,MA)培养30min，除去缓冲液，向AP侧加入0.5mL 10mM骨肽GP-12溶液(含0.05％DMSO的HBSS缓冲液配制，下同)，BL侧加入1.5mL含0.05％DMSO的HBSS缓冲液，5％CO2、95％空气、37℃恒温培养箱培养。
其余组，在加入骨肽之前，向AP、BP侧分别加入0.5mL、1.5mL与细胞吸收转运相关通路促进剂和抑制剂：细胞松弛素D(细胞旁路吸收促进剂)、渥曼青霉素(内吞作用抑制剂)、Gly-Sar(PepT1载体底物)以考查其吸收转运机制。促进剂和抑制剂用含0.05％DMSO的HBSS缓冲液溶解，浓度分别为0.5μg/mL(细胞松弛素D)、500nM(渥曼青霉素)、25mM(Gly-Sar)。培养30min后，除去缓冲液，分别向AP侧加入0.5mL 10mM骨肽溶液，向BP侧加入1.5mL含0.05％DMSO的HBSS缓冲液，2h后从BL侧取样100μL，放置-20℃保存待测，上述所有操作重复试验3次。
优选的是，上述步骤二、步骤三和步骤四中经模拟胃肠道消化及Caco-2细胞单层膜转运试验后的溶液中多肽的组成、氨基酸序列及相应含量分析采用以下方法进行序列鉴定：
采用安捷伦HPLC1260-II系统(Agilent Technologies Inc.,California,USA)对骨肽经模拟胃肠道消化后组分含量进行测定。TSK gel G2000SWXL色谱柱(7.8×300mm,TOSOH,Tokyo,Japan)；流动相A为体积分数为0.1％的三氟乙酸水溶液，流动相B为体积分数为0.1％的三氟乙酸的乙腈溶液。骨肽模拟胃肠道消化后组分经反向毛细管色谱柱(Phenomenex,
Figure BDA0002177444840000101
10cm,5μm C18
Figure BDA0002177444840000102
USA)加载至高分辨率质谱仪(Thermo Q-Exactive,Thermo Scientific,USA)。质谱参数设置如下：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式，正离子模式；毛细管温度320℃，毛细管喷射电压为2kV。高分辨率MS/MS全扫描(m/z 300-2000Da)，10eV电子能量碰撞解离。基于Mascot 2.4search engine(Matrix Science,Boston,USA)进行Swiss-Prot数据库检索比对。
基于Real-time qPCR和Western blot技术考查骨肽对Wnt/β-catenin通路的影响具体操作步骤如下：
取适量细胞悬浊液于RNAase-free的1.5mL EP管中，按0.2mL/1.0mL TRIzol比例加入氯仿，强烈震荡20s，室温静置5min，4℃、12000×g离心15min，转移上层溶液至新的1.5mLEP管中；加入异丙醇0.5mL/1.0mL TRIzol，混匀后室温放置10min，4℃、10000×g离心10min；弃去上清，沉淀即为RNA，向沉淀中加入1mL75％乙醇(-20℃预冷)，4℃、10000×g离心8min，弃上清；震荡清洗沉淀后，4℃、10000×g离心3min，小心移除上清，注意不要将RNA沉淀移除；室温放置2-3分钟，晾干。加入100μL RNase-free水，充分溶解RNA，得到的RNA保存在-80℃备用。采用微量核酸蛋白测定仪测定RNA浓度并电泳测定其含量。取上述RNA样品，用RNase-free水将其浓度稀释至100ng/μL，按下表加样(总反应体积以10μL计)：
Figure BDA0002177444840000111
逆转录反应条件如下：37℃、15min；85℃、5s加热灭酶(逆转录酶)，反应结束后，将反转录获得的cDNA溶液稀释100倍，按下表配制反应液。反应体系如下：
Figure BDA0002177444840000112
在ABI 7500Fast上进行Real Time PCR反应，详细步骤如下表：
Figure BDA0002177444840000113
Figure BDA0002177444840000121
设计成骨细胞增殖和通路相关基因引物如下表：
Figure BDA0002177444840000122
取适量细胞悬浊液于试管EP管，加入300mL组织蛋白裂解液(已预先加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂)，冰上孵育30min，4℃、10000×g转速离心15min，移去上清至新EP管，置于-20℃保存备用。用BCA试剂盒测定不同样品蛋白浓度，已备后续使用。
准确配置30％丙烯酰胺溶液、电转液、2×SDS凝胶加样缓冲液、TBS缓冲液、10×电泳缓冲液、TBST缓冲液、封闭液、分离胶和浓缩胶备用。
SDS-PAGE电泳步骤如下：
Figure BDA0002177444840000123
Figure BDA0002177444840000131
转膜步骤如下：
Figure BDA0002177444840000132
Western blot步骤如下：
Figure BDA0002177444840000133
为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，现提供如下的实施例进行说明：
下面分离纯化后的骨肽GPAGPPGPIGNV(以下简称GP-12，SEQ ID NO:1)为研究对象
实施例1基于生物信息学考查骨肽GP-12的抗原免疫性
蛋白质和多肽往往具有一定的潜在毒性和致敏性，这给人类健康带来的诸多不利影响。统计数据显示，约8％的儿童和1.5％的成年人正遭受食物过敏的影响，而且这一频率仍在不断增加。已有研究表明，牛胶原蛋白可能存在过敏原，有引发过敏反应的风险。因此，本发明基于生物学信息数据库对骨肽GP-12潜在的致敏性进行了预测。预测结果表明，骨肽GP-12无潜在致敏性，这可能是由于GP-12片段位于牛骨胶原蛋白亲本中的非致敏原氨基酸(肽段)部位，因此在体外致敏性预测时未表现出抗原免疫性。
实施例2体外模拟胃肠道消化过程考查骨肽GP-12的胃肠稳定性
首先，准确称取骨肽GP-12(100mg)于100mL烧杯中，加入5mL超纯水均质搅拌配置成20mg/mL浓度的骨肽GP-12溶液，置于37℃恒温水浴锅，并用磁力搅拌器搅拌加速骨肽GP-12溶液受热均匀。用2M HCl溶液调节骨肽GP-12溶液的pH至2.0。然后加入胃蛋白酶(E/S为1:50)启动模拟体外胃部消化，如图1所示，磁力搅拌器搅拌(模拟胃部蠕动)2h后，取出部分消化液A分析其多肽组成及氨基酸序列。其余的胃部消化反应液，继续用0.5M NaHCO3溶液调节pH至5.3，然后再用2M NaOH溶液调节pH至7.5。最后加入胰液素(E/S为1:50)启动模拟体外肠道消化，磁力搅拌器搅拌(模拟肠部蠕动)2h后，取出部分消化液B备用；上述所有操作重复试验3次。将收集消化液A、B分别经95℃恒温水浴加热10min灭酶，4℃、8000×g离心20min，上清液经冷冻干燥机冻干后保存于-20℃以备后续多肽组成、含量及氨基酸序列分析测定。
本实施例立足于模拟机体胃肠道消化过程，通过利用磁力搅拌器模拟胃肠道蠕动，克服了传统模拟胃肠道消化用人工搅拌模拟胃肠蠕动的个体差异较大的缺点，从而保证试验的稳定性和重现性。本方法中，可辅助蠕动泵进行模拟消化液的传输，提高模拟系统的连贯性和高效性，可操作性较强、无需大量人力物力投入，可广泛应用于评价多肽及其他活性功能成分的胃肠稳定性，为抗骨质疏松活性功能健康食品的开发提供技术支撑。
实施例3模拟胃肠道消化后骨肽GP-12的胃肠稳定性结果分析
本发明所述骨肽在机体成骨生理活性确证方法中，为了探究骨肽GP-12是否在为肠道消化作用下失活，本文尝试构建了体外胃肠道消化模型，并分别对骨肽GP-12经胃、肠消化后的组分进行了鉴定考查。如图3所示，结果表明，骨肽GP-12经胃部消化后，仍以原有形态存在，未发生进一步酶解，骨肽GP-12对胃蛋白酶具有很强的耐受性。然而，骨肽GP-12经肠道消化后，一部分骨肽GP-12进一步水解为GPAGPPGPIGN(GP-11)和GPAGPPGPI(GP-9)，表明骨肽GP-12对肠道微环境有一定的耐受性，但能够被胰液素中某些蛋白酶水解，因此，有必要考查骨肽GP-12经胃肠道消化后组分变化及促成骨细胞增殖(成骨)活性。研究结果表明，骨肽GP-12经胃、肠道消化后组分促成骨细胞增殖活性较之于消化之前无显著差异(P>0.05)，因此，骨肽GP-12对胃-肠道消化具有一定的稳定性，可部分通过消化道且仍发挥成骨活性，完整肽段比例约占76.2％。
此外，分别收集实施例2中模拟胃、肠道消化后骨肽GP-12溶液组分经反向液相色谱法和液相色谱串联质谱法测定其多肽组成、含量及氨基酸序列。
尤其是发现，骨肽GP-12对胃蛋白酶具有很强的耐受性。
此外，还发现骨肽GP-12对肠道微环境有一定的耐受性，但能够被胰液素中某些蛋白酶水解为GPAGPPGPIGN(GP-11)和GPAGPPGPI(GP-9)两种短肽。
实施例4骨肽GP-12经Caco-2单层膜转运机制分析
Caco-2细胞表面有许多膜蛋白酶和膜肽酶，这些酶在细胞处于复杂生理状态下呈现不同的生物活性。为了探究骨肽GP-12经Caco-2细胞单层膜转运后稳定性，本发明构建了体外Caco-2细胞单层膜模型，如图2所示，培养小室8内，Caco-2细胞单层膜9构建完成后，在腔肠顶侧10(模拟小肠绒毛侧)即AP侧加入骨肽11，培养小室底部为多孔聚碳酸酯膜12，多孔聚碳酸酯膜的下侧为形成腔肠的基底侧13(BL侧)，并分别对骨肽GP-12经Caco-2细胞单层膜转运后(AP、BL)两侧多肽的组分进行了鉴定(图4)。结果表明，Caco-2细胞单层膜转运后AP侧的骨肽GP-12部分发生水解，水解为GPPGPIGNV(GV-9)、AGPPGPIGNV(AV-10)；BP侧检测到骨肽GP-12、GPPGPIGNV(GV-9)、AGPPGPIGNV(AV-10)三种肽组分。因此，完整的骨肽GP-12可以被转运到Caco-2细胞单层膜BL侧，即骨肽GP-12对小肠上皮细胞上刷状缘肽酶和上皮细胞内肽酶具有一定程度的耐受性，有潜力继续经血液转运至作用靶点发挥其生物活性。
关于小肽类物质转运机制，尚不十分明晰。目前，主流的研究报道包括以下三种转运机制：细胞旁路转运、胞吞作用转运以及小肽转运体Pep T1介导的转运(图5)。因此，本发明重点考查了以上三种转运通路，设计转运相关通路促进剂和抑制剂：细胞松弛素D(细胞旁路吸收促进剂)、渥曼青霉素(内吞作用抑制剂)、Gly-Sar(Pep T1载体底物)以考查其吸收转运机制。促进剂和抑制剂用含0.05％DMSO的HBSS缓冲液溶解，浓度分别为0.5μg/mL(细胞松弛素D)、500nM(渥曼青霉素)、25mM(Gly-Sar)。结果表明，经渥曼青霉素(内吞作用抑制剂)、Gly-Sar(Pep T1载体底物)处理后，骨肽GP-12的表观渗透系数(Apparentpermeability coefficient，Papp)变化较对照组不显著(P>0.05)；然而，经细胞松弛素D(细胞旁路吸收促进剂)处理后，Papp值显著高于处理前(P<0.05)，提示GP-12肽转运机制为细胞旁路转运，这种转运途径是一种与能量无关的被动扩散过程，已报道该途径参与多种小分子物质的运输。
尤其是发现，骨肽GP-12经Caco-2细胞单层膜转运后，大部分骨肽GP-12被Caco-2细胞表面的膜蛋白酶和膜肽酶水解，水解产物为GPPGPIGNV(GV-9)、AGPPGPIGNV(AV-11)，此外，BP侧也同时检测到骨肽GP-12、GPPGPIGNV(GV-9)、AGPPGPIGNV(AV-11)三种肽组分。综上，完整的骨肽GP-12可以被转运到Caco-2细胞单层膜BL侧，即骨肽GP-12对小肠上皮细胞上刷状缘肽酶和上皮细胞内肽酶具有一定程度的耐受性，有潜力继续经血液转运至作用靶点发挥其生物活性。
此外还发现，骨肽GP-12经细胞松弛素D(细胞旁路吸收促进剂)处理后，Papp值显著高于处理前(P<0.05)，提示GP-12肽很可能是通过细胞旁路转运(可运载性)，这种转运途径是一种与能量无关的被动扩散过程，已报道该途径参与多种小分子物质的运输。
实施例5骨肽GP-12促成骨细胞增殖活性机制分析
本发明所述骨肽在机体成骨生理活性确证方法中，为了探究骨肽GP-12成骨活性作用机制，考查了骨肽GP-12作用成骨细胞MC3T3-E1后细胞增殖相关基因和Wnt/β-catenin通路相关基因表达量的变化(图6)。结果表明，随着骨肽GP-12浓度增加，与成骨细胞MC3T3-E1增殖相关基因Cyclin D1、Oxterix、Runx2和Col I的表达量均呈上调趋势，且在骨肽GP-12浓度为0.05mg/mL时，基因表达量达到最大，分别为2.46、1.85、2.05和2.59倍对照组CN表达量。通路相关基因β-catenin、Freizzled-5、Wnt5a和GSK-3β呈相似趋势，骨肽GP-12浓度为0.05mg/mL时，基因表达量达到最大，分别为2.26、2.47、3.04和2.86倍对照组CN表达量。此外，经Wnt/β-catenin特异性通路抑制剂XAV-939处理后，上述各基因表达量上调趋势均得到抑制，提示骨肽GP-12促成骨细胞增殖作用(成骨活性)可能与激活Wnt/β-catenin信号通路有关。
为进一步验证骨肽GP-12通过调控Wnt/β-catenin信号通路发挥成骨活性，本发明对上述基因蛋白表达量进行的考查。骨肽GP-12促成骨细胞MC3T3-E1增殖相关基因和通路相关基因蛋白表达量结果见图6。结果表明，随着骨肽GP-12浓度增加，与成骨细胞MC3T3-E1增殖相关基因Cyclin D1、Oxterix、Runx2和Col I的蛋白表达量均呈上调趋势，且在GP-12肽浓度为0.05mg/mL时，蛋白表达量达到最大，分别为1.86、2.08、1.37和2.11倍对照组CN表达量。通路相关基因β-catenin、Freizzled-5、Wnt5a和GSK-3β呈相似趋势，GP-12肽浓度为0.05mg/mL时，蛋白表达量达到最大，分别为1.90、2.38、1.59和1.31倍对照组CN基因蛋白表达量。此外，经Wnt/β-catenin特异性通路抑制剂XAV-939处理后，上述各基因蛋白表达量上调趋势均得到逆转，提示骨肽GP-12促成骨细胞增殖作用(成骨活性)与激活Wnt/β-catenin信号通路密切有关。
尤其是发现，骨肽GP-12作用成骨细胞MC3T3-E1后，可显著提高细胞增殖相关基因和Wnt/β-catenin通路相关基因的蛋白表达量，且在Wnt/β-catenin特异性通路抑制剂XAV-939处理后，上述各基因蛋白表达量上调趋势均得到逆转，提示骨肽GP-12促成骨细胞增殖作用(成骨活性)与激活Wnt/β-catenin信号通路密切有关。
此外还发现，骨肽GP-12发挥促成骨细胞增殖(成骨)活性除直接作用于Wnt/β-catenin信号通路外，还可能由于骨肽GP-12与表皮生长因子受体结合(EGFR)，激活后的EGFR诱导下游β-catenin积累和跨细胞核转运至相应靶点发挥功能。骨肽GP-12可能是激活了EGFR通路和Wnt/β-catenin信号通路之间的交互作用信号(Crosstalk)，从而二者协同发挥成骨活性。
综上，本发明率先通过生物信息学、胃肠道消化模型、Caco-2小肠上皮细胞吸收模型，系统研究了骨肽体外致敏性、消化、吸收、转运及成骨活性作用机制确证方法，从而明确其抗原免疫性、胃肠稳定性、可运载性及靶向成骨活性。本发明的方法具有较好的预测和评价骨肽的成骨生理活性的能力，可为指导今后利用畜禽骨胶原蛋白肽开发生物活性功能食品提供理论依据。
这里说明的模块数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的骨肽的成骨生理活性确证方法的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
本发明公开了一种骨肽在机体成骨生理活性确证方法。本领域技术人员可以借鉴本发明内容，适当改进参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院农产品加工研究所
<120> 骨肽及其成骨生理活性确认方法与用途
<130> 2018
<160> 19
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 牛
<400> 1
Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Pro Ile Gly Asn Val
1 5 10
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gtactctgtg tggatcggtg g 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aacgcagctc agtaacagtc c 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
catttccaac ccaccctcca 20
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cagtccgggt cacacttga 19
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ctttcgtctg caactggctt 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
taaagcgctt ggaacagagc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ctctggcctt cctctctcag 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gtaggtaaag gtggctgggt 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
tggaaacccg aggtatgctt 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
cattgcattg cacgtcatcg 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tcatcattct ggccagtggt 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
agagcagaca gacagcactt 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gaagagaagg cgagtgaccg 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
aaggacagaa ctctgtggcg 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gcctgctttc ccaaccctat 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
cggctgccta tttgcatcac 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
agctctgatt ggccactgtc 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
tgggaaggag ggaggagatg 20

Claims (6)

1.一种骨肽的成骨生理活性确证方法，其特征在于，包括依次进行的如下步骤：
步骤一、利用生物信息学方法预测骨肽的潜在致敏性，分析骨肽的抗原免疫性；
步骤二、建立并模拟机体胃部微环境模型，分析骨肽在胃部消化特性；
步骤三、建立并模拟机体肠部微环境模型，分析骨肽在肠部消化特性；
步骤四、建立并模拟机体Caco-2小肠上皮细胞单层膜吸收模型，分析骨肽在小肠上皮细胞的可运载特性；
步骤五、基于Real-time qPCR和Western blot方法分析所述骨肽对Wnt/β-catenin通路存在的影响，其中，Real-time qPCR中检测基因的引物包含如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的引物对，如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的引物对，SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示的引物对，SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示的引物对，SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示的引物对，如SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的引物对，SEQ ID NO：14和SEQ IDNO：15所示的引物对，SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17所示的引物对，SEQ ID NO：18和SEQ IDNO：19所示的引物对；
若所述骨肽无抗原免疫性，且对胃肠部消化具有一定耐受性，可经过在小肠上皮细胞运载至作用靶点，且可激活机体内Wnt/β-catenin信号通路，则该骨肽能用于功能食品中；所述一定耐受性是骨肽在胃部消化后仍存在完整的肽段，且完整肽段所占比例应在20%及以上。
2.如权利要求1所述的骨肽的成骨生理活性确证方法，其特征在于，所述步骤二中，建立并模拟机体胃部微环境模型的具体步骤包括：首先配置骨肽溶液，之后将骨肽溶液置于37℃恒温水环境中，然后调节骨肽溶液pH至2.0，再向其中加入胃蛋白酶，启动模拟体外胃部消化，同时磁力搅拌器搅拌，模拟胃部蠕动一段时间，最后取出部分消化液A作为样本，分析该骨肽在胃部的消化特性。
3.如权利要求2所述的骨肽的成骨生理活性确证方法，其特征在于，所述步骤三中，建立并模拟机体肠部微环境模型的具体步骤包括：首先将步骤二中剩余的溶液的pH调节至7.5，之后按照酶与底物质量比1:50向其中加入胰液素，启动模拟体外肠道消化，同时磁力搅拌器搅拌，模拟肠部蠕动一段时间，最后取出部分消化液B作为样本，分析该骨肽在肠部的消化特性。
4.如权利要求1所述的骨肽的成骨生理活性确证方法，其特征在于，所述步骤四中，建立并模拟机体Caco-2小肠上皮细胞单层膜吸收模型的具体步骤包括：
首先将Caco-2细胞细胞悬浮液，接种至培养小室，向培养小室顶侧AP加入细胞悬液，向培养小室底侧加入完全培养基，培养一段时间后，测定跨膜电阻值，以跨膜电阻值为参考指标，连续培养细胞12~15天直至跨膜电阻值达到最大值时，表明Caco-2小肠上皮细胞单层膜吸收模型构建成功；
Caco-2细胞单层膜模型构建成功后，进行骨肽的吸收转运试验：用HBSS缓冲液清洗细胞单层膜2次，分别向AP、BP两侧加入0.5 mL、1.5 mL含0.05%DMSO的HBSS缓冲液，然后于体积比5% CO2、95%空气和温度37℃恒温培养30min，然后除去缓冲液，向AP侧加入0.5mL 10mM骨肽，BL侧加入1.5 mL 含0.05%DMSO的HBSS缓冲液，继续于体积比5% CO2、95% 空气和温度37℃恒温培养；
其余组，在加入骨肽之前，首先向AP、BP侧分别加入0.5 mL、1.5 mL与细胞吸收转运相关通路促进剂和抑制剂：浓度为0.5 μg/mL的细胞松弛素D、500 nM的渥曼青霉素、25 mM 的Gly-Sar，以分析其吸收转运机制，同样培养30 min后，除去缓冲液，再分别向AP侧加入0.5mL 10 mM骨肽溶液，向BP侧加入1.5 mL含0.05%DMSO的HBSS缓冲液，2 h后从BL侧取样100 μL，放置-20℃保存用于检测。
5.如权利要求1所述的骨肽的成骨生理活性确证方法，其特征在于，还包括对骨肽进行序列分析以获得其序列的步骤；
所述步骤一中，利用AlgPred在线数据库预测骨肽的潜在致敏性。
6.如权利要求3所述的骨肽的成骨生理活性确证方法，其特征在于，
步骤二中，胃蛋白酶与骨肽的质量比为1:50，
步骤三中，胰液素与骨肽的质量比也为1:50。
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