CN113373117B - 一种过表达miR-13474工程化外泌体及其制备方法与应用 - Google Patents

一种过表达miR-13474工程化外泌体及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种过表达miR‑13474工程化外泌体及其制备方法与应用。本发明基于RNA测序技术，筛选差异表达miRNA分子，验证锁定关键分子miR‑13474。发现miR‑13474可增强DFL和HUVEC细胞活性、增殖能力、迁移能力，并促进HUVEC细胞成小管能力。对糖尿病足（DFU）大鼠模型创面具有明显的修复作用。本发明通过电穿孔技术制备miR‑13474过表达工程化外泌体，制备方法效率高，技术可推广程度高且能迅速制备大量携载不同类型外源物质的外泌体，具有极高的应用价值。本发明为糖尿病足治疗提供新方案，为临床转化提供支撑。

Description

一种过表达miR-13474工程化外泌体及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种过表达miR-13474工程化外泌体及其制备方法与应用。
背景技术
糖尿病足部溃疡（DFU）是糖尿病最常见和最严重的并发症之一，其会导致足部循环和感觉障碍，致使截肢或合并全身严重感染而死亡。目前主要通过血糖控制、减轻患肢负重、局部外敷抗生素、清创术等方法治疗，传统方法虽有一定疗效，但尚不能妥善解决溃疡创面迁延不愈等问题。因此，积极探索 DFU治疗新方案具有重要科学意义与临床转化价值。
间充质干细胞（MSC）以其可塑性和强大旁分泌能力，在再生医学领域备受关注，成为治疗组织损伤和皮肤创面的有效手段。现有研究表明MSC 主要通过旁分泌参与组织损伤修复，而外泌体（exosomes，Ex）作为 MSC 发挥旁分泌作用的重要效应成分，能选择性地装载活性蛋白和 RNA 分子等生物活性分子，广泛参与细胞存活、血管新生、免疫调节等各种生物学过程。人脐带间质干细胞源外泌体可在﹣80℃保存，避免了MSC冻存复苏的不便，融解后即可使用，使用时间易于掌握。且与干细胞自身相比，外泌体具有生物相容性好、稳定性高、免疫原性低、可被工程化改造等特点与优势，成为组织损伤“非细胞治疗（cell-freetherapy）”的新策略。
外泌体携载的miRNAs在所有小 RNA 分子中所占比例高，因富集的 miRNA 不被高温、酸碱和酶所破坏而具有较好稳定性，在基因表达调控中具有广泛而重要的作用。但目前尚无有关miR-13474用于创面治疗领域的相关报道，更无miR-13474高表达的外泌体用于糖尿病足创面修复治疗领域的相关报道。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种过表达miR-13474工程化外泌体及其制备方法与应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
在本发明的一个方面，本发明提供了一种人脐带间充质干细胞源外泌体miR-13474，所述miR-13474的前体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其成熟编码序列如SEQ IDNO.2所示。
本发明还提供了外泌体miR-13474在制备用于治疗促进伤口愈合的药物中的用途。
进一步地，所述的外泌体miR-13474在制备用于治疗糖尿病足创面修复药物中的用途。
一种药物组合物，所述药物组合物中含有人脐带间充质干细胞源外泌体miR-13474以及药学上可接受的载体或佐剂。
在本发明的另一个方面，本发明还提供了一种工程化外泌体，所述的工程化外泌体中miR-13474 过表达分泌，并通过电穿孔途径富集。
进一步地，所述的工程化外泌体为人脐带间充质干细胞源外泌体。
进一步地，所述miR-13474的前体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其成熟编码序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种工程化外泌体的制备方法，其包括以下步骤：
将miR-13474和HucMSC-Ex充分混匀后加入到电极杯中，随后将电极杯放在电穿孔仪器的电极杯槽中进行电转，miR-13474进入HucMSC-Ex内得到过表达miR-13474的工程化外泌体。
进一步地，所述电穿孔仪器的参数为：穿孔电压110 V，穿孔电压持续时间3 ms，穿孔后静息时间10 ms，驱动电压25 V，驱动电压持续时间50 ms，驱动后静息时间50 ms，驱动循环次数10。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明基于RNA测序技术，筛选差异表达miRNA分子，验证锁定关键分子miR-13474。发现miR-13474可增强DFL和HUVEC细胞活性、增殖能力、迁移能力，并促进HUVEC细胞成小管能力。对糖尿病足（DFU）大鼠模型创面具有明显的修复作用。本发明通过电穿孔技术制备miR-13474过表达工程化外泌体，制备方法效率高，技术可推广程度高且能迅速制备大量携载不同类型外源物质的外泌体，具有极高的应用价值。本发明为糖尿病足治疗提供新方案，为临床转化提供支撑。
附图说明
图1是分离提取的HucMSC-Ex和HFL1-Ex的鉴定结果图；
图2是HucMSC-Ex中差异表达miRNA（miR-13474）分子的筛选图；
图3是qRT-PCR验证miRNA测序结果图；
图4是qRT-PCR检测miR-13474在多种细胞株中的表达图；
图5是CCK8实验检测DFL细胞转染的细胞活性改变图；
图6是细胞克隆形成实验检测DFL细胞及HUVEC细胞转染后的细胞增殖能力改变图；
图7是Transwell迁移实验检测DFL细胞及HUVEC细胞转染后的细胞迁移能力改变图；
图8是小管形成实验检测HUVEC细胞转染后细胞成管能力改变图；
图9是miR-13474过表达的工程化外泌体的制备流程图；
图10是miR-13474过表达工程化外泌体的荧光结果图；
图11是qRT-PCR检测的表达水平图；
图12是miR-13474过表达的外泌体对DFL细胞生物学功能的影响图；
图13是miR-13474过表达的外泌体对HUVEC细胞生物学功能的影响图；
图14是DFU模型的愈合图；
图15是HE切片局部对照图；
图16是各组皮肤组织切片染色图。
具体实施方式
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。除非特别指明，否则本发明中所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
本发明基于RNA测序技术对人脐带间充质干细胞源外泌体（HucMSC-Ex）及人胚肺成纤维细胞外泌体（HFL1-Ex）进行 miRNA 测序分析，筛选出一种两者表达差异显著的全新miRNA分子NC_000019.10_13474（后述miR-13474），其具有促进糖尿病足创面修复作用。考虑到外泌体具有天然的物质转运特性、相对较小的分子结构和优良的生物相容性等优势，其可作为治疗性分子的良好载体，本发明采用电穿孔技术制备一种工程化外泌体，其中miR-13474过表达分泌，经过工程化改造可进一步优化功能、增强对溃疡面的治疗效果，为转化打下基础。
试剂、仪器及耗材：胎牛血清购自于Excell公司、DMEM培养液购自于Gibco公司、α-MEM购自于Invitrogen公司、电穿孔仪器购自于日本BEX公司；超高分辨荧光显微镜购自于美国GE公司；DFL细胞、HUVEC细胞均购自中国科学院上海生命研究院细胞资源中心。Sprague Dawley大鼠（SD大鼠）来源于江苏大学动物中心；1链脲佐菌素（STZ）购自于美国Sigma公司；SABC免疫组化试剂盒(小鼠/兔IgG) 购自于美国Boster公司；CD31抗体购自于英国abcam公司；PCNA抗体购自于美国SAB公司；天狼星红染色试剂盒购自于上海翊圣生物公司。
实施例1：RNA测序筛选差异表达miRNA分子
（1）外泌体的提取与鉴定：取P3-P8代HucMSC培养至60%融合时，去除原有营养液，PBS充分洗涤2次，换成含有10%去除外泌体的胎牛血清（FBS）的营养液继续培养48 h。去除外泌体的胎牛血清的方法为将FBS用超高速离心机于4℃、1×105 g离心16 h去除底部褐色浓缩层。收集排除FBS外泌体污染的HucMSC培养上清进行HucMSC-Ex分离提取。方法简要叙述如下：
①用50 mL离心管将HucMSC培养上清于4 ℃、2×103 g离心30 min去除细胞碎片。
②将去除细胞碎片的上层液体转移至Beckman专用离心管中，用电子天平严格配平。在Beckman超速冷冻离心机中4 ℃、1×104 g离心30 min去除细胞器等杂质碎片。
③将去除细胞器等杂质碎片的上层液体转移至100 KD Millipore超滤管的柱子中，于4 ℃、2×103 g 离心30 min浓缩液体，吸取柱子中最底层的浓缩液（深红色液体），重复此过程直至柱子中无残留液体。
④将外泌体提取试剂与浓缩液按照1:5比例混匀，在4 ℃沉淀12 h以上。
⑤将沉淀后的浓缩液于4 ℃、2×103 g 离心30 min，可以看到白色的沉淀。除尽沉淀上方的液体，加入适量成品PBS溶解沉淀，即为HucMSC-Ex溶液。
⑥将提取好的HucMSC-Ex溶液通过0.22 μm滤器除菌后，分装存于-80℃冰箱备用，忌反复冻融。
⑦采用BCA试剂盒法对HucMSC-Ex进行蛋白质定量。
以HFL1-Ex作为对照组，采用上述相同提取方法进行HFL1-Ex的分离提取。采用透射电子显微镜、纳米颗粒分析仪和Western blot技术分别对HucMSC-Ex及对照外泌体HFL1-Ex的形态、粒径和表面标记蛋白进行鉴定。
图1是分离提取的HucMSC-Ex和HFL1-Ex的鉴定结果图；图中，A是透射电镜下HucMSC-Ex和HFL1-Ex形态图(标尺= 100 nm)，B是纳米颗粒分析仪检测HucMSC-Ex和HFL1-Ex粒径分布图，C是Western blot检测外泌体标记物CD9、CD63、CD81电泳图。由图1可见，HucMSC-Ex和HFL1-Ex在透射电镜下呈典型的杯状、盘状膜性囊泡样结构，其直径大约在100nm。粒径分析结果显示，HucMSC-Ex直径主要布在118 nm左右，HFL1-Ex直径主要分布在114nm左右，符合外泌体的粒径大小，而Western blot结果表明HucMSC-Ex和HFL1-Ex皆能表达外泌体标记物CD9、CD63和CD81。
（2）将获取的外泌体HucMSC-Ex和HFL1-Ex寄送至上海欧易生物公司进行外泌体内RNA 测序，得到的原始 reads 为 fastq 格式，使用 cutadapt 对接头序列进行去除。并进行序列的长度过滤，去掉序列长度小于 15 bp，以及序列长度大于 41 bp 的序列。使用fastx_toolkit (version 0.0.13) 软件，对序列进行 Q20 质控，保留 Q20 达到 80 % 及以上的序列。随后使用 NGSQCToolkit (version 2.3.2) 过滤掉含有 N 碱基的 reads。最终得到高质量的 clean reads 并用于后续分析。
对 clean reads 的长度分布进行统计，以初步评估样本的小 RNA 分布情况。根据物种的参考基因组序列，将 clean reads 比对到基因组，统计 reads 比对到基因组的百分比。使用 blastn 软件，对 clean reads 同 Rfam (version 10.0) 数据库进行比对，提取 E-value 小于等于 0.01 的结果，注释出 rRNA、snRNA、snoRNA、tRNA 等序列。最终将这些注释到 Rfam 数据库的序列进行过滤去除。并将能比对上转录本的序列且长度在小于15 bp 大于 41 bp 的 reads 进行去除。使用 RepeatMasker 软件，将过滤后的序列同repeat 数据库进行比对，鉴定可能的重复序列。未注释上的小 RNA 序列使用 Mirdeep2软件进行新的 miRNA 预测，并使用 RNAfold 软件预测新预测 miRNA 的二级结构。
根据鉴定的已知的成熟体 miRNA 以及新预测的 miRNA 的序列，进行表达量统计，miRNA 表达量计算采用 TPM (transcript per million) 计算度量指标，TPM = 每条miRNA 比对到的 read 数目 / 样本总比对 read 数目 x 106，TPM 含义是以每百万比配成对序列做 miRNA 表达量指标，其中总比配成对 read 数目用于归一化表达量数值。针对无生物学重复的样本，采用 Audic_Claverie公式计算Pvalue。并筛选出 Pvalue < 0.05、TMP 差异倍数 > 2 的 miRNA。针对有生物学重复的样本，采用 R 包中的 DEG 差异算法计算 p value，并筛选出 P value < 0.05 的 miRNA。
图2是HucMSC-Ex中差异表达miRNA（miR-13474）分子的筛选图；图中，A是HucMSC-Ex与HFL1-Ex中miRNA测序结果热图；B是筛选测序结果中HucMSC-Ex与HFL1-Ex差异表达miRNA代表；如图2所示，根据RNA测序结果，筛选出在HucMSC-Ex和HFL1-Ex中差异表达的miRNA分子有NC_000019.10_13474（miR-13474）、hsa-miR-615-3p、NC_000014.9_10228、hsa-miR-206及hsa-miR-328-3p，其中，miR-13474在HucMSC-Ex中富集，比HFL1-Ex中的表达丰度高了1740倍。进行qRT-PCR验证测序结果，图3是qRT-PCR验证miRNA测序结果图；(n =3，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001)；图3是qRT-PCR验证miRNA测序结果图；由图3、图4所示，miR-13474在HucMSC-Ex中富集，其表达量远高于HFL1-Ex；追溯外泌体的细胞来源发现miR-13474在HucMSC细胞中的表达也远高于HFL1、真皮成纤维细胞（DFL）、血管内皮细胞（HUVEC）、角质形成细胞（HACAT）、胃癌细胞株（BGC-823、HGC-27、MGC-803）等多种其他细胞类型。以上结果表明，miR-13474是HucMSC-Ex发挥修复作用的关键分子。
实施例2：miR-13474促进皮肤修复相关重要细胞的功能恢复
miR-13474作为全新的miRNA，其前体序列如SEQ ID NO.1所示，即：UGGUGGCGACUCAGAGCGGGCCGCUGCGUUAAGCCCGGAGGACGAGACGUGGGAGGUGCUGGAGGAGGCGCCGCCGCC，其成熟编码序列如SEQ ID NO.2所示，即：GCUGGAGGAGGCGCCGCCGCC。根据miR-13474的前体序列及成熟序列向苏州吉玛基因公司设计订购miR-13474模拟物（miR-13474 mimics）及抑制剂（miR-13474 inhibitor），人工合成片段序列信息见表1。
表1.人工合成片段序列
片段 序列（5’-3’）
mimics NC（双链） UUCUCCGAACGUGUCACGUTT
ACGUGACACGUUCGGAGAATT
miR-13474 mimics（双链） GCUGGAGGAGGCGCCGCCGCC
CGGCGGCGCCUCCUCCAGCUU
inhibitor NC（单链） CAGUACUUUUGUGUAGUACAA
miR-13474 inhibitor（单链） GGCGGCGGCGCCUCCUCCAGC
（1）模拟物与抑制物转染靶细胞：
①将上述各种人工合成片段按照吉玛公司说明书用去核酸酶水溶解，注意无菌操作；
②将1×105个细胞种到6孔板中，待细胞贴壁后，进行细胞转染；
③分别将脂质体转染试剂Lipofectamine 2000和各人工合成片段用无血清Opti-MEM培养基进行稀释，静置5 min；
④将稀释好的Lipofectamine 2000和稀释好的片段混匀，静置20 min，让脂质体包裹片段，在静置等待过程中将6孔板中旧营养液弃去，用PBS洗涤3次，换成无血清无双抗的单独Opti-MEM培养基；
⑤混匀加入6孔板中的细胞后，轻柔摇晃6孔板使其分布均匀；
⑥转染6 h后，将转染复合物弃去，用PBS洗涤3次，换成含10% FBS的常规细胞培养基；
⑦继续培养48 h后进行后续实验。
（2）细胞活力检测：参考CCK8试剂盒说明书，将DFL或HUVEC接种到5个96孔板中（2×103个/孔），待细胞贴壁后，加入不同处理，每组6个复孔。每天用含10% CCK-8试剂的100μL培养基更换一个96孔板中的旧培养基，同时在未接种细胞的空白孔中加入含10% CCK-8试剂的100μL培养基作为空白对照。37 ℃细胞培养箱放置2 h后，用酶标仪检测450 nm处的吸光度值，吸光度值越高代表细胞活性越强。连续监测5天，对数据进行统计学分析。图5是CCK8实验检测DFL细胞转染的细胞活性改变图(n = 6，***p < 0.001)；如图5可见，在DFL细胞中转染miR-13474 mimics和miR-13474inhibitor以后，连续5天对细胞活性进行检测，发现从第2天开始，mimics组细胞活性显著高于mimics NC组，而inhibitor组细胞活性显著低于inhibitor NC组。同样在靶细胞HUVEC细胞中转染miR-13474 mimics后其细胞活性显著高于mimics NC组，明显增强，而inhibitor组的细胞活性显著低于inhibitor NC组，细胞活性明显降低。
（3）细胞增殖能力检测：将2.5×103个DFL或HUVEC种到3.5 cm的细胞培养皿中，待细胞贴壁后加入不同处理。每3天更换新鲜的细胞培养基。10天后，将细胞在4％多聚甲醛中固定30 min，接着用结晶紫染色10 min，洗去未结合的染料。拍照并观察细胞集落的大小和数量。图6是细胞克隆形成实验检测DFL细胞及HUVEC细胞转染后的。
（4）细胞迁移能力检测：将DFL或HUVEC先种到6孔板中，接受不同处理，48 h后进行消化。将2×104个接受过不同处理的细胞重悬于200 μL无血清培养基，接种到Transwell迁移板的上室（孔径8μm），下室加入600 μL含10% FBS的培养基。37℃细胞培养箱放置16 h后，用4％多聚甲醛固定并用结晶紫染色溶液。用棉签轻轻擦去迁移小室上膜表面未穿过滤膜的细胞，并用PBS洗涤，于显微镜下拍照观察。图7是Transwell迁移实验检测DFL细胞及HUVEC细胞转染后的细胞迁移能力改变(标尺= 200μm)图；由图6、7可见，转染DFL细胞及HUVEC细胞后miR-13474 mimics组细胞增殖、迁移能力较mimics NC组有明显提高，而miR-13474inhibitor组细胞增殖、迁移能力较inhibitor NC组亦是明显下降。以上结果表明，过表达miR-13474分子能显著改善DFL细胞及HUVEC细胞的生物学功能。
（5）血管内皮细胞小管形成能力检测：将200μL 4 ℃预冷的液体基质胶用冷藏过的无菌移液器吸头接种到预冷的12孔板中，于37 ℃细胞培养箱放置20 min使基质胶凝固。将6.5×104个HUVEC（预先已经接种在6孔板中接受过不同处理）用含10% FBS的普通培养基重悬，种到已凝固的基质胶上，每组3个复孔。37 ℃细胞培养箱中放置12 h后，用显微镜观察小管形成情况并拍摄。
图8是小管形成实验检测HUVEC细胞转染后细胞成管能力改变图(标尺= 200μm)；由图8可见，HUVEC细胞中转染miR-13474 mimics，小管形成能力得到明显改善；而将miR-13474 inhibitor转染HUVEC细胞以后，小管形成能力明显减弱。
实施例3：miR-13474过表达工程化外泌体的制备
在本实施例中采用电穿孔技术制备miR-13474过表达工程化外泌体。图9是miR-13474过表达工程化外泌体的制备流程图；具体制备方法为：
（1）将FAM标记的FAM-miR-13474 mimics用PBS溶解为1 μg/μL，同时将DiI标记的HucMSC-Ex浓度稀释为20μg/μL；
（2）将5μL FAM-miR-13474 mimics溶液和45μL HucMSC-Ex溶液充分混匀后加入到电极杯中，随后将电极杯放在电穿孔仪器的电极杯槽中进行电转得到miR-13474过表达工程化外泌体。电穿孔仪器的参数为：穿孔电压（Pp V）：110 V，穿孔电压持续时间（Pp on）：3ms，穿孔后静息时间（Pp off）：10 ms，驱动电压（Pd V）：25 V，驱动电压持续时间（Pd on）：50 ms，驱动后静息时间（Pd off）：50 ms，驱动循环次数（Pd Cycle N）：10。
miR-13474过表达工程化外泌体与靶细胞DFL细胞共孵育12 h，随后在超高分辨荧光显微镜下观察荧光情况；将绿色荧光标记的FAM-miR-13474 mimics导入到预先用红色荧光膜染料标记的DiI-HucMSC-Ex中，随后将电转过的FAM-miR-13474 mimics-DiI-HucMSC-Ex与靶细胞进行共孵育。图10是miR-13474过表达工程化外泌体的荧光结果图；由图10可见，经超高分辨荧光显微镜下可以观察到：细胞核周围有大量点状红色荧光和绿色荧光；红色荧光和绿色荧光有重叠也有未重叠部分，重叠部分为HucMSC-Ex裹携着miR-13474mimics进入靶细胞，未重叠部分为HucMSC-Ex释放miR-13474 mimics到靶细胞。荧光显微镜拍摄图具象化并证实了电穿孔实验能制备过表达miR-13474的工程化外泌体。
用定量PCR检测miR-13474过表达工程化外泌体中miR-13474的表达水平(n =3，***p < 0.001)。图11是qRT-PCR检测的表达水平图；由图11可见，DFL细胞中构建的miR-13474过表达工程化外泌体相较于HucMSC-Ex的miR-13474含量显著升高。
实施例4：miR-13474过表达工程化外泌体对DFL和HUVEC生物学功能的影响
在本实施例中分别采用CCK8实验、细胞克隆形成实验、ranswell迁移实验检测miR-13474过表达工程化外泌体处理DFL细胞及HUVEC细胞96 h后的细胞活力、增殖、迁移能力。以及miR-13474过表达工程化外泌体对HUVEC细胞的小管形成能力进行测验。各实验均分为2组，分别为Ex-mimics NC组和Ex-miR-13474 mimics组。
图12是miR-13474过表达的外泌体对DFL细胞生物学功能的影响图；图中，A是CCK8实验的细胞活性图(n = 6，***p < 0.001)；B是细胞克隆形成实验的增殖能力图；C是Transwell迁移实验的迁移能力图(标尺= 200 μm)图；由图12可见，所构建过表达miR-13474的Ex-miR-13474 mimics组相较于对照组Ex-mimics NC，其对DFL细胞的活性、增殖能力和迁移性能具有更高的性能上的提升。图13是miR-13474过表达的外泌体对HUVEC细胞生物学功能的影响图；图中，A是CCK8实验处理96 h后HUVEC细胞的细胞活性图(n = 6，**p <0.01)；B是细胞克隆形成实验的增殖能力图；C是Transwell迁移实验的迁移能力图(标尺=100 μm)；D是小管形成实验的成管能力图(标尺= 200 μm)。如图13所示，构建的miR-13474过表达工程化外泌体对HUVEC细胞的增殖、迁移、小管形成能力均有较高的性能上的提升。
实施例5：miR-13474过表达工程化外泌体对糖尿病足创面修复的作用
建立T2DM大鼠DFU模型：将体重180 g左右的8周龄雄性SD大鼠用普通饲料喂养3天后换用45％高脂饲料连续喂养，5周后禁食过夜，经尾静脉注射STZ，3天后测量大鼠空腹血糖，将血糖≥ 16.7 mmol/L的大鼠视为糖尿病大鼠；糖尿病大鼠背部剔毛处理，腹腔注射10％水合氯醛溶液麻醉大鼠，在其背部进行全皮层切除，构建一个直径2 cm的圆形创口，得到DFU模型。
将DFU模型分为3组，分别为PBS损伤对照组、Ex-mimics NC组、Ex-miR-13474mimics组；每组至少6只，用胰岛素注射器将不同溶液在创口边缘分4点于皮下注射。一周以后再次进行注射治疗；每隔2-3天进行创口面积测量，每周进行麻醉后拍照。
图14是DFU模型的愈合图；如图14可见，在DFU修复的第7天起，Ex-mimics NC组和Ex-miR-13474 mimics组均能明显加快创面愈合，且Ex-miR-13474 mimics促进创面愈合的速度较Ex-mimics NC要略快些，到DFU修复的第20天，PBS组还留有较大的创口，而Ex-mimics NC组溃疡创面几乎已经完全愈合仅留微小的痂，即将脱落，而Ex-miR-13474mimics组创面已经完全愈合且痂也完全脱落。
通过HE切片全扫描结果观察创面愈合的整体情况，图15是HE切片局部对照图；图中箭头所指为创口边缘；如图15可见，PBS对照组创面表皮再生化未完成，且伴有大量血细胞和炎症细胞浸润，皮肤组织结构紊乱；Ex-mimics NC组表皮再生化完成，表皮较厚，皮肤组织结构层次清晰；Ex-miR-13474 mimics组表皮再生化完成，表皮较薄（在表皮再生化初期表皮因过度增殖是增厚的，而在表皮再生化后期表皮会变薄接近正常表皮厚度），皮肤组织结构层次清晰，并出现皮肤附属腺体和器官。
分别对各组进行皮肤组织切片的HE、PCNA免疫组化染色、天狼星红染色检测胶原分布及皮肤组织切片CD31免疫组化染色情况进行分析；观察miR-13474过表达工程化外泌体对DFU皮肤组织重构、细胞增殖、胶原合成及新血管形成的作用。图16是各组皮肤组织切片染色图，图中标尺= 100μm；由图16可见，HE切片局部图中可以清晰地观察到PBS组创面未愈合且伴有大量炎症细胞和血细胞浸润，而Ex-mimics NC组和Ex-miR-13474 mimics组有连贯完整的表皮和角质层覆盖于整个皮肤组织且未见炎症浸润及血痂，但Ex-miR-13474mimics组表皮更薄且出现了大量毛囊、腺体等皮肤附属器官。通过PCNA免疫组化分析，可以发现PBS组未见大量PCNA阳性细胞，而Ex-mimics NC组和Ex-miR-13474 mimics组PCNA阳性细胞比例高，且多集中于表皮基底层和真皮表皮连接处。皮肤胶原合成情况可通过天狼星红染色（Sirius Red）发现PBS组胶原合成较少且分布紊乱；Ex-mimics NC组胶原合成较多且呈波浪状分布；Ex-miR-13474 mimics组胶原合成已基本全部完成且呈波浪状、绳索状分布，最为接近正常皮肤组织的胶原分布。CD31免疫组化分析观察新血管形成情况，PBS组新生血管结构不完整，而Ex-mimics NC组和Ex-miR-13474 mimics组新生血管有完整的内腔结构、更加接近正常小血管结构。基于以上发现可以得出miR-13474过表达工程化外泌体具有更好促进糖尿病足创面修复的作用。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解，根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，而不背离如广泛描述的本发明的精神或范围。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
序列表
<110> 江苏大学
<120> 一种过表达miR-13474工程化外泌体及其制备方法与应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 78
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ugguggcgac ucagagcggg ccgcugcguu aagcccggag gacgagacgu gggaggugcu 60
ggaggaggcg ccgccgcc 78
<210> 2
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cuggaggagg cgccgccgcc 20

Claims (8)

1.一种人脐带间充质干细胞源外泌体来源的miR-13474，其特征在于，所述miR-13474的前体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其成熟编码序列如SEQ ID NO.2所示。
2.如权利要求1所述的人脐带间充质干细胞源外泌体来源的miR-13474、或包含所述miR-13474的组合物在制备用于糖尿病足创面修复药物中的用途。
3.一种用于糖尿病足创面修复的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中含有如权利要求1所述的人脐带间充质干细胞源外泌体来源的miR-13474以及药学上可接受的载体或佐剂。
4.一种用于糖尿病足创面修复的伤口护理产品，其特征在于，所述产品中含有如权利要求1所述的人脐带间充质干细胞源外泌体来源的miR-13474。
5.一种工程化外泌体，其特征在于，所述的工程化外泌体中miR-13474 过表达分泌；所述miR-13474的前体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其成熟编码序列如SEQ ID NO.2所示。
6.根据权利要求5所述的工程化外泌体，其特征在于，所述工程化外泌体为人脐带间充质干细胞源外泌体。
7.一种工程化外泌体的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：
将如权利要求1所述的miR-13474和HucMSC-Ex充分混匀后加入到电极杯中，随后将电极杯放在电穿孔仪器的电极杯槽中进行电转，miR-13474进入HucMSC-Ex内得到过表达miR-13474的工程化外泌体。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述电穿孔仪器的参数为：穿孔电压110 V，穿孔电压持续时间3 ms，穿孔后静息时间10 ms，驱动电压25 V，驱动电压持续时间50 ms，驱动后静息时间50 ms，驱动循环次数10。
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CN110193027A (zh) * 2019-05-08 2019-09-03 广州市番禺区中心医院(广州市番禺区人民医院、广州市番禺区心血管疾病研究所) 一种干细胞外泌体的制备方法及新应用
CN111437286A (zh) * 2020-04-20 2020-07-24 百澳瑞派（天津）生物科技有限公司 基因工程改造外泌体递送miRNA-146a在糖尿病足溃疡治疗方面的应用

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