CN110193027A - 一种干细胞外泌体的制备方法及新应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物制剂领域,具体涉及一种干细胞外泌体的制备方法及新应用。该方法包括间充质干细胞外泌体的提取、经动脉血管腔内成形联合干细胞外泌体移植的方法治疗糖尿病足的新应用。该外泌体新应用能准确、有效的改善糖尿病足的微循环,促进血管生成,重建毛细血管网,减少闭塞血管再狭窄,降低截肢率及提供生存率。
Description
技术领域
本发明涉及生物制剂领域,具体涉及一种干细胞外泌体的制备方法及新应用。
背景技术
近年来随着人口老龄化的加剧以及人们饮食结构的改变,糖尿病的发病率快速上升,由于糖尿病引发的下肢缺血性疾病(俗称“糖尿病足”)可导致截肢,甚至危及生命,有报道称,15%的糖尿病患者会出现糖尿病足,糖尿病足截肢率约25-50%,其截肢率是正常人的40倍,5年生存率约50%。因此糖尿病足越来越引起人们的关注。
糖尿病下肢血管病变是个复杂的病理生理过程,发病机制尚未完全阐明,其中多数研究支持糖尿病足是一种慢性低度炎症状态的假说。糖尿病患者并发末梢血管病变时,导致下肢持续反复感染,难愈性溃疡。目前对于糖尿病下肢血管病变还缺少有效的治疗方法,临床上一般采用药物、介入手术等方式治疗,但这些治疗手段都具有一定的局限性,尤其是下肢动脉流出道闭塞而且缺乏代偿性侧支形成,基本上无法找到合适的治疗手段使血管再通[1],患者只能选择截肢,不仅会严重影响患者的生活水平和质量,还会带来严重的心理创伤。所以寻找治疗糖尿病足切实可行,行之有效的新方法成为日益迫切的需要。
发明内容
本发明要解决的第一技术问题是提供一种临床级间充质干细胞外泌体的制备方法。
本发明为解决第一技术问题,所提供的具体技术方案为:
步骤一:从低温容器中取出间充质干细胞(MSC),迅速置于37℃水浴中连续晃动,1min内快速解冻;
步骤二:在无菌条件下,将完全解冻的细胞悬液转移至含有10ml无血清细胞培养基的离心管中;1500rpm离心5min,吸弃离心后上清;
步骤三:用培养基调整细胞接种密度为1.0×104个活细胞/cm2,将细胞悬液加入培养器皿中,轻轻摇晃使细胞均匀分布;观察细胞状态,隔天换液;
步骤四:在4℃下进行干细胞外泌体分离:2000g,10分钟,10,000g,20分钟;
步骤五:通过Beckman Coulter超速离心机以100,000g超速离心120分钟来分离干细胞外泌体;
步骤六:收集沉淀的干细胞外泌体,并重悬于无菌PBS中;
步骤七:随后通过蔗糖梯度离心进一步纯化干细胞外泌体,将干细胞外泌体在800ul HEPES中稀释,并通过1:1稀释与80%蔗糖混合,得到最终浓度为40%的蔗糖,将混合物置于4ml超速离心管的底部,小心的将1.6ml的30%蔗糖在HEPES中分层,然后在顶部加入下一层5%的蔗糖;
步骤八:将管移至SW60Ti转子并在100,000g下离心16小时;此后,收集12个等的级层,级层2至7含有纯化的外泌体;
步骤九:通过离心90分钟,100,000g洗涤外来体;反复多次提取1mg外泌体与10ml生理盐水充分混合,制备干细胞外泌体注射液备用。
所述步骤五中超速离心120分钟替换为超速离心90分钟。
本发明的第二目的是利用上述方法制备的干细胞外泌体在治疗糖尿病足中的应用。
上述具体体现为:
⑴经血管鞘给予全身肝素化后,置入0.035in(1in=0.0254m)泥锹导丝、导管达闭塞部位近端。
⑵常规先行患肢动脉全程造影,要求显示足部微循环最佳(造影剂总量18ml,速度4ml/mim)。根据术中显影情况,明确病变血管狭窄长度及病变程度(造影剂总量14ml,速度3ml/mim)。本速度及剂量可更好观察。
⑶动脉闭塞处行动脉血管腔内成形术,留置导管,可返回病房。随后应用微泵经导管靶向灌注已制备的干细胞外泌体注射液10ml,持续2小时。该方法强调可返回病房再使用微泵注入,不仅可减少辐射对外泌体的破坏,而且经微泵2小时持续注入可使外泌体与缺血部位有充分时间作用,调动体内内皮前体细胞迁移、增殖、分化。
另本发明提供一种干细胞外泌体的制备方法在下肢动脉粥样硬化、血栓闭塞性脉管炎中的应用。
本发明的有益效果:
本发明包括间充质干细胞外泌体的提取、经动脉血管腔内成形联合干细胞外泌体移植的方法治疗糖尿病足的新应用。该外泌体新应用能准确、有效的改善糖尿病足的微循环,促进血管生成,重建毛细血管网,减少闭塞血管再狭窄,降低截肢率及提供生存率。
采用脐血间充质干细胞外泌体联合动脉血管腔内成形术治疗糖尿病下肢血管病变能够借助介入手段打通移植通道,能够把脐血间充质干细胞外泌体运送到患肢的远端,在患肢血管末梢进行血管的再生,形成丰富的毛细血管网,进一步改善微循环;同时,干细胞外泌体可以对介入治疗过程中损伤的内皮细胞进行修复和动脉粥样斑块的形成,能够防止血管再狭窄,保证下肢缺血部位长期血量供应,加速血管网络的再生,达到改善和恢复下肢缺血并发症的目的。本发明公开了间充质干细胞来源的外泌体在制备治疗糖尿病足的药物中的应用。间充质干细胞来源的外泌体对糖尿病足中血管再生有明显作用,而且具有副作用低、效果更持久的优点。
附图说明
图1为本发明中的制备干细胞外泌体的流程图。
图2为本发明中干细胞外泌体在治疗糖尿病足中的应用流程图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
实施例1:
一种间充质干细胞外泌体的制备方法:从低温容器中取出间充质干细胞(MSC),迅速置于37℃水浴中连续晃动,1min内快速解冻;在无菌条件下,将完全解冻的细胞悬液转移至含有10ml无血清细胞培养基的离心管中;1500rpm离心5min,吸弃离心后上清;用培养基调整细胞接种密度为1.0×104个活细胞/cm2,将细胞悬液加入培养器皿中,轻轻摇晃使细胞均匀分布;观察细胞状态,隔天换液。
在4℃下进行干细胞外泌体分离:2000g,10分钟,10,000g,20分钟。最后,通过Beckman Coulter超速离心机以100,000g超速离心120分钟来分离干细胞外泌体。收集沉淀的干细胞外泌体,并重悬于无菌PBS中。随后通过蔗糖梯度离心进一步纯化干细胞外泌体。将干细胞外泌体在800ul HEPES中稀释,并通过1:1稀释与80%蔗糖混合,得到最终浓度为40%的蔗糖,将混合物置于4ml超速离心管的底部。小心地将1.6ml的30%蔗糖在HEPES中分层,然后在顶部加入下一层5%的蔗糖。将管移至SW60Ti转子并在100,000g下离心16小时。此后,收集12个相等的级层,级层2至7含有纯化的外泌体。通过离心(90分钟,100,000g)洗涤外来体。反复多次该方法,提取1mg外泌体与10ml生理盐水充分混合,制备干细胞外泌体注射液备用。根据实际需要可按此成分及比例配置不同规格干细胞外泌体注射液备用。
实施例2:
应用干细胞外泌体联合动脉血管腔内成形治疗糖尿病足的外泌体新应用
具体体现:
⑴经血管鞘给予全身肝素化后,置入0.035in(1in=0.0254m)泥锹导丝、导管达闭塞部位近端。
⑵常规先行患肢动脉全程造影,要求显示足部微循环最佳(造影剂总量18ml,速度4ml/mim)。根据术中显影情况,明确病变血管狭窄长度及病变程度(造影剂总量14ml,速度3ml/mim)。本速度及剂量可更好观察。
⑶动脉闭塞处行动脉血管腔内成形术,留置导管,可返回病房。随后应用微泵经导管靶向灌注已制备的干细胞外泌体注射液10ml,持续2小时。该方法强调可返回病房再使用微泵注入,不仅可减少辐射对外泌体的破坏,而且经微泵2小时持续注入可使外泌体与缺血部位有充分时间作用,调动体内内皮前体细胞迁移、增殖、分化。
本发明首先提出临床应用干细胞外泌体激活体内内皮前体细胞,外泌体包含了多种mRNA、miRNA、DNA片段、细胞因子和分子蛋白,通过细胞表面受体结合或是直接被细胞摄取而发挥作用,进而诱导体内内皮前体细胞激活及基因重组,传递细胞间信号,使体内内皮前体细胞迁移、增殖分化,从而形成血管内皮细胞,从而促进血管生成,改善糖尿病足缺血部位微循环。
本发明采用特定的方法将间充质干细胞的外泌体分离、提纯,保持外泌体高纯度,达到临床应用水平,可直接通过微泵连接静脉或病变血管,通过血管进入体内,避免停留时间过长导致外泌体裂解。微泵持续注入,使外泌体能长时间激活体内内皮前体细胞。
本发明采用间充质干细胞外泌体移植,因其不是细胞,并且经过高度纯化,无输血反应、溶血反应、病毒感染等的情况;不会导致微梗死、血栓性微血管病、肝静脉闭塞症等疾病;由于外泌体非干细胞,不会导致肿瘤的发生。
本发明采用脐带间充质干细胞超高速离心后提取外泌体,该外泌体相容性良好,有效成分稳定,酸碱度合适,相对患者不需创伤提取,注入后无排斥反应,且剂量可控,操作简单。
本发明该外泌体新应用针对糖尿病足血管病变复杂且闭塞严重的情况,采用动脉血管腔内成形术联合间充质干细胞外泌体移植的方法治疗糖尿病足,借助介入手段打通干细胞外泌体移植的通道,更加有利于缺血末端微循环的改善,保证间充质干细胞外泌体到达缺血部位,减少间充质干细胞外泌体在体内其他部位降解。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可做各种的改动与修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的。
Claims (4)
1.一种干细胞外泌体的制备方法,其特征在于:具体制备步骤为:
步骤一:从低温容器中取出间充质干细胞(MSC),迅速置于37℃水浴中连续晃动,1min内快速解冻;
步骤二:在无菌条件下,将完全解冻的细胞悬液转移至含有10ml无血清细胞培养基的离心管中;1500rpm离心5min,吸弃离心后上清;
步骤三:用培养基调整细胞接种密度为1.0×104个活细胞/cm2,将细胞悬液加入培养器皿中,轻轻摇晃使细胞均匀分布;观察细胞状态,隔天换液;
步骤四:在4℃下进行干细胞外泌体分离:2000g,10分钟,10,000g,20分钟;
步骤五:通过Beckman Coulter超速离心机以100,000g超速离心120分钟来分离干细胞外泌体;
步骤六:收集沉淀的干细胞外泌体,并重悬于无菌PBS中;
步骤七:随后通过蔗糖梯度离心进一步纯化干细胞外泌体,将干细胞外泌体在800ulHEPES中稀释,并通过1:1稀释与80%蔗糖混合,得到最终浓度为40%的蔗糖,将混合物置于4ml超速离心管的底部,小心的将1.6ml的30%蔗糖在HEPES中分层,然后在顶部加入下一层5%的蔗糖;
步骤八:将管移至SW60Ti转子并在100,000g下离心16小时;此后,收集12个等的级层,级层2至7含有纯化的外泌体;
步骤九:通过离心90分钟,100,000g洗涤外来体;反复多次提取1mg外泌体与10ml生理盐水充分混合,制备干细胞外泌体注射液备用。
2.根据权利要求1所要求的干细胞外泌体的制备方法,其特征在于:所述步骤五中超速离心120分钟替换为超速离心90分钟。
3.一种应用权利要求1所述的干细胞外泌体的制备方法在治疗糖尿病足中的应用。
4.一种应用权利要求1所述的干细胞外泌体的制备方法在下肢动脉粥样硬化、血栓闭塞性脉管炎中的应用。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20190903 |