CN117838657A - 一种基于红细胞膜的抗炎药物载药纳米颗粒系统 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于红细胞膜的抗炎药物载药纳米颗粒系统，通过将红细胞膜与抗炎药物吡格列酮通过挤出器挤压形成负载吡格列酮的纳米颗粒，作为脱细胞瓣膜的修饰物，能够高效诱导巨噬细胞向抗炎/促进再生的M2表型转化，显著促进材料原位再生，解决现有的脱细胞瓣膜DHV植入后容易引起严重的免疫反应，影响循环血液中干细胞的迁移和分化，再细胞化困难，导致材料退变，影响治疗效果的问题，具有良好的临床应用前景。

Description

一种基于红细胞膜的抗炎药物载药纳米颗粒系统
技术领域：
本发明涉及生物医用材料领域，尤其涉及一种基于红细胞膜的抗炎药物载药纳米颗粒系统。
背景技术：
目前临床上常用的瓣膜替代物主要为机械瓣和生物瓣。机械瓣耐久性好，但有引起血栓的风险，需要终身服用华法林等抗凝药物；生物瓣虽无需终身服药，但易发生钙化衰败，使用年限仅为15年左右。为解决上述问题，开发组织工程心脏瓣膜(Tissue-engineering Heart Valves,TEHVs)作为新的瓣膜替代物是目前研究的重点。
脱细胞瓣膜(Decellularized Heart Valve,DHV)由天然瓣膜经脱细胞处理得来，是目前TEHVs构建的主要支架材料，然而其应用存在许多局限性。DHV植入后通常引起严重的免疫反应，影响循环血液中干细胞的迁移和分化，再细胞化困难，进而导致材料退变。能否减轻DHV引起的免疫反应决定其能否良好的再细胞化，进而决定其植入体内后的组织重塑和血液相容性，因此对DHV进行修饰以减轻瓣膜材料的免疫反应，是TEHV构建的重点。
吡格列酮是噻唑烷二酮类抗糖尿病药物，属于胰岛素增敏剂，研究表明吡格列酮也有抗炎作用，可促进巨噬细胞向M2亚型极化，减轻炎症反应。因此构建负载吡格列酮的纳米颗粒可能促进巨噬细胞向M2亚型极化，发挥抗炎作用。
发明内容：
(一)解决的技术问题
针对目前脱细胞瓣膜DHV存在的缺陷，本发明提供一种基于红细胞膜的抗炎药物载药纳米颗粒系统，能够高效诱导巨噬细胞向抗炎/促进再生的M2表型转化，显著促进材料原位再生，解决现有的脱细胞瓣膜DHV植入后容易引起严重的免疫反应，影响循环血液中干细胞的迁移和分化，再细胞化困难，导致材料退变，影响治疗效果的问题。
(二)技术方案
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种基于红细胞膜的抗炎药物载药纳米颗粒系统，所述纳米颗粒的外壳采用红细胞膜，所述红细胞膜由全血离心获得的红细胞经低渗破膜获得，所述红细胞膜与抗炎药物吡格列酮通过挤出器挤压形成负载吡格列酮的纳米颗粒。
红细胞膜(Red Blood Cell Membrane,RBCM)由红细胞经低渗破膜后分离得来，目前广泛应用于纳米药物递送系统中。与传统高分子药物递送相比，RBCM存在如下优势：(1)长循环稳定性；(2)良好的生物相容性，无细胞毒性。RBCM的长循环稳定性可减少其被巨噬细胞的吞噬，延长负载药物的有效作用时间。吡格列酮是噻唑烷二酮类抗糖尿病药物，属于胰岛素增敏剂，研究表明吡格列酮也有抗炎作用，可促进巨噬细胞向M2亚型极化，减轻炎症反应。将吡格列酮包裹入RBCM中，构建纳米颗粒，修饰于脱细胞瓣膜表面，可发挥促进巨噬细胞向M2表型极化的作用，减轻炎症反应。
本发明还提出了一种基于红细胞膜的抗炎药物载药纳米颗粒系统的制备方法，包括以下步骤：
S1，获取红细胞膜RBCM；
S2，红细胞膜RBCM用PBS重悬得到悬液；
S3，将悬液分别通过10um和5um的滤网顺序挤压，得到RBCM囊泡；
S4，将所得溶液在4℃下以4000g离心10min；
S5，取30ug的红细胞膜RBCM颗粒和10ug的吡格列酮混合在1mlPBS缓冲液中，通过200nm滤网过滤，并将所得滤液在4℃下以25000g离心1min，获得纳米颗粒；
S6，将沉淀的纳米粒子重悬于一定体积的PBS溶液中，-80℃保存。
制备完成后可以采用透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope,TEM)观察红细胞膜RBCM颗粒状态。
上述获取红细胞膜RBCM的方法为低渗破膜法，取血后将全血1600rpm离心15min，将沉淀用无菌生理盐水洗3次，获得纯净红细胞悬液；然后采用配制的红细胞低渗破膜液进行破膜，按照红细胞悬液：破膜液＝1:30的体积比混合，于4℃缓慢搅拌30min，1500rpm离心10min除去沉淀，将上清以12000rpm离心5min，获得白色沉淀即为红细胞膜，用破膜液洗涤3次后，保存于-80℃。
红细胞低渗破膜液的配方为0.0186g EDTA·Na2；0.896g Na2HPO4·12H2O，150μLPMSF(100mM)，超纯水500mL。
本发明还提供一种基于红细胞膜的抗炎药物载药纳米颗粒系统在制备组织工程心脏瓣膜中的应用，所述纳米颗粒用于修饰于脱细胞瓣膜表面，作为组织工程心脏瓣膜的支架材料的修饰物，可显著降低巨噬细胞分泌的促炎因子，并高表达抑炎细胞因子，促进巨噬细胞由M1向M2极化，有效减轻心脏瓣膜植入后的炎症反应，促进材料再生。
此外，本发明提供的一种基于红细胞膜的抗炎药物载药纳米颗粒系统还可以在制备体内植入支架修饰物中进行应用，有效抑制各种植入类器械植入后的免疫炎症反应。
(三)有益效果
本发明产生的有益效果是：
本发明以体内数量最多的红细胞为原料，提取纯净的红细胞膜构建抗炎药物载药纳米颗粒系统，具备原料易得、构建操作简便的优点，本发明构建的纳米颗粒载药系统能够高效诱导巨噬细胞向抗炎/促进再生的M2表型转化，显著促进材料原位再生，有效降低组织工程心脏瓣膜植入后的免疫反应，且不仅可以修饰脱细胞瓣膜，还可通过不同的方法修饰多种植入性医疗器械，以达到减轻植入后炎症反应、提升耐久度的目的，具有良好的临床应用前景。
附图说明：
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为红细胞膜RBCM傅里叶红外光谱图；
图2为红细胞膜RBCM蛋白分析图；
图3为红细胞膜RBCMzeta电位图；
图4为红细胞膜RBCM粒径分析图；
图5为纳米颗粒TEM照片图；
图6为炎症因子芯片热图；
图7为纳米颗粒细胞毒性分析图；
图8为皮下包埋免疫荧光图；
具体实施方式：
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到的。
下述实施例中使用的各种细胞及实验动物：
人脐静脉内皮细胞HUVEC、人单核细胞系THP-1由美国模式培养物集存库提供，SD大鼠由北京维通利华有限公司购买得到。
实施例1：红细胞膜RBCM的获取
(1)SD大鼠取血
取未经处理，体重300g左右的雄性SD大鼠，异氟烷气体吸入麻醉，仰卧于操作板上，以胶布固定四肢。用备皮刀进行颈部备皮，碘伏消毒皮肤后，沿颈部正中纵行剪开皮肤，用显微镊分离皮肤及筋膜，小心游离气管旁的颈总动脉，用10mL注射器抽取1mL ACD抗凝液，接静脉留置针，排净注射器及留置针内空气，丝线结扎远心端后，行颈总动脉插管，抽血过程中注意血液应与抗凝液充分混合，抽取9mL全血备用。
(2)红细胞破膜获取红细胞膜
全血1600rpm离心15min，将沉淀用无菌生理盐水洗3次，获得纯净红细胞悬液，按照下表配制红细胞低渗破膜液：
表1红细胞破膜液配方
总体积 500mL
EDTA·Na2 0.0186g
Na2HPO4·12H2O 0.896g
PMSF(100mM) 150μL
超纯水 定容至500mL
注：调节破膜液pH＝8.0
按照红细胞悬液：破膜液＝1:30的体积比混合，于4℃缓慢搅拌30min，1500rpm离心10min除去沉淀，将上清以12000rpm离心5min，获得白色沉淀即为红细胞膜RBCM，用破膜液洗涤3次后，保存于-80℃环境。
实施例2
对所制备的红细胞膜进行物理性质及化学成分的检测，具体操作如下：
(1)傅里叶红外光谱检测
将红细胞膜RBCM悬液于-80℃冰箱冷冻2h，而后取出置于真空冻干机内冻干48h，得到固态红细胞膜RBCM；取10mg红细胞膜RBCM于压片机上压实，而后置于傅里叶红外光谱仪上测量红外吸收光谱。
(2)纳米颗粒跟踪分析测量RBCM粒径
将红细胞膜RBCM沉淀用超纯水重悬，充分吹打混匀后，置于超声细胞破碎仪下超声分散10min，而后于NTA中测量红细胞膜的粒径。
(3)RBCM zeta电位检测
取1mL 10mg/mL红细胞膜RBCM悬液加入动态光散射仪专用比色皿中，于动态光散射仪中测量zeta电位。
(4)SDS-Page凝胶电泳及考马斯亮蓝染色
使用金斯瑞SDS-Page预制胶分离红细胞膜RBCM蛋白。按照上样缓冲液：RBCM悬液＝1:4的比例混合制样，然后向预制胶每孔中加入30μL样品，最靠边的孔中加入3μL蛋白marker，向电泳槽添加电泳液，160V电泳30min，取出预制胶，参照marker位置截取凝胶，而后行考马斯亮蓝染色30min，倒去染色液，用超纯水多次漂洗至背景无杂质后拍照观察蛋白条带分布。
实验结果发现，红外光谱显示了RBCM中的特征性基团。C-H的伸缩于3420cm-1产生吸收峰，C＝O的振动于1645cm-1处产生特异性吸收峰，P＝O键和P-O-C基团的吸收峰分别位于1231cm-1和1054cm-1处，表明RBCM中含有磷脂，为细胞膜成分(见图1)；考马斯亮蓝结果40kDa-55kDa处出现三个条带，第一条位于约47kDa处，与红细胞膜表面CD47分子量一致(见图2)；红细胞膜RBCM的zeta电位图、峰值集中在-50mV左右，表明红细胞膜的zeta电位为负值(见图3)；NTA结果图中150-200nm处出现单峰，表明红细胞膜的颗粒大小位于150-200nm之间(见图4)。
实施例3：
制备负载抗炎药物吡格列酮的纳米颗粒载药系统，具体步骤如下：
(1)将红细胞膜RBCM用PBS重悬，得到悬液；
(2)将悬液分别通过10um和5um的滤网顺序挤压，得到红细胞膜RBCM囊泡；
(3)将上述步骤所得溶液在4℃下以4000g离心10min；
(4)取30ug的红细胞膜RBCM颗粒和10ug的吡格列酮混合在1mlPBS缓冲液中，通过200nm滤网过滤，并将所得滤液在4℃下以25000g离心1min。
(5)最后将沉淀的纳米粒子重悬于一定体积的PBS溶液中，-80℃保存。
(6)透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope,TEM)观察RBCM颗粒；取10μL悬液滴加在透射电镜铜网正面，在37℃温箱中缓慢干燥后，置于透射电镜中观察RBCM颗粒的形态并拍照。
TEM对负载吡格列酮的纳米颗粒进行拍照，结果显示RBCM纳米颗粒的大小约为200nm(见图5)。
实施例4：验证纳米颗粒的抗炎效果
利用人单核细胞系THP-1探究纳米颗粒对巨噬细胞极化的影响。具体操作如下：
(1)RPMI-1640完全培养基复苏THP-1细胞，每48h换液，对数生长期时利用含佛波酯100ng/ml的培养基刺激细胞72h以诱导形成巨噬细胞；
(2)用细胞刮轻轻刮下细胞，PBS重悬后调整细胞密度为3×105/mL，6孔板中每孔加入1mL细胞悬液；
(3)待细胞贴壁后用含LPS100ng/mL+IFN-γ20ng/mL的培养基刺激24h，之后用DMEM完全培养基换液，每孔加入10μg纳米颗粒共培养24h，之后利用细胞炎症因子芯片检测巨噬细胞炎症因子表达情况。
结果显示，负载吡格列酮的纳米颗粒可显著降低巨噬细胞分泌的促炎因子，并高表达抑炎细胞因子，证明负载吡格列酮的纳米颗粒可促进巨噬细胞由M1向M2极化(见图6)。
实施例5：纳米颗粒的细胞毒性分析
为验证负载吡格列酮的纳米颗粒的细胞相容性，利用人脐静脉内皮细胞系与含纳米粒子的培养基共培养，再以正常培养基作为对照，具体操作如下：
(1)细胞培养：使用DMEM完全培养基复苏HUVECs，接种于6cm直径的培养皿中，于37℃，5％CO2培养箱内培养，24h后换液，之后每48h换液；
(2)细胞接种：当培养皿内细胞汇合度约为90％时，吸去皿内培养基，无菌PBS漂洗3次后1mL胰酶消化3min，收集细胞悬液并离心，用培养基重悬，调整细胞密度为5×104/mL。向96孔板中加入含有HUVEC的细胞悬液，每孔加入200μL细胞悬液，轻轻上下摇动培养板以混匀细胞。接种后每天换液，并用无菌PBS漂洗；
(3)CCK-8检测：在接种细胞后1、3、5、7d，吸去旧培养基，用无菌PBS洗3次，每孔加入含10％CCK-8检测液的无血清培养基200μL，于37℃培养箱内孵育1h，用酶标仪测量450nm吸光度；
实验结果表明本发明构建的负载吡格列酮的纳米颗粒无明显细胞毒性，不会抑制细胞生长(见图7)。
实施例6：利用材料皮下包埋后大鼠尾静脉静脉注射模型验证纳米颗粒体内诱导巨噬细胞极化的能力
皮下包埋手术方法：
(1)取体重80-100g雄性SD大鼠，使用异氟烷作为麻醉气体，于小动物麻醉机下吸入麻醉，将大鼠背部用备皮刀备皮，俯卧位固定于操作板上，医用胶带固定四肢。使用0.5％活力碘消毒皮肤3次；
(2)使用无菌纱布铺巾，暴露手术区域；
(3)沿背部中线用剪刀做一切口，用血管钳进行钝性分离，使皮肤及肌肉组织间形成一口袋样空间；
(4)将脱细胞瓣膜小心置于皮下口袋中，瓣膜应尽量置于深处，离皮肤切口1cm以上，尽量保证平整，避免折叠；
(5)以8-0聚氨酯缝线将瓣膜四个角固定于背部肌肉上，随后用5-0带针缝合线单纯间断缝合皮肤切口，缝合后再次用活力碘消毒；
(6)将大鼠随机分为两组，一组每天尾静脉注射10μg/kg体重纳米颗粒悬液，另一组每天注射等量生理盐水；
(7)7d、14d、28d后取出包埋的瓣膜，4％多聚甲醛固定后进行免疫荧光切片染色。利用iNOS标记M1型巨噬细胞，利用CD206标记M2型巨噬细胞，观察巨噬细胞的表型变化。
实验结果显示，注射纳米颗粒组包埋7天时即以M2亚型巨噬细胞为主，随时间进展M1亚型巨噬细胞逐渐减少直至消失；而对照组7天仍存在大量M1型巨噬细胞(见图8)，提示本发明构建的纳米颗粒可有效减轻植入后的炎症反应，促进材料再生。
综上所述，本发明提供一种基于红细胞膜的抗炎药物载药纳米颗粒系统，能够高效诱导巨噬细胞向抗炎/促进再生的M2表型转化，显著促进材料原位再生，解决现有的脱细胞瓣膜DHV植入后容易引起严重的免疫反应，影响循环血液中干细胞的迁移和分化，再细胞化困难，导致材料退变，影响治疗效果的问题。
最后需要说明的是，以上实施例仅用于说明本发明而非限制本发明的保护范围。另外，在阅读了本发明的技术内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动、修改或变型，所有的这些等价形式同样属于本申请所要求限定的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种基于红细胞膜的抗炎药物载药纳米颗粒系统，其特征在于，所述纳米颗粒的外壳采用红细胞膜，所述红细胞膜由全血离心获得的红细胞经低渗破膜获得，所述红细胞膜与抗炎药物吡格列酮通过挤出器挤压形成负载吡格列酮的纳米颗粒。
2.权利要求1所述的一种基于红细胞膜的抗炎药物载药纳米颗粒系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，获取红细胞膜RBCM；
S2，红细胞膜RBCM用PBS重悬得到悬液；
S3，将悬液分别通过10um和5um的滤网顺序挤压，得到红细胞膜RBCM囊泡；
S4，将所得溶液在4℃下以4000g离心10min；
S5，取30ug的红细胞膜RBCM颗粒和10ug的吡格列酮混合在1mlPBS缓冲液中，使用滤网过滤，并将所得滤液在4℃下以25000g离心1min，获得纳米颗粒；
S6，将沉淀的所述纳米颗粒重悬于一定体积的PBS溶液中，-80℃保存。
3.根据权利要求2所述的一种基于红细胞膜的抗炎药物载药纳米颗粒系统的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中获取所述红细胞膜RBCM的方法为低渗破膜法，具体为：取血后将全血1600rpm离心15min，将所得沉淀用无菌生理盐水洗3次，获得纯净红细胞悬液；然后采用配制的红细胞低渗破膜液进行破膜，按照红细胞悬液：破膜液＝1:30的体积比混合，于4℃缓慢搅拌30min，1500rpm离心10min除去沉淀，将上清以12000rpm离心5min，获得白色沉淀即为红细胞膜，用破膜液洗涤3次后，保存于-80℃。
4.根据权利要求3所述的一种基于红细胞膜的抗炎药物载药纳米颗粒系统的制备方法，其特征在于，所述红细胞低渗破膜液的配方为0.0186gEDTA·Na2；0.896g Na2HPO4·12H2O，150μL PMSF(100mM)，超纯水500mL。
5.权利要求1所述的一种基于红细胞膜的抗炎药物载药纳米颗粒系统的应用，其特征在于，所述纳米颗粒用于修饰于脱细胞瓣膜表面，作为组织工程心脏瓣膜的支架材料的修饰物，可显著降低巨噬细胞分泌的促炎因子，并高表达抑炎细胞因子，促进巨噬细胞由M1向M2极化，有效减轻心脏瓣膜植入后的炎症反应，促进材料再生。
6.根据权利要求2所述的一种基于红细胞膜的抗炎药物载药纳米颗粒系统的制备方法，其特征在于，所述滤网的孔径为200nm。
7.权利要求1中所述的一种基于红细胞膜的抗炎药物载药纳米颗粒系统在制备体内植入支架修饰物中的应用。
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